專利名稱：具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法
具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法本申請是申請日為2007年12月21日、發(fā)明名稱為“具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物和用于產(chǎn)生該植物的方法”的中國專利申請200780049885. 2 (國際申請?zhí)朠CT/EP2007/064510)的分案申請。本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并涉及增強植物中多種具有經(jīng)濟重要性的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)量增強蛋白(Yield EnhancingProtein, YEP)的核酸在植物中的表達(dá)來增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。所述YEP選自液泡加工酶(Yacuolar Processing_Enzyme, VPE) >CCA1樣多肽、SAP樣多肽、種子產(chǎn)量增強 因子I (Seed Yield Promoting Factor I, SYPFI)多妝和核酮糖-1，5_ 二憐酸羧化酶/加氧酶(guBis￡0)活化酶(activase) (RCA)多肽。本發(fā)明還涉及已調(diào)節(jié)了編碼如YEP之核酸的表達(dá)的植物，所述植物具有相對于對照植物而言增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供可用于實施本發(fā)明方法的迄今未知的YEP編碼核酸，以及包含所述核酸的構(gòu)建體。持續(xù)增長的世界人口和農(nóng)業(yè)用可耕地供應(yīng)萎縮刺激了有關(guān)增加農(nóng)業(yè)效率的研究。常規(guī)的作物及園藝學(xué)改良手段利用選擇育種技術(shù)來鑒定具有受歡迎特性的植物。然而，此類選擇育種技術(shù)具有幾個缺陷，即這些技術(shù)一般耗費很多勞動并且產(chǎn)生這樣的植物，其經(jīng)常含有異源性遺傳組分，這可能不總是導(dǎo)致從親代植物中傳遞的所希望性狀。分子生物學(xué)進(jìn)展已經(jīng)允許人類改良動物及植物的種質(zhì)。植物的遺傳工程使得可以分離和操作遺傳物質(zhì)(一般處于DNA或RNA形式)并且隨后引入該遺傳物質(zhì)至植物中。此類技術(shù)具有產(chǎn)生具備多種經(jīng)濟學(xué)、農(nóng)學(xué)或園藝學(xué)改良性狀的作物或植物的能力。具有特殊經(jīng)濟意義的性狀是增加的產(chǎn)量。產(chǎn)量通常定義為作物產(chǎn)生的可測量的經(jīng)濟價值。這可以就數(shù)量和/或品質(zhì)方面進(jìn)行定義。產(chǎn)量直接取決于幾個因素，例如器官的數(shù)目和大小、植物構(gòu)造(例如枝的數(shù)目)、種子產(chǎn)生、葉衰老等。根發(fā)育、養(yǎng)分?jǐn)z入量、脅迫耐性和早期萌發(fā)勢(early vigor)也可以是決定產(chǎn)量的重要因素。因此，優(yōu)化前述因素可以對增加作物產(chǎn)量有貢獻(xiàn)。種子產(chǎn)量是特別重要的性狀，這是因為許多植物的種子對于人類和動物營養(yǎng)而言至關(guān)重要。諸如玉米、稻、小麥、蕓苔(canola)和大豆等作物占人類總卡路里攝取量的一半以上，不論是通過種子本身的直接消耗，還是通過由加工的種子所飼養(yǎng)的肉類產(chǎn)品的消耗。它們也是工業(yè)加工所用的糖類、油類和多類代謝物的來源。種子含有胚(新的枝條和根的來源)和胚乳(發(fā)芽和幼苗早期生長過程中胚生長的營養(yǎng)源)。種子的發(fā)育涉及許多基因，并且需要代謝物自根、葉和莖轉(zhuǎn)移至正在生長的種子。特別是胚乳，同化糖類、油類和蛋白質(zhì)的代謝前體，將其合成為貯存性高分子，以充盈谷粒。植物生物量為飼料作物如苜蓿、青貯谷物和干草的產(chǎn)量。在谷物作物中使用產(chǎn)量的許多替代參數(shù)。其中首要的是估算植物大小。根據(jù)物種以及發(fā)育階段的不同，可以通過許多方法測量植物大小，但是包括植物總干重、地上干重、地上鮮重、葉面積、莖體積、植物高度、蓮座植物直徑、葉長、根長、根生物量、分蘗數(shù)和葉數(shù)。許多物種在給定的發(fā)育階段維持植物不同部分大小間的保守比。利用這些異速生長關(guān)系而對這些有關(guān)大小的測量結(jié)果進(jìn)行由此及彼的外推(如Tittonell等2005 Agric Ecosys&Environ 105 :213)。早期發(fā)育階段的植物大小通常將與晚期發(fā)育階段的植物大小有關(guān)。具有更大葉面積的較大植物通常能夠比較小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在同期增重更多(Fasoula&TolIenaar2005 Maydica50 :39)。除了植物所具有的最初達(dá)到較大大小的微環(huán)境或遺傳優(yōu)勢的潛在延續(xù)，此為其附加效應(yīng)。植物大小和生長速率存在著強遺傳組分(如ter Steege等2005Plant Physiology 139 :1078),且迄今為止,種種多樣化基因型植物在一種環(huán)境條件下的大小很可能與另一種環(huán)境條件下的大小有關(guān)(Hittalmani等2003 Theoretical AppliedGenetics 107 :679)。以這種方式，使用標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境作為田地中作物在不同時間和地點所遭遇的多樣化動態(tài)環(huán)境的替代參數(shù)。收獲指數(shù)為種子產(chǎn)量與地上干重的比值，其在許多環(huán)境條件下相對穩(wěn)定，因此在植物大小和谷物產(chǎn)量之間通常能夠獲得比較穩(wěn)固的相關(guān)性(如Rebetzke等2002 CropScience 42:739)。這些方法固有地聯(lián)系在一起，因為大多數(shù)谷物生物量取決于植物葉和莖當(dāng)前或忙存的光合作用生產(chǎn)力(Gardener等1985 Physiology of Crop Plants. Iowa State University Press, pp68_73)。因此,對植物大小的選擇,甚至是在發(fā)育早期階段的選擇，已經(jīng)用作為未來潛在產(chǎn)量的指標(biāo)(如Tittonell等2005 Agric Ecosys&Environ105 213)。當(dāng)測試遺傳差異對脅迫耐性的影響時，溫室或植物培養(yǎng)室與田地相比具有固有的優(yōu)勢即能夠使土壤性能、溫度、水和營養(yǎng)的可用性以及光強度標(biāo)準(zhǔn)化。不過，因缺乏風(fēng)力或昆蟲導(dǎo)致不良授粉，或由于空間不足以讓成熟根或冠層生長等等，對產(chǎn)量造成的這些人工局限性會限制這些控制環(huán)境在測試產(chǎn)量差異中的應(yīng)用。因此，在培養(yǎng)室或溫室標(biāo)準(zhǔn)條件下測量早期發(fā)育階段的植物大小，是提供潛在遺傳產(chǎn)量優(yōu)勢指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)方法。對許多作物而言具有經(jīng)濟重要性的另一'丨生狀是早期萌發(fā)勢(early vigour)。提高早期萌發(fā)勢是溫帶及熱帶稻栽培種的現(xiàn)代稻育種計劃中一個重要的目標(biāo)。長的根對于水栽稻正確的土壤錨著是很重要的。在將稻直接播種到澇田里以及植物必須迅速從水中長出時，更長的根與萌發(fā)勢相關(guān)。在進(jìn)行條播(drill-seeding)時,更長的中胚軸和胚芽鞘對于良好的出苗是很重要的。早期萌發(fā)勢還來自于提高的植物適應(yīng)性，例如由于植物更好地適應(yīng)其環(huán)境(即更能應(yīng)對多種非生物或生物脅迫因素)。具有早期萌發(fā)勢的植物還顯示出更好的作物建立(作物以更均一的方式生長，即大部分植株基本同時達(dá)到各個發(fā)育階段)，并顯示更好的生長，并經(jīng)常顯示更高的產(chǎn)量。在植物中改造出早期萌發(fā)勢的能力在農(nóng)業(yè)中會極為重要，例如提高植物種子產(chǎn)量的能力，無論是通過種子數(shù)、種子生物量、種子發(fā)育、種子充盈度(seed filling)或者任何其他種子相關(guān)性狀。除了在農(nóng)業(yè)中的許多應(yīng)用(包括產(chǎn)生觀賞植物、造林、園藝和林業(yè))以夕卜，增強產(chǎn)量相關(guān)性狀還將具有許多非農(nóng)業(yè)用途，例如利用生物技術(shù)生產(chǎn)物質(zhì)，如藥物、抗體或疫苗。提高產(chǎn)量還可用于產(chǎn)生用于生物反應(yīng)器(用于利用生物技術(shù)生產(chǎn)物質(zhì)，如藥物、抗體或疫苗，或者用于有機廢物的生物轉(zhuǎn)化)和其他這些領(lǐng)域的藻類。意想不到的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)量增強蛋白(YEP)的核酸在植物中的表達(dá)賦予植物相對于對照植物而言增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，所述YEP選自液泡加工酶(VPE) XCAl樣多肽、SAP樣多肽、種子產(chǎn)量增強因子I(SYPFl)多肽和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶(RuBisCO activase, RCA)多妝。
