專利名稱：Nf-ya6蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種NF-YA6蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
脂肪酸是生物體內(nèi)主要的能量儲存形式，其主要衍生物甘油三脂 (triacylglycerol,TAG)可在動物的脂肪組織、植物種子或果實(shí)中大量儲藏。其中，植物油作為食用油和一種重要的可再生能源物質(zhì)而備受關(guān)注。甘油三脂是脂肪酸和甘油化合而成的天然高分子化合物。甘油三脂合成的過程包括脂肪酸在質(zhì)體中的從頭合成過程、在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的修飾過程和甘油三脂的組裝過程。在植物體內(nèi)，脂肪酸的從頭合成(FAS)是在質(zhì)體內(nèi)進(jìn)行的。脂肪酸合成的前體是乙酰CoA(acetyl-CoA)。它首先在乙酰CoA羧化酶(acetyl coenzyme A carboxylase, ACCase)作用下合成丙二酸 CoA(malonyl-CoA),然后脂肪酸合成酶以丙二酰CoA為底物進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)，以每次循環(huán)增加兩個(gè)碳的頻率合成?；兼?，最后合成16至18碳的飽和脂肪酸。在質(zhì)體內(nèi)合成的游離脂肪酸被活化后運(yùn)輸?shù)絻?nèi)質(zhì)網(wǎng)，進(jìn)行進(jìn)一步的修飾(去飽和，脫氫，延長等)，最后形成甘油脂和膜脂。植物種子中TAG 的生物合成是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行的。TAG合成的前體是甘油-3-磷酸和脂酰CoA，合成的過程共需要三種?；D(zhuǎn)移酶和一種磷酸水解酶，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)，溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶(LPAT)，二脂酰甘油?；D(zhuǎn)移酶(DGAT)和磷脂磷酸水解酶(PAPase) (Barron等，Biochim Biophys Acta,60 :329-337)。TAG的極性很低，因此能夠使油脂在脂肪體內(nèi)不斷積累。目前，已發(fā)現(xiàn)的參與植物脂肪酸代謝調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子有WRI1、LEC1、FUS3和 LEC2 等(Focks 等，1998, Plant Physiology,18 :91-101 ；Santos Mendoza 等，2005， FEBS Letter,579 :4666-4670 ；ffang 等，2007， Planta，226:773-783 ；Mu 等，2008， Plant Physiology, 148 :1042-1054)。其中，WRIl編碼一個(gè)AP2/EREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白，它可能是植物體內(nèi)由鹿糖向TAG轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子(Cernac等,2004, Plant Journal,40 575-585)。LECl屬于能結(jié)合啟動子中順式作用元件CCAAT盒的一類轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控胚胎的發(fā)生與種子成熟，同時(shí)可能對胚胎形成過程中胚胎儲存物的積累進(jìn)行調(diào)控(Lotan等， 1998， Cell,1998,93(7) :1195-1205 ;To 等，2006, The Plant Cell,18(7) :1642-1651)。 過量表達(dá)LECl能大幅度增加轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗中的脂肪酸含量(Mu等，2008，Plant Physiology, 148 =1042-1054)。FUS3和LEC2都是編碼了一個(gè)B3家族的轉(zhuǎn)錄因子，它們都是胚胎發(fā)育過程中的重要調(diào)控基因(Reidt等，2000, Plant Journal, 21 :401-408 ;Stone等， 2001, Proc Natl Acad Sci 98:11806-11811)。fus3 和 lec2 突變體的種子中，油脂含量都顯著降低(Wang等，2007,Planta, 226 :773-783 ；Santos Mendoza等，2008,Plant Journal, 54 :608-620);過量表達(dá)FUS3和LEC2，都能使轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的油脂含量增加(Santos Mendoza 等，2005，F(xiàn)EBS Letter, 579 :4666-4670 ;Wang 等，2007，Planta，226 :773-783)。上述研究表明，在植物種子成熟過程中油脂積累的調(diào)控很大程度上是依賴胚胎發(fā)生過程中的重要調(diào)控因子來調(diào)控的。在擬南芥基因組中，編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因占了很大一部分，至少有1500個(gè)，占整個(gè)基因組的5%以上(Riechmann等，2000，Science，290 :2110-2113)。這些轉(zhuǎn)錄因子大多屬于大的基因家族，有的基因家族又包括許多亞族，而且有些轉(zhuǎn)錄因子家族是植物所特有的。對轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果表明，一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可能對一類相關(guān)性狀的很多基因?qū)嵤┱{(diào)節(jié)控制，從而有效改變植物的相關(guān)特性。CCAAT盒是一個(gè)廣泛存在于基因啟動子上的順式作用元件，與CCAAT序列結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子又稱為nuclear factor Y (NF-Y)或CCAAT binding factor (CBF)。NF-Y是一個(gè)由三種不同亞基構(gòu)成的異源三聚體復(fù)合物，它特異性地識別DNA 上的CCAAT序列，并與之結(jié)合，從而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。NF-Y的三種不同亞基分別屬于3個(gè)亞族NF-YA(又稱為 HAP2 或 CBF-B)，NF-YB (又稱為 HAP3 或 CBF-A)和 NF-YC (又稱為 HAP5 或CBF-C)。NF-YB和NF-YC的核心結(jié)構(gòu)域在序列上與組蛋白H2A和H2B有很高的同源性。 NF-YB/NF-YC形成一個(gè)緊密結(jié)合的異源二聚體復(fù)合物，NF-YA再結(jié)合在這個(gè)復(fù)合物的表面， 形成異源三聚體復(fù)合物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法。本發(fā)明提供的方法，為將NF-YA6蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；所述NF-YA6蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。上述方法為如下A或B :A為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因通過重組載體A導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物A ;所述轉(zhuǎn)基因植物A具有如下a-c中3種或至少一種或至少兩種特征a、所述轉(zhuǎn)基因植物的幼苗中脂肪酸含量高于所述目的植物山、所述轉(zhuǎn)基因植物A的植株生長受到抑制；c、 所述轉(zhuǎn)基因植物A植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞；B為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因通過重組載體B導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物B ;所述轉(zhuǎn)基因植物B具有如下c和d中2種或任一一種特征c、所述轉(zhuǎn)基因植物B的種子中脂肪酸含量高于所述目的植物；d、所述轉(zhuǎn)基因植物B的種子顆粒大于所述目的植物；上述重組載體A為將NF-YA6蛋白的編碼基因插入PERlO的XhoI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體； 上述重組載體B為將NF-YA6蛋白的編碼基因插入pBA002的XhoI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體；所述NF-YA6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3。在上述方法中，所述脂肪酸為棕櫚酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:l)、亞油酸(C18:2)、亞麻酸(C18:3)和/或二十碳烯酸(C20:l)。在上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物A的植株生長受到抑制體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物A 的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物A植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物A的根或下胚軸均大于所述目的植物。在上述方法中，上述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。在上述方法中，所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。在本發(fā)明的實(shí)施例中具體用的是擬南芥。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種重組載體。本發(fā)明提供了一種重組載體，為如下I)或2):I)將NF-YA6蛋白的編碼基因插入PERlO的XhoI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體；
2)將NF-YA6蛋白的編碼基因插入pBA002的XhoI和SpeI位點(diǎn)間得到的載體。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了將一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA6 的編碼基因?qū)霐M南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型中，得到轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子可用于調(diào)控植物體內(nèi)脂肪酸代謝，實(shí)驗(yàn)證明，NF-YA6轉(zhuǎn)基因擬南芥體內(nèi)，不僅能夠使植物幼苗中的脂肪酸含量得到顯著提高，而且能夠使轉(zhuǎn)基因植物單粒種子中的油脂含量得到顯著提高。本發(fā)明的轉(zhuǎn)錄因子及其編碼基因?qū)τ谥参镏舅岽x分子機(jī)制的研究，以及通過生物技術(shù)來提高植物(特別是油料作物)的脂肪酸含量及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用和市場前景。本發(fā)明在研究過程中， 發(fā)現(xiàn)了 NF-YA6在植物種子發(fā)育過程中對油脂積累的調(diào)控作用。通過以NF-YA6為靶點(diǎn)基因的遺傳操作可以有效地提高轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的脂肪酸含量。


