專利名稱：一種生物有機肥發(fā)酵菌種s4的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是農(nóng)業(yè)生物有機肥生產(chǎn)技術(shù)，特別是一種固態(tài)發(fā)酵制備煙草秸桿生物有機肥的菌種制備方法。
背景技術(shù)：
煙草是一種重要的經(jīng)濟作物，在國民經(jīng)濟中具有十分重要的作用。在我國煙草種植生產(chǎn)過程中，長期以來以化學肥料為主，造成土壤有機質(zhì)數(shù)量銳減，團聚體數(shù)量和質(zhì)量下降，通氣性退化，影響煙葉生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量。另外，當煙葉采收后，在煙田中丟棄大量的廢棄煙草秸桿，最長時間可達五個月，增加次年煙田病蟲害，污染煙田生態(tài)環(huán)境。按照行業(yè)規(guī)定，應(yīng)該集中煙草秸桿焚燒處理，但這樣會增加CO2排放量，造成大氣環(huán)境污染。是一種不得而為之的辦法。現(xiàn)有技術(shù)中有借用一般農(nóng)作物秸桿固體發(fā)酵技術(shù)把煙草秸桿發(fā)酵變成生物有機肥方法，但因煙草秸桿含有大量煙堿、又帶有大量有害病菌和病毒，這種方法沒有優(yōu)選選微生物菌種，效果不好。常用的發(fā)酵細菌不適合在具有大量煙堿物質(zhì)的條件下生存，不能夠進行有效發(fā)酵轉(zhuǎn)化，所以現(xiàn)有方法難于解決上述問題。如果能尋找一種耐強煙堿高溫微生物，具有在大量煙堿物質(zhì)的條件下生存的發(fā)酵細菌，進行固態(tài)發(fā)酵，將廢棄煙草秸桿轉(zhuǎn)化成一種安全的生物有機肥，部分替代化學復合肥，回填到煙田。把煙草生產(chǎn)中的病蟲害、土壤退化、環(huán)境保護、資源利用和煙葉質(zhì)量問題一并考慮，并加以利用。這樣，大大地有利于改善環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提出一種能夠在高溫重煙堿條件下生存的固態(tài)發(fā)酵菌種的制備方法。將該耐溫耐煙堿的固態(tài)發(fā)酵菌種經(jīng)培養(yǎng)和擴繁后，加入到廢棄的煙草秸桿混合物中，在自然條件下進行固態(tài)發(fā)酵，將煙草秸桿廢棄物轉(zhuǎn)化為煙草秸桿生物有機肥。具體步驟為I、菌株分離篩選從不同地區(qū)煙田的煙草秸桿中，分別取樣加入到含有煙堿的葡萄糖、蛋白胨，酵母膏，無機鹽的液體培養(yǎng)基中，在50 60°C高溫下，培養(yǎng)48小時。將培養(yǎng)液稀釋，涂布于含煙堿的蛋白胨，酵母膏的瓊脂培養(yǎng)皿中，在25 35°C下，培養(yǎng)24 36小時。挑取單菌落，分別并同時接種到蛋白胨、酵母膏、無機鹽的同一編號的液體或固體培養(yǎng)基中，在30°C下，培養(yǎng)24 30小時。提取離心上清培養(yǎng)液，加入鏈霉素、青霉素和羧甲基纖維素，在50°C下，保溫18小時，測定還原糖含量，分離篩選出S4菌株。2、菌株分類鑒定及保藏根據(jù)伯捷氏手冊(第七版)和16SrRNA基因順序測定對&進行菌株的分類鑒定。
&菌根據(jù)S4菌的菌落形態(tài)，細胞形態(tài)，生理生化試驗和16SrRNA基因序列測定結(jié)果，S4 菌為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens S4)。該菌株于2010年9月26日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，名稱為解淀粉芽抱桿菌 S4 (Bacillus amy Io Ii quefaci ens S4),保藏號CCTCC NO. M 2010249),地址中國.武漢.武漢大學。該菌株的菌學特性。菌落粗糙，不透明，擴張，微帶黃色，細胞直徑< I μ m,桿狀，著色均勻，無夾膜，運動，革氏染色呈陽性；形成芽孢，芽孢橢圓形，中生不膨大，無伴孢晶體，接觸酶和氧化酶呈陽性，VP試驗呈陽性，甲基紅試驗呈陽性，厭氧生長，可利用葡萄糖，木糖，甘露糖，L-阿拉伯糖，并產(chǎn)酸，水解淀粉，分解酪素；不能利用乳糖，檸檬酸鹽，硝酸鹽還原試驗均為陽性；50°C下生長，7% NaCI下生長，PH5. 7生長，VPPH < 6陽性，VPPH > 7陰性。該菌能在煙堿存在的條件下生長。3、種子培養(yǎng)。以S4菌作為菌種，在種子三角瓶或發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基MD，其成分和比例如表I。表I菌株液體培養(yǎng)基