背景技術(shù)：
I.液泡加工酶(VPE)液泡加工酶(VPE)是半胱氨酸蛋白酶，其切割天冬酰胺和天冬氨酸C端一側(cè)的肽鍵。VPE最初是作為負(fù)責(zé)種子貯藏蛋白成熟的新的半胱氨酸蛋白酶發(fā)現(xiàn)的。擬南芥屬(Arabidopsis)含有四種 VPE 基因(a VPE, P VPE、Y VPE 和 S VPE)。Hara-Nishimura 等，Current Opinion in Plant Biology2005，8 :404_408。在高等植物中，多種液泡蛋白的前蛋白(proprotein)前體通過VPE的作用在翻譯后轉(zhuǎn)變成其各自的成熟形式。首先對蓖麻子VPE報道了該酶的分子結(jié)構(gòu)。已在植物(大豆、刀豆、擬南芥屬、野豌豆(vetch)和柑橘)和動物(曼森血吸蟲(Schistosoma mansoni)、人和小鼠)中發(fā)現(xiàn)了 VPE同源物。VPE前體由信號肽、N端前肽、成熟VPE結(jié)構(gòu)域和C端前 肽構(gòu)成。表達(dá)蓖麻子VPE前體的酵母(釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))轉(zhuǎn)化體在其液泡中積累成熟形式。成熟蛋白具有液泡加工活性，相反，前體無活性。對無活性突變體進(jìn)行的分析提示，VPE前蛋白前體向活性形式的轉(zhuǎn)化可能是通過自催化介導(dǎo)的。(Hiraiwa等.FEBS Letters 447，1999，213-216 頁)。程序性細(xì)胞死亡(PCD)在動物和植物中在多種脅迫和發(fā)育階段中發(fā)生。VPE被鑒定為植物PCD的執(zhí)行者。VPE顯示與胱天蛋白酶(介導(dǎo)動物中PCD途徑的半胱氨酸蛋白酶)相似的酶特性，盡管這兩種酶之間的序列同一性有限。具報道，VPE具有胱天蛋白酶-I活性(Hatsugai等，SCIENCE卷3058. 62004)。VPE與胱天蛋白酶-I共有一些結(jié)構(gòu)特性催化二聯(lián)體和形成底物口袋(Asp 口袋)的三個氨基酸在VPE和胱天蛋白酶-I之間是保守的。與這些相似性相反，VPE位于液泡中，而胱天蛋白酶位于細(xì)胞溶膠中。VPE通過在發(fā)病機制和發(fā)育中破壞液泡而發(fā)揮植物P⑶關(guān)鍵分子的功能。Hatsugai等，Apoptosis 2006 ；11 905-911。據(jù)報道，VPE Y (VPEg)在衰老(PCD的一種形式)中被誘導(dǎo)(參閱Rojo等，2004，Current Biology,第 14 卷，1897-1906 頁)。II. CCAlMYB蛋白是在植物中發(fā)育過程和防御應(yīng)答中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的一個轉(zhuǎn)錄因子超家族。表達(dá)分析顯示，大多數(shù)擬南芥屬MYB基因的表達(dá)應(yīng)答于一種或多種類型的激素和脅迫處理(Yanhui等，Plant Mol. Biol 60，107-124，2006)。對擬南芥和稻中該超家族成員進(jìn)行的系統(tǒng)發(fā)生比較提示，擬南芥屬MYB超家族在其與單子葉植物分離后但未與其他雙子葉植物分離前發(fā)生了快速擴展(Yanhui等，2006)。MYB蛋白一般包含結(jié)構(gòu)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域——MYB結(jié)構(gòu)域。它們參與細(xì)胞周期、分生組織形成的調(diào)節(jié)、細(xì)胞分化的控制，還參與調(diào)節(jié)次生代謝。MYB結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子構(gòu)成了植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一(擬南芥(Arabidopsis thaliana)中至少為130種)，但在MYB結(jié)構(gòu)域以外幾乎沒有保守性。因此,基于在MYB編碼區(qū)以外鑒定的保守基序?qū)⑺鼈儦w類成亞組(Jiang等(2004)Genome Biology5 :R46)。不同類別的MYB蛋白可基于其所包含MYB結(jié)構(gòu)域中不完全重復(fù)的數(shù)目來鑒別，并歸為三個家族R2R3-MYB家族、R1R2R3-MYB家族和MYB相關(guān)家族。R2R3-MYB家族包含最多的MYB蛋白數(shù)，并分成5個亞家族(Yanhui等2006) =CCAl樣、CPC樣、TBP樣、I盒結(jié)合樣和R-R型MYB蛋白。其中，CCAl樣亞家族是最大的，該亞家族的成員在MYB重復(fù)中含有保守性基序 SHAQK 或 MYADN。在高等生物中，晝夜節(jié)律鐘控制多種生理和分子過程。在植物中，這些過程包括葉移動、氣孔打開和大量基因的表達(dá)。在擬南芥中，已經(jīng)鑒定了大量時鐘相關(guān)蛋白組分。其中，相信CCAl (晝夜節(jié)律鐘相關(guān)I (CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED I)) /LHY (晚期延伸的下胚軸(LATE ELONGATED HYPOCOTYL))和 TOCl (CAB 表達(dá)計時 I (TIMING OF CAB EXPRESSIONI))是中央振蕩器的關(guān)鍵組分。CCAl和LHY是同源且部分冗余的Myb相關(guān)DNA結(jié)合蛋白，而TOCl是名為假應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(PSEUDO-RESPONSE RE⑶LAT0R)的小蛋白家族的成員。還認(rèn)為這兩種不同類別的時鐘組分在轉(zhuǎn)錄/翻譯水平形成了產(chǎn)生固有節(jié)律的自主調(diào)節(jié)正/負(fù)反饋環(huán)(Nakamichi 等，Plant Cell Physiol. 46，686-689，2005)。有報道稱 CCAl (晝夜節(jié)律鐘相關(guān)I (CIRCADIAN CLOCK-ASSOCIATED I))基因在擬南芥屬植物中的組成型表達(dá)(CCAl_ox)導(dǎo)致喪失了晝夜節(jié)律性(Green 等，Plant Physiol. 129，576-584，2002)。這些 CCAI-ox 植物保留了應(yīng)答于光照的晝夜改變的能力。因此，如果在晝夜條件下培養(yǎng)CCAl-ox植物，則多種受晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的基因以及CCAl本身和密切相關(guān)的LHY的轉(zhuǎn)錄水平強烈振蕩。然而，與預(yù)計發(fā)生光照/黑暗轉(zhuǎn)化而發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平改變的野生型植物相反，CCAl-ox植物喪失了預(yù)計其環(huán)境中這種每日改變的能力。與其野生型對應(yīng)體相比，CCAl-ox植物開花更晚(特別是在長日照條件下)，并且在非常短日照條件下的生存力更低。此外，已證明另外兩種晝夜節(jié)律突變體LHY-ox和elf3具有低生存力表型。 W02003013228和US2004019927描述了過表達(dá)CCAl的植物抽薹很晚，顯示提高的生物量(提高的葉數(shù)目和大小)，并且營養(yǎng)組織和生殖組織的綠色更深。提出CCAl可用于提高葉綠素含量，從而可以在低光照條件下有更高的生長和生產(chǎn)力。此外，還描述了 CCAl用于防止開花的用途可幫助實現(xiàn)最高的營養(yǎng)產(chǎn)量，并防止經(jīng)遺傳修飾的生物(GMO)的花粉逃逸(US2004045049)。目前，沒有報道顯示提高的CCAl表達(dá)導(dǎo)致提高的種子產(chǎn)量，相反，與其野生型對應(yīng)體相比，CCAl過表達(dá)者開花更晚(特別是在長日照條件下)，并且在極短日照條件下的生存力更低。