專(zhuān)利名稱(chēng)：成熟油菜種子次生休眠特性的化學(xué)檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生理生態(tài)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種成熟油菜種子次生休眠特性的快速化學(xué)檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
次生休眠(secondary dormancy)特性是造成油菜種子基因擴(kuò)散的重要原因。所謂次生休眠，是指原來(lái)不休眠或解除休眠后的種子由于干旱等不適宜環(huán)境條件的影響而誘發(fā)的休眠。次生休眠特性使得油菜產(chǎn)區(qū)地下種子庫(kù)可以持續(xù)存在，地下種子一旦條件適宜便發(fā)芽長(zhǎng)大，成為雜草和污染源。因此，次生休眠特性是油菜生產(chǎn)和轉(zhuǎn)基因油菜環(huán)境安全評(píng)估的重要性狀。油菜是世界四大油料作物之一。油菜品種的次生休眠程度到底如何、遺傳多樣性怎么樣？發(fā)掘休眠性弱的品種，有利于防止基因擴(kuò)散；選擇休眠性強(qiáng)的品種，有利于防止收獲前發(fā)芽；探明油菜次生休眠發(fā)生的原因與規(guī)律，有利于找到改變油菜休眠特性的方法。對(duì)油菜種子次生休眠特性的檢測(cè)與篩選是開(kāi)展上述研究工作的必要前提。我國(guó)對(duì)油菜種子次生休眠特性的研究比較薄弱，相關(guān)的檢測(cè)方法更是缺乏報(bào)道。在國(guó)外，測(cè)定種子次生休眠特性的方法通常采用PEG化學(xué)誘導(dǎo)法(Gulden. A ThesisSubmitted to the College of Graduate Studies and Research in Partial Fulfilmentof the Requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in the Department ofPlant Sciences University of Saskatchewan Saskatoon. 2003)。其不足之處在于實(shí)驗(yàn)周期很長(zhǎng)，完成一次完整的次生休眠檢測(cè)需要45-50天。在我國(guó)，油菜從田間收獲脫粒至秋播僅間隔60天左右，如果采用上述檢測(cè)方法，科研人員在油菜種子收獲后幾乎沒(méi)有剩余時(shí)間開(kāi)展其他研究工作。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供成熟油菜種子次生休眠特性的快速化學(xué)檢測(cè)方法。本發(fā)明提供的方案是采用兩步法快速檢測(cè)油菜種子的次生休眠特性。第一步是用滲透勢(shì)為-17. 5 bar的PEG6000溶液在溫度25° C、黑暗條件下浸泡種子7天誘導(dǎo)次生休眠；第二步是檢測(cè)種子發(fā)芽率和生活力，具有生活力但不能發(fā)芽的種子判斷為休眠種子。所述的方法包括以下步驟(I)誘導(dǎo)休眠用滲透勢(shì)為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導(dǎo)次生休眠，即取100粒成熟油菜種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，注入9ml -17. 5bar的PEG6000溶液浸泡，同時(shí)做4 8組平行樣。將培養(yǎng)皿裝入ー個(gè)箱子，25。C黑暗保存，誘導(dǎo)次生休眠；(2)檢測(cè)休眠率步驟(I)完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下將種子清洗后轉(zhuǎn)移到裝有9ml去離子水的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在25° C黑暗條件下保存，非休眠種子將發(fā)芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除發(fā)芽的種子。所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養(yǎng)皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時(shí)間12 h /12 h)處理，如果能夠發(fā)芽，則屬于次生休眠種子實(shí)驗(yàn)對(duì)照以不經(jīng)次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發(fā)芽結(jié)果為對(duì)照。所述步驟(I)中PEG6000溶液在25 ° C條件下配置，滲透勢(shì)為-I. 75Mpa(-17. 5bar)。所述步驟(I)中25° C黑暗保存7天。所述步驟(2)中25° C黑暗條件下保存7天；交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度 3/30。C，時(shí)間 12 h /12 h)處理 3 天。所用的油菜種子為成熟油菜的干種子。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是實(shí)驗(yàn)周期大大縮短，完成全部檢測(cè)工作僅需17天；實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好。通過(guò)本發(fā)明，已篩選出次生休眠性具有顯著差異的油菜品種，為進(jìn)一歩掲示油菜次生休眠發(fā)生機(jī)制提供了重要的技術(shù)支持，同時(shí)也可為其他植物種子次生休眠特性的檢測(cè)提供技術(shù)參考。


圖I為次生休眠性特強(qiáng)品種，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水，只有少量的種子發(fā)芽(為非休眠種子)，剰余的大部分種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率達(dá)80%左右；
圖2為次生休眠性特弱品種，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水，只有極少數(shù)種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率低于3% ；
圖3為次生休眠性特強(qiáng)品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水大部分種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率達(dá)70%左右；
圖4為次生休眠性特強(qiáng)品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水大量種子發(fā)芽(為非休眠種子)，次生休眠率僅5%左右。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明的作進(jìn)ー步說(shuō)明。實(shí)施例I :中國(guó)油菜品種次生休眠特性的遺傳多祥性
