專利名稱：光合作用相關(guān)蛋白atctpa2的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種光合作用相關(guān)蛋白ATCTPA2的應用。
背景技術(shù)：
光合作用即綠色植物、藻類和光合細菌利用太陽能把二氧化碳和水合成為富能的有機化合物的過程。葉綠體是綠色植物和藻類進行光合作用的細胞器。高等植物中的葉綠體進化出的基質(zhì)和基粒片層結(jié)構(gòu)是光合作用發(fā)生的主要位點。在這類片層膜上集聚了進行光合作用電子傳遞的四大復合體，即光系統(tǒng)I、光系統(tǒng)II、細胞色素b6f和ATP酶復合體。在這四大復合體中，光系統(tǒng)II是電子傳遞鏈中的第一個起作用的復合體，而在該復合體中， 組成該復合體的由PsbA基因編碼的核心蛋白Dl又是一種非常重要的直接與反應中心色素即葉綠素a相互作用的蛋白。Dl蛋白在植物遭受光抑制的過程中存在一個快速的修復再生機制，可在一定程度上保護植物體免受強光的損傷。已知Dl蛋白是以前體形式合成的，即光合生物先合成前體D1，然后再通過蛋白酶的剪切使得前體Dl的C端的9-16個氨基酸序列被切下，Dl蛋白隨即成為成熟的蛋白參與光合電子傳遞等一系列過程。加工Dl前體的蛋白酶被稱為C末端加工蛋白酶，簡稱CtpA。該酶在高等植物如菠菜和大豆中都已經(jīng)被成功克隆，但是到目前為止卻并沒有見到擬南芥中真正的CtpA酶的相關(guān)報道。然而，作為一種模式生物，研究擬南芥中的CtpA無疑會讓我們更好地理解高等植物體中的光合作用，同時也為提高光合產(chǎn)率、研發(fā)優(yōu)質(zhì)的生物能源材料起到潛在的不容忽視的作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供ATCTPA2蛋白或其編碼基因在改善和/或保護植物光系統(tǒng)II光合功能中的應用。本發(fā)明提供了 ATCTPA2蛋白或其編碼基因在改善和/或保護植物光系統(tǒng)II光合功能中的應用；所述ATCTPA2蛋白是如下I)或2)蛋白I)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。所述應用為將所述AtctpA2蛋白的編碼基因?qū)胗捎贏TCTPA2表達降低而表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體，得到表現(xiàn)為綠化苗的植物。所述表現(xiàn)為綠化苗的植物的反應光系統(tǒng)II功能的PAM曲線(圖10)以及反應光系統(tǒng)I功能的P700曲線(圖11)都恢復正常，類似于野生型的。上述應用中，所述表現(xiàn)為綠化苗的植物的葉綠素的含量高于所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體；
上述應用中,所述葉綠素具體為葉綠素a和/或葉綠素b。
上述應用中，所述ATCTPA2蛋白的編碼基因為(1)-(4)中任意一種DNA分子(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)序列表中序列I自5’末端第1-1545位核苷酸；
(3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的 DNA分子；(4)與(I)或⑵限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、 至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有 98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。上述應用中，所述ATCTPA2蛋白的編碼基因通過重組表達載體導入所述植物突變體中。上述重組表達載體為將ATCTPA2蛋白的編碼基因插入pCAMbial301載體Nco I和 BglII酶切位點間得到的載體。上述應用中，所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。上述應用中，所述雙子葉植物為擬南芥。上述應用中，所述植物突變體為純合株系，為salk_056011。上述ATCTPA2蛋白或其編碼基因在將表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體恢復為表現(xiàn)為綠化苗的植物中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應用中，所述恢復為表現(xiàn)為綠化苗的植物具體體現(xiàn)在其葉綠素的含量高于所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體；所述葉綠素進一步具體為葉綠素a和/或葉綠素b ;所述植物突變體進一步具體為純合擬南芥株系，為salk_056011。