(Green等,2002)。III. SAPSAP結(jié)構(gòu)域(根據(jù)SAF-A/B、Acinus和PIAS命名)是形成螺旋-延伸-螺旋結(jié)構(gòu)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。已在酵母、哺乳動物和植物中鑒定出了含有SAP結(jié)構(gòu)域(也稱為SAF盒)的蛋白質(zhì)。SAP結(jié)構(gòu)域由35個氨基酸殘基構(gòu)成，包含由含有甘氨酸的區(qū)域隔開的兩個兩親性螺旋。該結(jié)構(gòu)域中的一些位置富含帶正電的氨基酸(R、K)，它們被認(rèn)為是與DNA主鏈接觸的。據(jù)報道稱SAP結(jié)構(gòu)域形成螺旋-延伸-螺旋(helix-extended_helix,HEH)結(jié)構(gòu),一些原核生物蛋白(如轉(zhuǎn)錄終止子RHO蛋白)也預(yù)計含有SAP結(jié)構(gòu)域。Chen等，2003 (PlantMolecular Biology 52:579-590)報道稱，已將含有SAP結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與多種功能相關(guān)聯(lián)，所述功能與其DNA和/或RNA相互作用有關(guān)。已將SAP蛋白與核構(gòu)造和/或RNA代謝相關(guān)聯(lián)。例如，人支架附著因子A(SAF-A)是核支架(核基質(zhì))中的豐富組分，并且還存在于不均一核的核糖核蛋白復(fù)合體中，該復(fù)合體已與核組織和RNA加工相關(guān)聯(lián)。Acinus是一種被胱天蛋白酶-3激活的蛋白質(zhì)，是凋亡染色質(zhì)凝聚所需的。結(jié)合了 SAP結(jié)構(gòu)域和MIZ鋅指基序的PIAS蛋白家族成員是活化STAT (信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄激活蛋白)的蛋白抑制劑。酵母Tholp蛋白(另一種含有SAP的蛋白質(zhì))在調(diào)節(jié)RNA聚合酶II的轉(zhuǎn)錄延伸中發(fā)揮作用。Chen等，2003描述了稻基因0sBP-73的克隆和表征，其編碼含有SAP樣結(jié)構(gòu)域的375個氨基酸的蛋白質(zhì)。該作者報道稱，Northern印跡分析證明，0sBP-73在根、葉和未成熟種子中微弱表達(dá)。他們還通過組織化學(xué)研究檢查了帶有OsBP-73 5_/CTS報告基因的轉(zhuǎn)基因稻植物中OsBP-73基因的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)該報告基因主要在具有高細(xì)胞分裂活性的組織(如根尖、莖結(jié)、圓錐花序和未成熟種子)中表達(dá)。他們還報告稱，通過雙鏈RNA對OsBP-73基因表達(dá)進(jìn)行的遺傳干擾抑制了完整植物的生長，但不影響從年幼至成年階段的這一段。他們提出，OsBP-73可能在細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。IV. SYPFlSYPFl是可用于增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的新轉(zhuǎn)錄因子。轉(zhuǎn)錄因子一般定義為顯示序列特異性DNA結(jié)合并能激活和/或抑制轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)。擬南芥屬基因組編碼至少1533種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子，占其估計基因總數(shù)的約5. 9%。據(jù)報道，這些轉(zhuǎn)錄因子中約45 %來自于植物特異性家族(Riechmann等,2000 (Science卷290,2105-2109))。根據(jù)PRODOM數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)SYPFl與腫瘤相關(guān)的At4gl8650 ；TGAlbzip激活劑卷曲 螺旋具有一定的相似性。Miao 等，1994 (Plant Mol Biol. Apr 25(1) :1-11)報道稱，TGAla是可能介導(dǎo)一些植物基因的根特異性表達(dá)和生長素應(yīng)答性表達(dá)的已充分表征的轉(zhuǎn)錄因子。V.核酮糖-1，5- 二磷酸羧化酶/加氧酶(RubisCO)活化酶(RCA)多肽核酮糖-1,5- 二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCo, EC 4. I. I. 39 [EC])是地球上最豐富的酶，并且是最重要的酶之一。它催化光合碳固定中的第一步和限速步驟——核酮糖-1，5- 二磷酸與CO2不可逆羧化形成兩個3-磷酸甘油酸分子。然而，該反應(yīng)的速率極低，RuBisCo必須被活化和氨甲?；跃哂写呋芰Α；罨ㄟ^RuBisCo活化酶(RCA)來實現(xiàn)，其可從RuBisCo的催化位點上除去抑制劑，改變構(gòu)象并以ATP依賴性方式體內(nèi)活化RuBisCo (Andrews 等，1995)。RCA是核編碼的葉綠體蛋白，基于序列和結(jié)構(gòu)同源性，它是AAA+家族(與不同細(xì)胞活性相關(guān)的ATP酶)的成員，該家族的成員參與發(fā)揮多種伴侶分子樣功能的大分子復(fù)合體。與RCA的ATP酶活性一致，在RCA多肽序列中鑒定到了用于核苷酸結(jié)合的P環(huán)(或WalkerA ;Walker 等，(1982) EMBO J. 1982 ；1 :945-951)三磷酸結(jié)合環(huán)共有序列 GXXXGK (S/T)。還鑒定了 RCA與RubisCo相互作用及RuBisCo活化所需的一些其他關(guān)鍵氨基酸殘基(綜述參閱Portis (2003)Photosynthesis Research 75:11-27)。RCA在多數(shù)植物中包括兩種同工型，45_46kDa(或a型)和41_43kDa(或P型)，它們通過選擇性剪接來自于單個基因(綜述參閱Portis (2003) Photosynthesis Research75:11-27)。這兩種形式僅在羧基端不同，較長的形式包含參與光依賴性氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)(由硫氧還蛋白_f介導(dǎo))的兩個半胱氨酸殘基。與多數(shù)植物不同，在綠藻萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中發(fā)現(xiàn)了一種多肽(無羧基端延伸)，它在該多肽的氨基端也包含葉綠體轉(zhuǎn)運妝(Roesler&Ogren (1990) Plant Physiol94 (4) :1837-1841)。缺少RCA活性的突變體擬南芥植物(稱為rca-;SomerviIIe等(1982)PlantPhysiol 70 =381-387)或者RCA活性水平極低的轉(zhuǎn)基因植物無法在大氣CO2水平下存活(Flaveria bidentis ；von Caemmerer 等(2005)Plant Physiol 137(2) :747-55),表達(dá)水平降低的那些則顯示降低的光合作用速率和生長(在擬南芥屬中，Eckhardt等(1997)Plant Physiol 113 :575-586 ;在煙草中，Mate 等(1996)Planta 198:604-613)。然而，在正常溫度下，RCA活性的大幅降低是顯著實現(xiàn)穩(wěn)態(tài)光合作用之前所需要的(例如擬南芥、稻(Jin 等(2006) Ann Bot (Lond) 97 (5) :739-44)、煙草(He 等(1997) Plant Physiol 115(4)1569-80 ;Hammond 等(1998)Plant J 14:101-110)。
用a RCA同工型(突變的a RCA同工型(參與氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)的兩個Cys殘基突變成Ala殘基)、P RCA同工型或者這兩種同工型轉(zhuǎn)化缺少RCA的擬南芥突變體(rca_)回復(fù)了植物在正常CO2水平下生長的能力(Zhang等(2002)PNAS USA 99(5) :3330-3334)。僅表達(dá)P RCA同工型(因此不受光依賴性氧化還原調(diào)節(jié))或者僅表達(dá)突變的a RCA同工型(氧化還原敏感性)的植物不能在光照有限的條件下下調(diào)RuBisCo。專利申請US2006/0272044涉及(通過基因改組)獲得編碼活性增強的RCA多肽的分離的多核苷酸序列的方法。意想不到的是，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)編碼YEP的核酸在植物中的表達(dá)賦予植物相對于對照植物而言增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，所述YEP選自液泡加工酶(VPE)、CCAl樣多肽、SAP樣多肽、種子產(chǎn)量增強因子I(SYPFl)多肽和核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶活化酶(RuBisCO activase, RCA)多肽。 定義多酞/蛋白質(zhì)術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用并且指處于任意長度聚合形式中的