以江蘇、湖北、安徽、陜西等我國(guó)主要的冬油菜產(chǎn)區(qū)的85個(gè)甘藍(lán)型普通油菜品種(其中36個(gè)為常規(guī)品種，其余為雜交品種，且均為當(dāng)?shù)刂髟云贩N)的成熟種子為材料，考察我國(guó)油菜品種次生休眠特性的遺傳多祥性。(I)誘導(dǎo)休眠用滲透勢(shì)為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導(dǎo)次生休眠每個(gè)品種取100粒種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，注入9ml-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡；每個(gè)品種同時(shí)做4 8組平行樣；將培養(yǎng)皿裝入ー個(gè)箱子，25° C避光保存7天，誘導(dǎo)次生休眠。(2)檢測(cè)休眠率完成后在500 - 600 nm緑色安全光照下將種子轉(zhuǎn)移裝有9ml去離子水的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在25° C黑暗條件下保持7天，非休眠種子將發(fā)芽；在500 - 600 nm緑色安全光照下剔除發(fā)芽的種子；所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養(yǎng)皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時(shí)間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發(fā)芽，則屬于次生休眠種子。
實(shí)驗(yàn)對(duì)照以不經(jīng)次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發(fā)芽結(jié)果為對(duì)照。結(jié)論我國(guó)油菜品種間次生休眠性特差異極為顯著，次生休眠性特強(qiáng)品種的次生休眠率達(dá)80%左右，次生休眠性特弱品種的次生休眠率則低于3%。如附圖I所示次生休眠性特強(qiáng)品種，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水，只有少量的種子發(fā)芽(為非休眠種子)，剰余的大部分種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率達(dá)80%左右；圖2所示為次生休眠性特弱品種，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水，只有極少數(shù)種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率低于3%。實(shí)施例2 :次生休眠性特強(qiáng)、特弱品種雜交后代的次生休眠特性
選取次生休眠性特強(qiáng)品種和次生休眠性特弱品種作親本，分別配置正反交組合，檢測(cè) 次生休眠差異品種雜交后代成熟種子的休眠特性表現(xiàn)。(I)誘導(dǎo)休眠用滲透勢(shì)為-I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導(dǎo)次生休眠每個(gè)雜交后代取100粒成熟種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，注入9ml -I. 75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液浸泡，每個(gè)雜交后代同時(shí)做4 8組平行樣；將培養(yǎng)皿裝入ー個(gè)箱子，25° C避光保存I天，誘導(dǎo)次生休眠。(2)檢測(cè)休眠率完成后在500 - 600 nm綠色安全光照下將種子轉(zhuǎn)移裝有9ml去離子水的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在25° C黑暗條件下保持7天，非休眠種子將發(fā)芽。在500 - 600nm緑色安全光照下剔除發(fā)芽的種子。所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養(yǎng)皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時(shí)間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發(fā)芽，則屬于次生休眠種子。實(shí)驗(yàn)對(duì)照以不經(jīng)次生休眠處理(用9ml水代替PEG6000)的發(fā)芽結(jié)果為對(duì)照。結(jié)論次生休眠性特強(qiáng)品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，次生休眠率達(dá)70%左右；次生休眠性特強(qiáng)品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，次生休眠率僅5%左右。如附圖3所示為次生休眠性特強(qiáng)品種(作父本)與次生休眠性特弱品種(作母本)的雜交后代，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水大部分種子未發(fā)芽(為休眠種子)，次生休眠率達(dá)70%左右；圖4為次生休眠性特強(qiáng)品種(作母本)與次生休眠性特弱品種(作父本)的雜交后代，經(jīng)PEG誘導(dǎo)后加水大量種子發(fā)芽(為非休眠種子)，次生休眠率僅5%左右。
權(quán)利要求
1.成熟油菜種子次生休眠特性的化學(xué)檢測(cè)方法，所述的方法包括以下步驟 (1)誘導(dǎo)休眠用滲透勢(shì)為-I.75Mpa (-17. 5bar)的PEG6000溶液處理種子，誘導(dǎo)次生休眠，即取100粒成熟油菜種子放入直徑9cm墊有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中，注入9ml -17. 5bar的PEG6000溶液浸泡7天，同時(shí)做4 8組平行樣；將培養(yǎng)皿裝入ー個(gè)箱子，25° C黑暗保存，誘導(dǎo)次生休眠； (2)檢測(cè)休眠率完成后在500 600nm綠色安全光照下將種子轉(zhuǎn)移到裝有9ml去離子水的培養(yǎng)皿中，繼續(xù)在25° C黑暗條件下保存7天，非休眠種子將發(fā)芽；500 - 600 nm綠色安全光照下剔除發(fā)芽的種子；所有剩下的種子清洗后再換入裝有5ml去離子水的培養(yǎng)皿中，置于交替的光照和溫度條件下(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時(shí)間12 h /12 h)處理3天，如果能夠發(fā)芽，則屬于次生休眠種子。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述步驟(I)中PEG6000溶液在25°C條件下配置，滲透勢(shì)為-I. 75Mpa (-17. 5bar)0
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述步驟(I)中25°C黑暗保存7天。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，所述步驟(2)中25°C黑暗條件下保存7天；交替的光照和溫度(光照0/6000LX，溫度3/30° C，時(shí)間12 h /12 h)條件下處理3天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)一種成熟油菜種子次生休眠特性的化學(xué)檢測(cè)方法，所述的方法包括以下步驟第一步是用滲透勢(shì)為-17.5bar的PEG6000溶液在溫度25°C、黑暗條件下浸泡種子7天誘導(dǎo)次生休眠；第二步是檢測(cè)種子發(fā)芽率和生活力，具有生活力但不能發(fā)芽的種子判斷為休眠種子。本發(fā)明完成一次完整的次生休眠檢測(cè)僅17天，且獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，從而解決了油菜次生休眠化學(xué)檢測(cè)周期較長(zhǎng)的難題，為進(jìn)一步揭示油菜次生休眠的發(fā)生機(jī)制提供了重要的技術(shù)支持，同時(shí)也可為其他植物種子次生休眠檢測(cè)提供技術(shù)參考。
文檔編號(hào)A01C1/02GK102612893SQ20121010803
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉福霞, 盧長(zhǎng)明, 唐瑭, 王興龍, 趙祥強(qiáng), 趙祥祥 申請(qǐng)人:淮陰師范學(xué)院