上述ATCTPA2蛋白或其編碼基因在提高表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體葉綠素a和/ 或葉綠素b含量中的應用也是本發(fā)明保護的范圍。上述應用中，所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體是由于ATCTPA2表達降低引起的； 所述植物突變體進一步具體為純合擬南芥株系，為salk_056011。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一種與光合作用相關(guān)的蛋白 ATCTPA2，其可以使ATCTPA2表達降低的擬南芥突變體的黃化苗恢復為綠苗，且光系統(tǒng)II和光系統(tǒng)I的功能都恢復到了正常的水平。


圖I為T-DNA插入的突變純合體的表型圖2為DNA水平上鑒定T-DNA插入突變體圖3為T-DNA插入位點示意4為突變體RNA水平的鑒定圖5為77K熒光光譜6為快速葉綠素熒光動力學分析圖7為免疫印跡結(jié)果分析圖8為Dl的免疫印跡檢測圖9為互補轉(zhuǎn)基因擬南芥的表型及蛋白研究圖10為互補轉(zhuǎn)基因擬南芥的葉綠素熒光慢誘導曲線圖
圖11為互補轉(zhuǎn)基因擬南芥的P·圖
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實施例I、基因功能的發(fā)現(xiàn)過程
I、突變體材料的鑒定從美國ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)購買了定位于葉綠體的核編碼基因At4gl7740的T-DNA插入的突變純合體(salk_056011)，據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)域及序列比對發(fā)現(xiàn)，該基因可能就是擬南芥中編碼CtpA的基因，命名為AtctpA2，編碼的蛋白命名為ATCTPA2。T-DNA插入的突變純合體和野生型擬南芥(ABRC庫中訂購的，Col-O型)在MS培養(yǎng)基上生長，生長光強為40±5μπιΟ1 · m_2 · s—1，結(jié)果如圖I所示，左為野生型擬南芥(WT)，右為T-DNA插入的突變純合體(AtctpA2)，發(fā)現(xiàn)與野生型擬南芥相比，T-DNA插入的突變純合體的子葉泛黃，真葉淺綠色，植株矮小。2周后將T-DNA插入的突變純合體移至營養(yǎng)土中繼續(xù)培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)其致死。說明T-DNA插入的突變純合體是無法光合自養(yǎng)的。分別檢測T-DNA插入的突變純合體和野生型擬南芥中葉綠素含量，結(jié)果如表I所示，從表I看出，與野生型擬南芥相比，T-DNA插入的突變純合體無論是葉綠素a還是葉綠素b的含量均有不同程度的下降(表I)。表I野生型和突變體中的葉綠素含量分析
Chl (Hg/g FW) Chl b (Hg/g FW) Chl a+b (Hg/g FW) Chl a/b (Hg/g FW)
T-DNAiiA288. 04±19. 83 121. 49 + 15. 62 409. 53±22. 312. 37±0. 02
的突變純
合體 ____
_ 野生型擬1566. 40 + 72. 41518. 78 + 20. 87 2085. 18 + 75. 453. 02 + 0. 04
南芥2、RNA水平及蛋白水平上的鑒定分析T-DNA插入的突變純合體的插入位點發(fā)現(xiàn)，T-DNA插在了該基因編碼序列的啟動子ATG上游的-39到-40之間(圖2，圖3)。圖2為編號1、2和3為隨機選定的幾顆有表型的T-DNA插入的突變純合體的苗子，WT為野生型擬南芥，圖3為T-DNA插入位點示意圖。RNA水平上的分析結(jié)果表明，該插入造成了 RNA轉(zhuǎn)錄的下調(diào)(圖4，a為22個循環(huán)，b為25個循環(huán)，c為30個循環(huán)，d為38個循環(huán)。AtctpA2為T-DNA插入的突變純合體，WT為野生型擬南芥)。另外，根據(jù)該基因產(chǎn)物的一段多肽設計了抗體，并用該抗體對其進行了檢測，發(fā)現(xiàn)在突變體中幾乎檢測不到該蛋白的表達(圖9c)，這表明該蛋白的表達在很大程度上被抑制了。