氨基酸。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列術(shù)語“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”在本文中可互換使用并且指處于任意長度聚合形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸或這二者組合。對照植物選擇合適的對照植物是實驗設(shè)置的慣用部分并且可以包括對應(yīng)的野生型植物或無目的基因的對應(yīng)植物。對照植物一般是與待評價植物相同的植物物種或甚至是相同的變種。對照植物也可以是待評價植物的失效合子。如本文中所用的“對照植物”不僅指整株植物，還指植物部分，包括種子及種子部分。同源物蛋白質(zhì)的“同源物”包括這樣的肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶，它們相對于非修飾的上述蛋白質(zhì)具有氨基酸替換、缺失和/或插入并且與所述肽、寡肽、多肽、蛋白質(zhì)及酶來源的非修飾蛋白質(zhì)具有相似生物學(xué)活性和功能活性。缺失指從蛋白質(zhì)中移除一個或多個氨基酸。插入指一個或多個氨基酸殘基在蛋白質(zhì)中預(yù)定位點內(nèi)的引入。插入可以包含單個或多個氨基酸的氨基端融合和/或羧基端融合以及序列內(nèi)插入。通常，在氨基酸序列內(nèi)部的插入會比氨基端融合或羧基端融合更小，約1-10個殘基級別。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的實例包括如酵母雙雜交系統(tǒng)中所用轉(zhuǎn)錄激活物的結(jié)合結(jié)構(gòu)域或激活結(jié)構(gòu)域、噬菌體外殼蛋白、(組氨酸)-6_標(biāo)簽、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶-標(biāo)簽、蛋白A、麥芽糖結(jié)合蛋白、二氫葉酸還原酶、Tag 100表位、c-myc表位、FlAG ~表位、lacZ、CMP( |丐調(diào)蛋白結(jié)合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。替換指以具有相似特性(如相似疏水性、親水性、抗原性、形成或破壞a -螺旋結(jié)構(gòu)或￠-折疊結(jié)構(gòu)的傾向)的其它氨基酸替換蛋白質(zhì)的氨基酸。氨基酸替換一般是單個殘基的，不過可以是簇集性的，這取決于置于多肽的功能性約束；插入通常會是約1-10個氨基酸殘基級別。氨基酸替換優(yōu)選地是保守性氨基酸替換。保守性替換表是本領(lǐng)域眾所周知的(見例如 Creighton (1984) Proteins, ff. H. Freeman and Company 和下表 I)。表I :保守性氨基酸替換的實例
權(quán)利要求
1.用于相對于對照植物增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼液泡加工酶(VPE)的核酸在植物中的表達(dá)
2.根據(jù)權(quán)利要求I的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入并表達(dá)編碼VPE的核酸來實現(xiàn)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的方法，其中所述VPE具有酶分類號EC3.4. 22. 34。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述VPE具有胱天蛋白酶-I活性。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述VPE是yVPE。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述VPE具有以下特征 (a)用于插入內(nèi)膜系統(tǒng)的信號肽； (b)N端抑制性結(jié)構(gòu)域； (C)活性結(jié)構(gòu)域； (d)C端抑制性結(jié)構(gòu)域；和 (e)保守的組氨酸和半胱氨酸殘基。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述編碼VPE的核酸以以下來表示表BI所示SEQ ID NO中的任一核酸或其部分，或者能與表BI所示SEQ ID NO中的任一核酸雜交的序列。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述核酸序列編碼表BI所示任一SEQ IDNO的直向同源物或旁系同源物。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是相對于對照植物而目提聞的廣量，優(yōu)選提聞的種子廣量。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項的方法，其中所述核酸與組成型啟動子有效連接，優(yōu)選與GOS2啟動子有效連接。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項的方法，其中所述核酸與根特異性啟動子有效連接，優(yōu)選與RCC3啟動子有效連接。
12.根據(jù)權(quán)利要求2至9中任一項的方法，其中所述核酸與種子特異性啟動子有效連接，優(yōu)選與WSI18啟動子有效連接，更優(yōu)選與來自稻W(wǎng)SI18啟動子有效連接。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述編碼VPE的核酸為植物來源，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科(Brassicaceae),更優(yōu)選來自擬南芥屬(Arabidopsis),最優(yōu)選來自擬南芥(Arabidopsis thaliana)。
14.可通過前述權(quán)利要求中任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼VPE的重組核酸。
15.分離的核酸分子，其包含(i)SEQID NO 15USEQ ID NO 153,SEQ ID NO 155,SEQ IDNO :157、SEQ ID NO :159、SEQ ID NO: 161、SEQ ID NO: 163、SEQ IDNO : 165、SEQ ID NO: 167、SEQ ID NO: 169、SEQ IDNO 171所示核酸； (ii)(I)所示任一 SEQ ID NO的互補序列；(iii)編碼VPE 的核酸，所述 VPE 與 SEQ ID NO 152, SEQ ID NO :154 和 SEQ ID NO:156、SEQ ID NO :158、SEQ ID NO :160、SEQ ID NO :162、SEQ ID NO :164、SEQ ID NO :166、SEQ ID NO :168, SEQ ID NO :170、SEQ ID NO :172所示任一氨基酸序列具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少 70%,75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性； (iv)能在嚴(yán)格條件下與上文(i)、(ii)或(iii)所示任一核酸雜交的核酸。
16.分尚的多肽,其包含(i)SEQID NO 152, SEQ ID NO :154 和 SEQ ID NO : 156、SEQ IDNO :158、SEQ ID NO:160,SEQ ID NO :162,SEQ ID NO : 164、SEQ IDNO :166、SEQ ID NO 168,SEQ ID NO : 170、SEQID NO :172中任一項所示氨基酸序列；(ii)與SEQ ID NO :152、SEQ ID NO :154 和 SEQ ID NO :156、SEQID NO :158、SEQ IDNO :160,SEQ ID NO 162,SEQ ID NO :164、SEQID NO 166,SEQ ID NO 168,SEQ ID N0:170、SEQ ID勵172所示任一氨基酸序列具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%的序列同一性的氨基酸序列； (iii)上文(i)或(ii)所示任一氨基酸序列的衍生物。
