專利名稱：一種評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性的大型蚤飼養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種水生生物大型蚤的飼養(yǎng)方法，屬昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域
背景技術(shù)：
水稻作為世界重要的糧食作物之一，為地球上近30億人提供著食物，但是病蟲害嚴(yán)重影響水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量。通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將抗蟲、抗病等外源基因引入到水稻基因組中，培育抗蟲、抗病轉(zhuǎn)基因水稻新品種，已成為防控水稻病蟲害提高水稻產(chǎn)量的新方法和新途徑。隨著轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模推廣，人們越來越關(guān)注于它的安全性問題。由于我國水稻生產(chǎn)和消費在全球的重要地位和影響，我國政府對于轉(zhuǎn)基因水稻的商業(yè)化生產(chǎn)持非常謹(jǐn)慎和認(rèn)真的態(tài)度，既考慮到轉(zhuǎn)基因水稻未來商業(yè)化將帶來的 巨大經(jīng)濟利益和社會影響，同時也對轉(zhuǎn)基因水稻大規(guī)模環(huán)境釋放和種植可能帶來的潛在生物安全問題進行科學(xué)和認(rèn)真的評價。大型蚤(Daphnia magna)是環(huán)境毒理學(xué)研究中的標(biāo)準(zhǔn)生物，廣泛的用于各種化學(xué)品毒性安全評價。大型蚤廣泛分布于各種水體中，包括種植水稻的水田，因此以大型蚤為研究對象開展轉(zhuǎn)基因水稻的環(huán)境安全評價很有實際意義。目前主要是以綠藻(如斜生柵藻Scenedesmus obliquus)為主要食物進行大型蚤的人工培養(yǎng)和毒理學(xué)評價,無法準(zhǔn)確地評價轉(zhuǎn)基因稻米這類不溶性固體對大型蚤的真實影響。為了更準(zhǔn)確地評價轉(zhuǎn)基因水稻對大型蚤的毒理學(xué)效應(yīng)，迫切需要一種以水稻種子為主要食物成分的大型蚤飼養(yǎng)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明克服了傳統(tǒng)大型蚤毒理實驗技術(shù)的缺陷，建立了一套純稻米飼養(yǎng)大型蚤的方法，為評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性提供了可靠的實驗保障，方法步驟如下(I)大型蚤經(jīng)長期培養(yǎng)馴化后，選擇培養(yǎng)3代以上、遺傳背景相同的6 24h的幼蚤作為實驗蚤。培養(yǎng)液配制294. Omg · Γ1 CaC12 ;123· 2mg · L—1 MgS04 ;64. 8mg · Γ1 NaHC03 ；
6.3mg · I^1KCL,新配制的培養(yǎng)液 pH 為 7. 8±0· 2，硬度 250±25mg · Γ1 (以 CaC03 計)。(J)米粉溶液配制將水稻種子去殼后，用粉碎機充分打碎后過125目篩子，使米粉顆粒直徑小于lOOum，稱取過篩后的粉末，用培養(yǎng)液配置成濃度分別為O. 8g*L-\l. 2g · Λ
I.6g · Γ1的米粉懸浮液，均一后分裝至IOml滅菌離心管內(nèi)，4°C儲存?zhèn)溆谩?子/實驗蚤在溫度為22±I°C，光強為60 μ mol m-2s_l，光暗比為16h 8h的恒溫培養(yǎng)室50ml燒杯中培養(yǎng),每杯加40ml培養(yǎng)液。每日添加米粉溶液lOOul，培養(yǎng)過程中每天定時清理雜物并將新生小水蚤移出，每3天更換培養(yǎng)液。新生小水蚤可以根據(jù)實驗需要繼代培養(yǎng)。本發(fā)明有益效果(I)本發(fā)明使用純稻米飼養(yǎng)大型蚤，消除了常規(guī)方法中大型蚤選擇性攝取綠藻等天然食物而不取食或很少取食稻米的現(xiàn)象。
(2)本發(fā)明使用純稻米喂養(yǎng)大型蚤，克服了常規(guī)方法中因綠藻營養(yǎng)成分不確定而易影響實驗結(jié)果，且需要不斷培養(yǎng)綠藻的缺陷。


圖I :轉(zhuǎn)基因水稻與親本在不同濃度稻米喂養(yǎng)下的存活天數(shù)比較圖2不同處理對大型蚤體長的影響圖3不同處理對大型蚤存活率的影響