3、葉綠素熒光參數(shù)的分析77K檢測結(jié)果如圖5所示，表明突變體的峰型沒有多大變化，但是峰高均發(fā)生了藍移(圖5)，這表明突變體的光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II都受到了不同程度的損傷。進一步對葉綠素熒光誘導動力學分析后發(fā)現(xiàn)，在Qa之前的電子傳遞受到了損傷， 即在光系統(tǒng)II氧化側(cè)的電子傳遞出現(xiàn)了問題(圖6，其中DCMU阻斷Qa到Qb的電子傳遞)。4、免疫印跡檢測結(jié)果為了更深入地了解光系統(tǒng)I和光系統(tǒng)II具體的蛋白表達的變化，進行了免疫印跡檢測。檢測后發(fā)現(xiàn)，光系統(tǒng)II的核心蛋白含量均有非常嚴重的下降(圖7)。更為重要的是，與野生型相比，突變體中的前體Dl明顯比野生型中有多得多的累積(圖8)，這表明在突變體中Dl蛋白的加工過程很可能出現(xiàn)了問題。5、結(jié)論通過對擬南芥突變體的生理生化功能進行研究，現(xiàn)核基因atctpa2編碼的 ATCTPA2是參與光合作用的重要蛋白分子，該蛋白很可能參與了 Dl前體的加工剪切，而Dl 前體的加工是光合作用正常運轉(zhuǎn)所必需的，因此，該基因可能具有重要的應用價值。實施例2、轉(zhuǎn)基因互補實驗一、atctpa2基因的猶得atctpa2基因的核苷酸序列為序列表中的序列1，根據(jù)l_1545bp之間的序列設計引物，從擬南芥(Col-O生態(tài)型，購自擬南芥生物資源中心)基因組中擴出基因。所用引物如下Former :5，CATGCCATGGAGGTCCTTGCGAGCT 3，，Reverse :5，GAAGATCTTCATCTAGAAAAAAG TAGGCCTTGA 3’。擴增產(chǎn)物經(jīng)切膠純化后連接到pEASY_T3載體上，轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5CI，篩選陽性克隆，進行PCR、酶切、測序鑒定。測序結(jié)果表明其核苷酸序列為序列表中序列I自5’末端第1-1545位核苷酸，命名為atctpa2，可編碼序列2 中所示的蛋白，將該蛋白命名為ATCTPA2，將含有該片段的載體命名為pEASY-T3-atctpa2。二、重組載體、重組農(nóng)桿菌的構(gòu)建將pEASY-T3_atctpa2經(jīng)Nco I和BglII酶切后克隆到經(jīng)過同樣酶切的 pCAMbial301(Cambia研究機構(gòu),也可購自上海希匹吉生物技術(shù)有限公司，)載體中，轉(zhuǎn)入大腸桿菌，得到轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用基因擴增引物進行PCR擴增及Nco I和BglII雙酶切鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒命名為pCAMbial301_atctpa2(得到1550bp為陽性)。將上述pCAMbial301_atctpa2 轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株 GV3101 (Biovector Co. , LTD), 得到重組菌，用基因擴增引物進行PCR鑒定，將含有陽性質(zhì)粒的重組菌命名為GV3101/ pCAMbial301_atctpa2。三、轉(zhuǎn)基因互補實驗1、轉(zhuǎn)基因互補擬南芥的獲得突變體純合體不能自養(yǎng)，采用花粉浸染法將構(gòu)建好的含有重組載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到T-DNA插入的雜合體植株(salk_056011)中，具體步驟如下將上述GV3101/pCAMbial301_atctpa2活化以后，用轉(zhuǎn)化緩沖液(5%蔗糖，0. 02% 的Silwet L-77,無菌水定容)充分懸浮菌體后,將準備好的擬南芥雜合體植株剪去已經(jīng)開放的花，浸入轉(zhuǎn)化緩沖液中50s，取出保濕側(cè)放，暗培養(yǎng)24h后，弱光下培養(yǎng)至種子成熟，收集種子進行純合系的篩選，得到Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥種子。收 集Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥種子經(jīng)表面滅菌后均勻地播灑于含40 μ g/ml潮霉素的MS固體培養(yǎng)板上，230C，100 μ mol · m_2 · s—1光強下生長2周后得到Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥植株。以未轉(zhuǎn)基因的T-DNA插入雜合體植株(salk_056011)為對照。觀察Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗，結(jié)果如圖9a所示，Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗明顯較大，較綠的為陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗。采用同樣的方法將空載體pCAMbial301導入T-DNA插入的雜合體植株(salk_056011)中，得到Ttl轉(zhuǎn)pCAMbial301擬南芥幼苗，按照上述方法觀察，T0轉(zhuǎn)pCAMbial301擬南芥幼苗和未轉(zhuǎn)基因的T-DNA插入雜合體植株(salk_056011)結(jié)果無顯著差異，從而進一步證明了 AtctpA2蛋白可以改善和/或保護植物光系統(tǒng)II光合功能。2、轉(zhuǎn)基因互補擬南芥的表型觀察將上述2周大小的陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗(AtctpA2c0m)和野生型擬南芥(WT) —并移入土中生長，經(jīng)鑒定背景為插入純合體的互補苗與野生型表型基本無異，結(jié)果如圖9b所示，這表明正是atctpa2單基因的突變造就了 salk_056011中純合突變體的表型，說明該基因?qū)胪蛔凅w后可以是黃化苗變綠，恢復突變前性狀，從而說明蛋白ATCTPA2能夠保護光系統(tǒng)II的正常光合功能。3、轉(zhuǎn)基因互補擬南芥的蛋白水平研究分別提取陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗(com)、野生型擬南芥(WT)和T-DNA插入純合體植株(AtctpA2)的全蛋白，統(tǒng)一定量到3.5 μ g/ul，上樣量90 μ g，跑15%的SDS-Urea-PAGE，待溴酚藍到達電泳前沿后，180mA電轉(zhuǎn)膜I. 5h。室溫封閉Ih后以I : 1000的比例加入制備的ATCTPA2—抗(氨基酸序列為序列2)，4°C搖床過夜。次日上午洗掉未結(jié)合的一抗，再加入I : 10000的山羊抗兔的二抗(購自中杉金橋生物公司)室溫搖床結(jié)合2h，然后洗掉未結(jié)合的二抗，發(fā)光。結(jié)果如圖9c所示，1/2WT、1/4WT、WT分別代表22. 5 μ g的野生型蛋白、45 μ g的野生型蛋白以及90 μ g的野生型蛋白上樣量，AtctpA2代表90 μ g的純合突變體蛋白上樣量，可以看出，雖然RNA水平檢測為knock-down表型，但是突變體中該蛋白的表達在如此大的上樣量時仍不可見。圖9d為互補后的蛋白水平的檢測，上樣量為135μ8，1/2ΙΤ、1/4ΙΤ、WT分別代表33. 75 Ug野生型蛋白、67. 5 μ g野生型蛋白以及135 μ g野生型蛋白的上樣量，AtctpA2代表135μ g純合突變體的上樣量，AtctpA2c0m代表135 μ g互補陽性苗的上樣量。具體的方法同9c?？梢钥闯?，互補后的株系中該蛋白的表達量與WT中的基本相同。4、光系統(tǒng)II功能的研究利用PAM-2100 (Walz)對陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗(AtctpA2com)、野生型擬南芥(WT)和T-DNA插入純合體植株(AtctpA2)進行了 PAM曲線的測定。4周大小的葉片經(jīng)暗適應30min后，先給一個照射測量光(避免進行光化學反應)，經(jīng)過2min，熒光水平穩(wěn)定后得到熒光參數(shù)Fo。再給一個脈沖飽和光，單脈沖結(jié)束后即得到熒光參數(shù)Fm，即光系統(tǒng)II的最大光化學效率。結(jié)果如圖10所示，由圖可知，互補之后的陽性苗Fv/Fm達到了 0. 83，與野生型基本無差異，而互補之前的T-DNA插入純合體植株的光系統(tǒng)II的功能嚴重受阻，因為Fv/Fm只有0. 34。這說明純合突變體中光系統(tǒng)II功能的損傷的確是由該基因的突變造成的。
5、光系統(tǒng)I的功能的研究在光合電子傳遞鏈中，光系統(tǒng)I位于光系統(tǒng)II的下游。為了進一步確定該基因的突變是直接造成了光系統(tǒng)II功能的缺失，對光系統(tǒng)I的功能也進行了測定。反應光系統(tǒng)I功能的光合參數(shù)之一便是P7Citi的還原態(tài)。P■的還原態(tài)使用PAM 101及其附件 ED-800T (Walz)測定。將陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗(AtctpA2c0m)、野生型擬南芥(WT) 和T-DNA插入純合體植株(AtctpA2)的4周大小的等葉面積的葉片先暗適應30min,然后給一個30s的可以氧化P700的遠紅外(720nm, 0. 66 u mo I mH ,導致P700在820nm處的吸收值上升。上升的幅度反應的便是光系統(tǒng)I功能的正常與否。結(jié)果如圖11所示，由圖可以看出，純合突變體中的光系統(tǒng)I的功能也受到了很大程度的損傷，而互補后的株系的光系統(tǒng)I的功能與野生型基本無異。