17.構(gòu)建體，其包含 (i)編碼VPE的核酸； (ii)能驅(qū)動(a)的核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；以及任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的構(gòu)建體，其中所述編碼VPE的核酸是根據(jù)權(quán)利要求15的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或18的構(gòu)建體，其中所述一種或多種控制序列是種子特異性啟動子，優(yōu)選WSI18啟動子，更優(yōu)選來自稻的WSI18啟動子。
20.根據(jù)權(quán)利要求17至19中任一項的構(gòu)建體在產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量，特別是提高的種子產(chǎn)量的植物的方法中的用途。
21.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求17至19中任一項的構(gòu)建體的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
22.產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量，特別是提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括 (i)在植物中引入和表達(dá)編碼VPE的核酸；和 (ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
23.由于編碼VPE的核酸的表達(dá)提聞而與對照植物相比具有提聞的廣量，特別是提聞的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
24.根據(jù)權(quán)利要求14、21或23的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為種子。
26.來自根據(jù)權(quán)利要求24的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求25的植物的可收獲部分的女口廣叩o
27.編碼VPE的核酸在植物中相對于對照植物而提高產(chǎn)量特別是提高種子產(chǎn)量中的用途。
28.用于在植物中增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼CCAl樣蛋白的核酸在植物中的表達(dá)，其中所述CCAl樣蛋白的序列包含具有基序I (SEQ ID NO :141)和/或基序2(SEQ ID NO :142)的 SANT。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其中所述編碼CCAl樣蛋白的核酸是表A所示SEQID NO中的任一核酸或其部分，或者能與表A所示SEQ IDNO中的任一核酸雜交的序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING、定點誘變、定向進(jìn)化或同源重組的任何一種或多種實現(xiàn)。
31.根據(jù)權(quán)利要求28或29的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入并表達(dá)編碼CCAl樣蛋白的核酸而實現(xiàn)，并且其中所述CCAl樣蛋白的序列包含具有基序I (SEQ IDNO :141)和 / 或基序 2 (SEQ ID NO :142)的 SANT。
32.根據(jù)權(quán)利要求28至31中任一項的方法，其中所述CCAl樣蛋白序列還包含以下至少一個基序 3 (SEQ ID NO :143)、基序 4 (SEQ ID NO :144)和基序 5 (SEQ ID NO :145)。
33.根據(jù)權(quán)利要求28至32中任一項的方法，其中所述提高的種子產(chǎn)量包括以下任何一種或多種總種子產(chǎn)量、飽滿種子數(shù)、種子飽滿率、每個圓錐花序的花數(shù)、收獲指數(shù)和千粒重。
34.根據(jù)權(quán)利要求31至33中任一項的方法，其中所述核酸與組成型啟動子有效連接，優(yōu)選與G0S2啟動子有效連接。
35.根據(jù)權(quán)利要求28至34中任一項的方法，其中所述編碼CCAl樣蛋白的核酸為植物來源，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自擬南芥屬，最優(yōu)選來自擬南芥。
36.可通過權(quán)利要求28至35中任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼CCAl樣蛋白的重組核酸。
37.構(gòu)建體，其包含 (i)編碼CCAl樣蛋白的核酸，其中所述CCAl樣蛋白的氨基酸序列包含具有基序I(SEQID NO :141)和 / 或基序 2 (SEQ ID NO :142)的 SANT 結(jié)構(gòu)域； (ii)能驅(qū)動(a)的核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；以及任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
38.根據(jù)權(quán)利要求37的構(gòu)建體，其中所述一個或多個控制序列是至少為組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子。
39.根據(jù)權(quán)利要求37或38的構(gòu)建體用于產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的種子產(chǎn)量的植物的用途。
40.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求37或38的構(gòu)建體的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
41.產(chǎn)生與對照植物相比具有增強的種子產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括 (i)在植物中引入和表達(dá)編碼CCAl樣蛋白的核酸，其中所述CCAl樣蛋白的氨基酸序列包含具有基序I (SEQ ID NO :141)和/或基序2(SEQID NO :142)的SANT結(jié)構(gòu)域；和 (ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
42.與適當(dāng)?shù)膶φ罩参锵啾染哂刑岣叩姆N子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或來自所述轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞，所述提高的種子產(chǎn)量是由于編碼CCAl樣蛋白的核酸的表達(dá)提高，其中所述CCAl樣蛋白的氨基酸序列包含具有基序I (SEQ ID NO :141)和/或基序2 (SEQ ID NO 142)的SANT結(jié)構(gòu)域。
43.根據(jù)權(quán)利要求36、40或42的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
44.根據(jù)權(quán)利要求43的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為種子。
45.來自根據(jù)權(quán)利要求43的植物和/或來自根據(jù)權(quán)利要求44的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
46.編碼CCAl樣蛋白的核酸用于在植物中增強種子產(chǎn)量相關(guān)性狀中的用途，其中所述CCAl樣蛋白的氨基酸序列包含具有基序I (SEQ ID NO :141)和/或基序2 (SEQ ID NO 142)的SANT結(jié)構(gòu)域。
47.用于在植物中相對于對照植物增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，其包括調(diào)節(jié)編碼SAP樣多肽的核酸在植物中的表達(dá)。
48.根據(jù)權(quán)利要求47的方法，其中所述受調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入并表達(dá)編碼SAP樣多肽的核酸來實現(xiàn)。