權(quán)利要求
1.一種生物有機肥發(fā)酵菌種解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )S4,其保藏編號為CCTCC No. M 2010249。
2.一種生物有機肥發(fā)酵菌種的制備方法，其特征在于制備步驟為 1)、種子培養(yǎng)，以權(quán)利要求I、權(quán)利要求2所述的菌種短桿菌S4在種子三角瓶中進行種子培養(yǎng)，在種子三角瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基MD，種子培養(yǎng)條件培養(yǎng)基滅菌后接入斜面母種，在28 30°C下，振蕩培養(yǎng)16 22小時，所述培養(yǎng)基其組成質(zhì)量百分數(shù)比葡萄糖O. 7 I.0%，蛋白胨 O. 6 O. 8%,酵母膏 O. 3 O. 5%, Na Cl O. 2 O. 4%, KH2PO4 O O. 2% 其余為水，將PH調(diào)至6. 7 8. O ； 2)、擴繁培養(yǎng)，在發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基MD，滅菌后按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基MD的3 8%體積比接入上述培養(yǎng)物混合后作種子，擴繁培養(yǎng)條件罐壓為O. 4 O. 6Mpa，罐溫為28 30°C，空氣流量為O. 3 O. 6 (v/v/min)，攪拌器轉(zhuǎn)速為200rpm，擴繁培養(yǎng)18 24小時，當培養(yǎng)液的OD值為0D600nm下降O. 02時終止發(fā)酵； 3)、產(chǎn)品培養(yǎng),在大型發(fā)酵罐中加入培養(yǎng)基MD，滅菌后按照發(fā)酵罐培養(yǎng)基的3 8%體積比接入擴繁培養(yǎng)的培養(yǎng)物作液體種子，產(chǎn)品培養(yǎng)條件罐壓為O. 4 O. 6Mpa，罐溫為28 30°C，空氣流量為O. 3 O. 6 (v/v/min)，攪拌器轉(zhuǎn)速為140 200rpm，產(chǎn)品培養(yǎng)18 24小時；當培養(yǎng)液的OD值為0D600mn下降O. 02時終止發(fā)酵； 4)、將上述發(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)膜濾濃縮I 8倍,檢測得液態(tài)菌劑；或?qū)⑸鲜霭l(fā)酵培養(yǎng)物經(jīng)膜濾濃縮I 8倍后，加入分散劑，進一步干燥得固態(tài)菌劑產(chǎn)品。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2的一種生物有機肥發(fā)酵菌種的使用方法，其特征是能夠單獨使用，或者與短桿菌01菌聯(lián)合使用，聯(lián)合使用時的比例為短桿菌D1菌解淀粉芽孢桿菌S4菌=1 4: I。
全文摘要
本發(fā)明提出了一種煙草秸稈生物有機肥發(fā)酵菌種解淀粉芽孢桿菌S4(BacillusamyloliquefaciensS4，保藏為CCTCCNoM2010249)，它們是從煙草秸稈中在高溫重煙堿條件下分離篩選出的，能夠在煙堿存在的條件下生存，經(jīng)培養(yǎng)和擴繁后，加入到廢棄的煙草秸稈混合物中，在自然條件下進行固態(tài)發(fā)酵，將煙草秸稈廢棄物轉(zhuǎn)化為煙草秸稈生物有機肥。該煙草秸稈生物有機肥可以代替其他肥料進行煙草生產(chǎn)，可以增加煙葉產(chǎn)量、增加煙葉產(chǎn)值和改善煙葉評吸質(zhì)量，同時也消除了煙草秸稈廢棄物對環(huán)境的污染。
文檔編號C05F11/08GK102943051SQ20121012542
公開日2013年2月27日 申請日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者高勇, 陳家任, 楊樹, 祖秉橋, 李錫宏 申請人:中國煙草總公司湖北省公司