6、葉綠素的含量的檢測取陽性Ttl轉(zhuǎn)基因互補擬南芥幼苗(AtctpA2com)和T-DNA插入純合體植株 (AtctpA2)的新鮮葉片各80mg，浸沒于裝有8ml 80%丙酮的試管中，室溫避光放置IOh以上，至葉片脫色至白色。離心取上清，用分光光度計DU-800 (Beckman)測定663. 2和664. 8nm 處的吸光值。含量按照以下公式計算，單位為Ug/g FW葉綠素a 濃度(u g/g Fff) = 12. 21 X OD663.2-2 . 81 XOD64a8葉綠素b 濃度(U g/g Fff) = 20. 13 X OD646.2-5 . 03 X OD663.8葉綠素a+b 濃度(U g/g Fff) = 7. 18X0D663 2+17 . 32 X OD646 8實驗重復三次，結(jié)果取平均值土標準差。結(jié)果如表2所示表2互補型和突變體中的葉綠素含量分析
權(quán)利要求
1.ATCTPA2蛋白或其編碼基因在改善和/或保護植物光系統(tǒng)II光合功能中的應用； 所述ATCTPA2蛋白是如下I)或2)蛋白 .1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； .2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由I)衍生的蛋白質(zhì)。
2.如權(quán)利要求I所述的應用，其特征在于 所述應用為將所述ATCTPA2蛋白的編碼基因?qū)胗捎贏TCTPA2表達降低而表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體，得到表現(xiàn)為綠化苗的植物。
3.如權(quán)利要求I或2所述的應用，其特征在于 所述表現(xiàn)為綠化苗的植物的葉綠素的含量高于所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體； 所述葉綠素具體為葉綠素a和/或葉綠素b。
4.如權(quán)利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于 所述ATCTPA2蛋白的編碼基因如下(1)-(4)中任意一種DNA分子 (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)序列表中序列I自5’末端第1-1545位核苷酸； (3)在嚴格條件下與(I)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子; (4)與(I)或(2)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且編碼具有相同功能蛋白的DNA分子。
5.如權(quán)利要求1-4中任一所述的應用,其特征在于 所述ATCTPA2蛋白的編碼基因通過重組表達載體導入所述植物突變體中。
6.如權(quán)利要求1-5中任一所述的應用，其特征在于 所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。
7.如權(quán)利要求1-6中任一所述的應用，其特征在于 所述雙子葉植物為擬南芥。
8.如權(quán)利要求1-7中任一所述的應用，其特征在于所述植物突變體為純合株系。
9.所述ATCTPA2蛋白或其編碼基因在將表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體恢復為表現(xiàn)為綠化苗的植物中的應用；所述恢復為表現(xiàn)為綠化苗的植物具體體現(xiàn)在其葉綠素的含量高于所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體；所述葉綠素進一步具體為葉綠素a和/或葉綠素b ;所述植物突變體進一步具體為純合擬南芥株系。
10.所述ATCTPA2蛋白或其編碼基因在提高表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體的葉綠素a和/或葉綠素b含量中的應用；所述表現(xiàn)為黃化苗的植物突變體具體為純合擬南芥株系。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種光合作用相關(guān)蛋白ATCTPA2的應用。本發(fā)明提供了ATCTPA2蛋白的編碼基因在保護植物光系統(tǒng)II光合功能中的應用。所述ATCTPA2蛋白是如下1)或2)蛋白1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)將序列表中序列2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與1)活性相同的由1)衍生的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了一種與光合作用相關(guān)的蛋白ATCTPA2，其可以使ATCTPA2表達降低的擬南芥突變體的黃化苗恢復為綠色苗。
文檔編號A01H5/00GK102618520SQ20121008425
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者丁順華, 盧從明, 盧慶陶, 尹燕, 張愛紅, 楊志攀, 楊輝霞, 溫曉剛, 雷明 申請人:中國科學院植物研究所