49.根據(jù)權(quán)利要求47或48的方法，其中所述SAP樣多肽具有DNA結(jié)合活性。
50.根據(jù)權(quán)利要求47至49中任一項的方法，其中所述SAP樣多肽包含以下SAP結(jié)構(gòu)域(i)基序I (SEQ ID NO :240) XLSSLKVXELRELAKSRGIKGYSKMKKXELVELLS，其中 X 是任何氨基酸；或 (ii)與基序I具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高序列同一性的基序；或 (iii)與下述基序I具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%序列同一性的基序，所述基序I如其在SEQ ID NO :211中所顯現(xiàn)的DLSTLKVTELRELAKSRGIKGYSKMKKNDLVELLS(SEQ ID NO :243)。
51.根據(jù)權(quán)利要求50的方法，其中所述SAP樣多肽包含(i)基序2 (SEQ ID NO :241)EKxEIVELFKKVQxxLRxRAxxKxExKxxxExAKAQxxxExxTVDSLLxLLRKHSxDQxKK,其中 X 是任何氨基酸；或 (ii)與基序2具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或更高的序列同一性的基序；或 (iii)與下述基序2具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性的基序，其中所述基序2如其在SEQ ID NO :211中所顯現(xiàn)的EKEIVELFKRVQAQLRARGKGKEEKKPEQAKAQGERGSVDSLLNLLRKHSVDQRRK(SEQ ID NO :244)；和/或； (iv)基序3 (SEQ ID NO :242) :RPxSxFxRRSPVP，其中 X 是任何氨基酸；或 (V)與基序3具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或更高的序列同一性的基序；或 (vi)與下述基序3具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的序列同一性的基序，其中所述基序3如其在SEQ ID NO :211中所顯現(xiàn)的RPASNFRRRSPVP(SEQ IDNO :245)。
52.根據(jù)權(quán)利要求47至50中任一項的方法，其中所述編碼SAP樣多肽的核酸由以下來表示表Cl所示SEQ ID NO中的任一核酸或其部分，或者能與表Cl所示SEQ ID NO中的任一核酸雜交的序列。
53.根據(jù)權(quán)利要求47至51中任一項的方法,其中所述核酸序列編碼表Cl所不任一SEQID NO的直向同源物或旁系同源物。
54.根據(jù)權(quán)利要求47至53中任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是與對照植物相比提聞的廣量，優(yōu)選提聞的種子廣量。
55.根據(jù)權(quán)利要求48至54中任一項的方法，其中所述核酸與組成型啟動子有效連接，優(yōu)選與G0S2啟動子有效連接，最優(yōu)選與來自稻的G0S2啟動子有效連接。
56.根據(jù)權(quán)利要求48至54中任一項的方法，其中所述核酸與根特異性啟動子有效連接，優(yōu)選與RCC3啟動子有效連接，最優(yōu)選與來自稻的RCC3啟動子有效連接。
57.根據(jù)權(quán)利要求48至54中任一項的方法，其中所述核酸與年幼綠色組織特異性啟動子有效連接，優(yōu)選與原葉綠素酸酯還原酶(PcR)啟動子有效連接。
58.根據(jù)權(quán)利要求47至57中任一項的方法，其中所述編碼SAP樣多肽的核酸為植物來源，優(yōu)選來自單子葉植物，還優(yōu)選來自禾本科(Poacae),更優(yōu)選來自稻屬(Oryza),最優(yōu)選來自稻(Oryza Sativa)。
59.可通過權(quán)利要求47至58中任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼SAP樣多肽的重組核酸。
60.分離的核酸分子，其包含(i)SEQID NO 212,SEQ ID N0:214、SEQ ID NO :216、SEQ IDNO :218、SEQ ID NO :220、SEQ ID NO 222, SEQ ID NO :224 和 SEQ IDNO :226 所示核酸； (ii)(I)中所示任一 SEQ ID NO的互補序列； (iii)編碼SAP樣多肽的核酸，所述SAP樣多肽與SEQID NO :213、SEQ ID NO :215和SEQ ID NO :217,SEQ ID NO :219、SEQ ID NO :221、SEQ ID NO :223、SEQ ID NO :225和SEQ IDNO 227所示任一氨基酸序列具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少70%、75%、80%、85%、90%、95%,96%,97%,98%,99%^； 100%的序列同一性； (iv)能在嚴(yán)格條件下與上文(i)、(ii)或(iii)所示任一核酸雜交的核酸。
61.分尚的多肽,其包含(i)SEQID NO 213, SEQ ID NO :215 和 SEQ ID NO :217，SEQ IDNO :219，SEQ ID NO:221，SEQ ID NO :223，SEQ ID NO :225 和 SEQ IDNO :227 任一項所示氨基酸序列；(ii)與SEQ ID NO :213、SEQ ID NO :215 和 SEQ ID NO :217、SEQID NO :219、SEQ IDNO :221、SEQ ID NO :223、SEQ ID NO :225 和 SEQID NO :227 所示任一氨基酸序列具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或 100%的序列同一性的氨基酸序列； (iii)上文(I)或(II)所示任一氨基酸序列的衍生物。
62.構(gòu)建體，其包含 (a)編碼SAP樣多肽的核酸； (b)能驅(qū)動(a)的核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；以及任選的 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
63.根據(jù)權(quán)利要求62的構(gòu)建體，其中所述編碼SAP樣多肽的核酸是根據(jù)權(quán)利要求60的核酸。
64.根據(jù)權(quán)利要求62或63的構(gòu)建體,其中所述一個或多個控制序列選自 (i)組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子，最優(yōu)選來自稻的G0S2啟動子； (ii)根特異性啟動子，優(yōu)選RCC3啟動子，最優(yōu)選來自稻的RCC3啟動子； (iii)年幼綠色組織特異性啟動子，優(yōu)選原葉綠素酸酯還原酶(PcR)啟動子。
65.根據(jù)權(quán)利要求62至64中任一項的構(gòu)建體在產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的植物的方法中的用途。
66.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求62至64中任一項的構(gòu)建體的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
67.產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括 (i)在植物中引入和表達(dá)編碼SAP樣多肽的核酸；和 (ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
68.由于編碼SAP樣多肽的核酸的表達(dá)提高而與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
69.根據(jù)權(quán)利要求59、66或68的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
70.根據(jù)權(quán)利要求69的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為種子。
71.來自根據(jù)權(quán)利要求69的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求70的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
72.編碼SAP樣多肽的核酸用于在植物中相對于對照植物而提高產(chǎn)量特別是提高種子產(chǎn)量中的用途。