具體實施例方式以純稻米喂飼大型蚤評價轉(zhuǎn)基因水稻的生物安全性。試驗選用水稻種子為“Bt汕優(yōu)63”及其親本種子，插入的外源基因為CrylAb/CrylAc融合型基因。 大型蚤(Daphnia magna)經(jīng)長期培養(yǎng)馴化后，選擇培養(yǎng)3代以上遺傳背景相同的6 24h的幼蚤作為實驗蚤。實驗蚤在溫度為22± I °C,光強為60 μ mol m-2s_l,光暗比為16h 8h的恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)。實驗培養(yǎng)液配方294. Omg · L-lCaC12 ;123. 2mg .L-IMgSCM ；64. 8mg *L-lNaHC03 ；6. 3mg .L-IKCL，新配制的培養(yǎng)液 pH 為 7. 8±0· 2，硬度250±25mg · L_1 (以CaC03計)。各處理組每日添加不同濃度的米粉溶液lOOul，(O. 8g · L-Ul. 2g · L-Ul. 6g · L-I米粉,干重分別相當(dāng)于2、3、4mg,此濃度以夠水蚤每日所需)培養(yǎng)過程中每天定時清理雜物并將新生小水蚤移出，每3天更換培養(yǎng)用水。飼養(yǎng)過程中，分別測定不同處理組大型蚤的體長、存活率以及存活天數(shù)從上述結(jié)果可以看出轉(zhuǎn)基因水稻同其親本相比對大型蚤的生長沒有顯著影響，由于該飼養(yǎng)方法營養(yǎng)成分均明確可控，排除了不確定因素對實驗的影響，因此結(jié)果更加嚴(yán)謹(jǐn)可信。
權(quán)利要求
1.一種評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性的大型蚤飼養(yǎng)方法，其特征在于培養(yǎng)液配制294. Omg · L^1CaCl2 ；123. 2mg · L-1MgSCM ；64. 8mg · L_1NaHC03 ；6. 3mg · I^1KCL,新配制的培養(yǎng)液 pH 為 7· 8 ± 0· 2，硬度 250 ± 25mg · Γ1 (以 CaC03 計)。
2.一種評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性的大型蚤飼養(yǎng)方法，其特征在于米粉溶液配制將水稻種子去殼后，用粉碎機充分打碎后過125目篩子，使米粉顆粒直徑小于lOOum，稱取過篩后的粉末，用培養(yǎng)液配置成濃度分別為O. 8g · L'I. 2g · L'l. 6g · Γ1的米粉懸浮液，均一后分裝至IOml滅菌離心管內(nèi)，4°C儲存?zhèn)溆谩?br> 3.一種評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性的大型蚤飼養(yǎng)方法，其特征在于實驗蚤在溫度為22± 1°C,光強為60 μ mol m-2s_l,光暗比為16h : 8h的恒溫培養(yǎng)室50ml燒杯中培養(yǎng),每杯加40ml培養(yǎng)液。
4.一種評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性的大型蚤飼養(yǎng)方法，其特征在于每日添加米粉溶液lOOul，培養(yǎng)過程中每天定時清理雜物并將新生小水蚤移出，每3天更換培養(yǎng)液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種水生生物大型蚤的飼養(yǎng)方法，屬昆蟲飼養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)大型蚤毒理實驗技術(shù)的缺陷，建立了一套純稻米飼養(yǎng)大型蚤的方法，包括營養(yǎng)液配置，米粉溶液配置，幼蚤的飼養(yǎng)和收集。本發(fā)明使用純稻米飼養(yǎng)大型蚤，克服了常規(guī)方法中大型蚤選擇性攝取綠藻等天然食物而不取食或很少取食稻米的缺陷；且消除了因綠藻營養(yǎng)成分不確定而易影響實驗結(jié)果的不利因素，為評價轉(zhuǎn)基因水稻安全性提供了可靠的實驗保障。
文檔編號A01K67/033GK102948399SQ20121010698
公開日2013年3月6日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月13日
發(fā)明者劉標(biāo), 方志翔, 張莉, 孟軍, 沈文靜 申請人:環(huán)境保護部南京環(huán)境科學(xué)研究所