73.用于在植物中相對于對照植物增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括調(diào)節(jié)編碼種子產(chǎn)量增強因子I(SYPFl)多肽的核酸在植物中的表達(dá)，其中SYPFl多肽包含(i)基序I :SLVSNFLSHYLQYYEEKS ;和 / 或基序 2 PPffLSSYEKLILffIGGFKP ;和 / 或基序 3 NADQLRCVTVGKVVEVLNPRQSIKLLRA ;或 (ii)在任何位置具有任何保守性氨基酸改變的基序I和/或基序2和/或基序3;或 (iii)在任何位置具有I至9個非保守性氨基酸改變的基序I和/或在任何位置具有I至10個非保守性氨基酸改變的基序2和/或在任何位置具有I至14個非保守性氨基酸改變的基序3 ； (iv)與基序I和/或基序2和/或基序3具有優(yōu)選程度逐漸提聞的至少40%>45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高序列同一性的基序。
74.根據(jù)權(quán)利要求73的方法，其中所述SYPFl多肽與SEQID NO :322所示SYPFl多肽或表El所示任一氨基酸序列具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少45 %、50 %、55 %、60 %、65 %、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或更高的序列同一性。
75.根據(jù)權(quán)利要求73或74的方法，其中所述SYPFl包含以下本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域的任何一個或多個 第一本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域MPNTSSSQSF第二本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域VSVADLTRHQKDRISSLKSETRRKEREV第三本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域LVQQSVADP PVM第四本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域HLRLRDRDQERA。
76.根據(jù)權(quán)利要求73或74的方法，其中所述SYPFl包含以下本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域的任何一個或多個 第一本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域PPPSPHPPH 第二本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域SRDLAALRSAASAATNPAAPPDDA第三本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域LAGGGLGAGDLGDL第四本征無序態(tài)結(jié)構(gòu)域ELAGGGGMDAEGMEMEM。
77.根據(jù)權(quán)利要求73至76中任一項的方法，其中所述SYPFl多肽具有DNA結(jié)合活性。
78.根據(jù)權(quán)利要求73至77中任一項的方法，其中所述編碼SYPFl多肽的核酸由以下來表示表El所示SEQ ID NO中的任一核酸或其部分，或者能與表El所示SEQ ID NO中的任一核酸雜交的序列。
79.根據(jù)權(quán)利要求73至77中任一項的方法,其中所述核酸序列編碼表El所不任一SEQID NO的直向同源物或旁系同源物。
80.根據(jù)權(quán)利要求73至79中任一項的方法，其中所述調(diào)節(jié)的表達(dá)通過在植物中引入并表達(dá)編碼SYPFl多肽的核酸來實現(xiàn)。
81.根據(jù)權(quán)利要求73至80中任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是與對照植物相比提聞的廣量，優(yōu)選提聞的種子廣量。
82.根據(jù)權(quán)利要求80或81的方法，其中所述核酸與組成型啟動子有效連接，優(yōu)選與HMG啟動子有效連接。
83.根據(jù)權(quán)利要求73至82中任一項的方法，其中所述編碼SYPFl多肽的核酸為植物來 源，優(yōu)選來自雙子葉植物，還優(yōu)選來自十字花科，更優(yōu)選來自擬南芥屬，最優(yōu)選來自擬南芥。
84.可通過權(quán)利要求73至83中任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼SYPFl多肽的重組核酸。
85.構(gòu)建體，其包含 (a)權(quán)利要求73至76中任一項所定義的編碼SYPFl多肽的核酸； (b)能驅(qū)動(a)的核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；以及任選的 (c)轉(zhuǎn)錄終止序列。
86.根據(jù)權(quán)利要求85的構(gòu)建體，其中所述一個或多個控制序列是組成型啟動子，優(yōu)選HMG啟動子。
87.根據(jù)權(quán)利要求85或86的構(gòu)建體在用于產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的植物的方法中的用途。
88.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求85或86的構(gòu)建體的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
89.產(chǎn)生與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括 (a)在植物中引入和表達(dá)編碼SYPFl多肽的核酸，所述SYPFl多肽如權(quán)利要求73至74中任一項所定義的；和 (b)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
90.由于73至76中任一項所定義的編碼SYPFl多肽的核酸的表達(dá)提高而與對照植物相比具有提高的產(chǎn)量特別是提高的種子產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因植物，或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞。
91.根據(jù)權(quán)利要求84、88或90的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
92.根據(jù)權(quán)利要求91的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為種子。
93.來自根據(jù)權(quán)利要求91的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求92的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
94.權(quán)利要求73至76中任一項所定義的編碼SYPFl多肽的核酸用于在植物中相對于對照植物而提高產(chǎn)量特別是提高種子產(chǎn)量中的用途。
95.用于在植物中增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法，包括提高編碼核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(SuBis￡o)活化酶(RCA)多肽的核酸序列在植物中的表達(dá)，并且任選地選擇具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的植物，其中RCA多肽不受氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)，并從N端到C端包含(i)質(zhì)體轉(zhuǎn)運肽；和(ii)與SEQ ID NO :311所示AAA結(jié)構(gòu)域具有優(yōu)選程度逐漸提高的至少 60%，65%，70%，75%，80%，85%，90%，95%或 98%序列同一性。
96.根據(jù)權(quán)利要求95的方法，其中所述RCA多肽還在AAA結(jié)構(gòu)域內(nèi)包含SEQID NO 312 所示基序 I [G (G/R) KG (Q/E) GK (S/T)]。
97.根據(jù)權(quán)利要求95或96的方法，其中所述提高的表達(dá)通過T-DNA激活標(biāo)簽、TILLING或同源重組的任何一種或多種實現(xiàn)。
98.根據(jù)權(quán)利要求95至97中任一項的方法，其中所述提高的表達(dá)通過在植物的地上部分中引入并表達(dá)編碼RCA多肽的核酸序列而實現(xiàn)。
99.根據(jù)權(quán)利要求95至98中任一項的方法，其中所述核酸序列是以下編碼RCA多肽的核酸變體中的一種或多種 (i)編碼RCA多肽的核酸序列的一部分； (ii)能與編碼RCA多肽的核酸序列雜交的核酸序列； (iii)編碼RCA多肽的核酸序列的剪接變體； (iv)編碼RCA多肽的核酸序列的等位變體； (v)可通過定點誘變獲得的編碼RCA多肽的核酸序列； 其中所述RCA多肽不受氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)。
100.根據(jù)權(quán)利要求95至99中任一項的方法,其中所述核酸序列編碼表Dl所不任一RCA多肽，或者編碼Dl所示任一 SEQ ID NO的直向同源物或旁系同源物，其中所述RCA多肽不受氧化還原反應(yīng)調(diào)節(jié)。
101.根據(jù)權(quán)利要求95至100中任一項的方法，其中所述核酸序列來自光合細(xì)胞，優(yōu)選來自植物，更優(yōu)選來自藻類，最優(yōu)選來自萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)。
102.根據(jù)權(quán)利要求101的方法，其中所述核酸序列編碼SEQID NO :251所示RCA多肽。
103.根據(jù)權(quán)利要求95至102中任一項的方法，其中所述核酸序列與用于在植物中組成型表達(dá)的啟動子有效連接。
104.根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中所述啟動子是強組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子，更優(yōu)選稻G0S2，最優(yōu)選SEQ ID NO :306所示稻G0S2啟動子。
105.根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中所述啟動子是組成型啟動子，優(yōu)選HMGB啟動子，更優(yōu)選稻HMGB啟動子，最優(yōu)選SEQ ID NO :307所示稻HMGB啟動子。
106.根據(jù)權(quán)利要求103的方法，其中所述核酸序列與綠色組織特異性啟動子有效連接，更優(yōu)選與原葉綠素酸酯還原酶啟動子有效連接，更優(yōu)選與稻原葉綠素酸酯還原酶啟動子有效連接，最優(yōu)選與SEQ ID NO :308所示稻原葉綠素酸酯還原酶啟動子有效連接。
107.根據(jù)權(quán)利要求95至106中任一項的方法，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是以下一種或多種(i)提高的早期萌發(fā)勢；(ii)提高的地上部分生物量；(iii)更早的開花時間；(iv)(飽滿)種子數(shù)增加；和(v)提高的TKW。
108.根據(jù)權(quán)利要求95至107中任一項的方法，其中所述編碼RCA多肽序列的核酸序列來源于光合細(xì)胞，優(yōu)選來源于植物，更優(yōu)選來源于綠藻，最優(yōu)選來源于萊茵衣藻。
109.可通過權(quán)利要求95至108中任一項的方法獲得的植物或其部分，包括種子，其中所述植物或其部分包含編碼RCA多肽的核酸轉(zhuǎn)基因。
110.構(gòu)建體，其包含 (i)編碼RCA多肽的核酸序列； (ii)能驅(qū)動(a)的核酸序列表達(dá)的一個或多個控制序列；以及任選的 (iii)轉(zhuǎn)錄終止序列。
111.根據(jù)權(quán)利要求110的構(gòu)建體，其中所述一個或多個控制序列是至少為組成型啟動子，優(yōu)選G0S2啟動子，更優(yōu)選SEQ ID NO :306所示稻G0S2啟動子。
112.根據(jù)權(quán)利要求110的構(gòu)建體，其中所述一個或多個控制序列是至少為組成型啟動子，優(yōu)選HMGB啟動子，更優(yōu)選SEQ ID NO :307所示稻HMGB啟動子。
113.根據(jù)權(quán)利要求110的構(gòu)建體，其中所述一個或多個控制序列是至少為綠色組織特異性啟動子，優(yōu)選原葉綠素酸酯還原酶啟動子，更優(yōu)選SEQ ID NO :308所示稻原葉綠素酸酯還原酶啟動子。
114.根據(jù)權(quán)利要求110或111中任一項的構(gòu)建體用于產(chǎn)生與對照植物相比具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀特別是提高的早期萌發(fā)勢和/或提高的TKW的植物的用途。
115.根據(jù)權(quán)利要求110或112中任一項的構(gòu)建體用于產(chǎn)生下述植物的用途，其中所述植物與對照植物相比具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，特別是以下的一種或多種提高的早期萌發(fā)勢、更早的開花時間、提高的(飽滿)種子數(shù)。
116.根據(jù)權(quán)利要求110或114中任一項的構(gòu)建體用于產(chǎn)生下述植物的用途，其中所述植物與對照植物相比具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀，特別是提高的早期萌發(fā)勢和/或更早的開花時間。
117.轉(zhuǎn)化有權(quán)利要求110至116中任一項的構(gòu)建體的植物、植物部分或植物細(xì)胞。
118.產(chǎn)生與對照植物相比具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包括 (i)在植物或植物細(xì)胞中引入和表達(dá)編碼RCA多肽的核酸序列；和 (ii)在促進(jìn)植物生長和發(fā)育的條件下培養(yǎng)植物細(xì)胞。
119.與對照植物相比具有增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物部分或轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是由于編碼RCA多肽的核酸序列的表達(dá)提聞。
120.根據(jù)權(quán)利要求117或119的轉(zhuǎn)基因植物或者來自所述轉(zhuǎn)基因植物的轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞，其中所述植物是作物植物或單子葉植物或谷物，例如稻、玉米、小麥、大麥、粟、黑麥、高粱和燕麥。
121.根據(jù)權(quán)利要120的植物的可收獲部分，其中所述可收獲部分優(yōu)選為種子。
122.來自根據(jù)權(quán)利要求120的植物和/或根據(jù)權(quán)利要求121的植物的可收獲部分的產(chǎn)品。
123.編碼RCA多肽的核酸序列用于在植物中增強產(chǎn)量相關(guān)性狀的用途。
124.根據(jù)權(quán)利要求123的用途，其中所述增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀是以下一種或多種(i)提高的早期萌發(fā)勢；(ii)提高的地上部分生物量；(iii)更早的開花時間；(iv)(飽滿)種子數(shù)增加；和(V)提高的TKW。
全文摘要
本發(fā)明一般地涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，并涉及增強植物中多種具有經(jīng)濟重要性的產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過調(diào)節(jié)編碼產(chǎn)量增強蛋白(Yield Enhancing Protein，YEP)的核酸在植物中的表達(dá)來增強植物中產(chǎn)量相關(guān)性狀的方法。所述YEP選自液泡加工酶(Vacuolar Processing Enzyme，VPE)、CCA1樣多肽或SAP樣多肽或種子產(chǎn)量增強因子1(Seed Yield Promoting Factor 1，SYPF1)多肽或者核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(RuBisCO)活化酶(activase)(RCA)多肽。本發(fā)明還涉及已調(diào)節(jié)了編碼如YEP之核酸的表達(dá)的植物，所述植物具有相對于對照植物而言增強的產(chǎn)量相關(guān)性狀。本發(fā)明還提供可用于實施本發(fā)明方法的迄今未知的YEP編碼核酸，以及包含所述核酸的構(gòu)建體。
文檔編號A01H5/00GK102676575SQ201210129528
公開日2012年9月19日 申請日期2007年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月21日
發(fā)明者A·I·桑茲莫林納羅, C·勒佐, V·弗蘭卡德, W·布洛克阿爾特 申請人:巴斯福植物科學(xué)有限公司