圖I為NF-YA6的基因結(jié)構(gòu)框架圖其中，黑色方框表示外顯子，灰色方框表示5 ‘和3’非編碼區(qū)，直線表示內(nèi)含子。 ATG和TGA分別表示基因的起始密碼和終止密碼圖2為pER10-NF-YA6轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)一周后的表型圖3為pER10-NF-YA6轉(zhuǎn)基因植物萌發(fā)一周后的蘇丹紅染色圖4為pBA-NF-YA6轉(zhuǎn)基因植物的種子圖5為GS-MS檢測pER10_NF_YA6轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)的脂肪酸含量圖6為GS-MS檢測pBA_NF_YA6轉(zhuǎn)基因植物種子的脂肪酸含量
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例I、轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的獲得及表型鑒定一、轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的獲得I、調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因NF-YA6的克隆設(shè)計(jì)引物序列如下PI (上游引物)5，-CCCTCGAGATGCAAGAGTTCCATAGTAG-3 ’P2 (下游引物)5 ’ -AACCCGGGCATGAGGACTGAGACATGGT-3 ’用植物總RNA提取試劑盒(購自天根生物公司，目錄號DP432)并參照試劑盒說明書提取野生型擬南芥(Arabidopsis thaliana, Columbia生態(tài)型，購自美國擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC,產(chǎn)品編號為 CS28166。以下簡稱為野生型擬南芥)2周幼苗的總RNA,然后用SuperScript II Reverse Transcriptase試劑盒(購自全式金生物公司，目錄號AH301_02)并參照試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成其第一鏈cDNA，再以所合成的cDNA為模板，在引物Pl和P2的引導(dǎo)下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物。反應(yīng)結(jié)束后，對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收長度約927bp的目的片段并對其進(jìn)行純化，將其與經(jīng)過同樣酶切得到的pBluescript SK載體片段(可購自默克公司，產(chǎn)品目錄號為ST212205)連接，再將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli) DH5a感受態(tài)細(xì)胞(購自全式金生物公司，目錄號⑶201-03)，篩選陽性克隆，將其接種于含50mg/L氨芐青霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)12-16小時(shí)，提質(zhì)粒，得到含有回收片段的重組質(zhì)粒，命名為SK-NF-YA6，對其進(jìn)行測序，測序結(jié)果表明該質(zhì)粒含有的PCR產(chǎn)物的基因具有序列表中的序列2的核苷酸序列，由927個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-927位堿基，其編碼具有序列表中序列I的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。其中，序列表中序列2自5’端第522-585位堿基編碼蛋白-蛋白相互作用結(jié)構(gòu)域，自5’端第 618-678位堿基編碼DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。該質(zhì)粒為將序列表中的序列2插入pBluescript SK 載體中得到的重組載體。上述基因?qū)?yīng)的基因組序列具有序列表中序列3的核苷酸序列，由2022個(gè)堿基組成，自5'端第689-965位堿基為該基因組基因的第一個(gè)外顯子，自5'端第966-1065 位堿基為該基因組基因的第一個(gè)內(nèi)含子，自5'端第1066-1148位堿基為該基因組基因的第二個(gè)外顯子，自5'端第1149-1259位堿基為該基因組基因的第二個(gè)內(nèi)含子，自5'端第 1260-1340位堿基為該基因組基因的第三個(gè)外顯子，自5'端第1341-1420位堿基為該基因組基因的第三個(gè)內(nèi)含子，自5'端第1421-1591位堿基為該基因組基因的第四個(gè)外顯子，自 5'端第1592-1707位堿基為該基因組基因的第四個(gè)內(nèi)含子，自5'端第1708-2022位堿基為該基因組基因的第五個(gè)外顯子，自5'端第1-688位堿基為該基因組基因的5’非編碼區(qū) (UTR)。該基因的框架結(jié)構(gòu)見圖1，將該基因命名為Nuclear Factor YA6 (簡稱NF-YA6)，將其編碼蛋白命名為Nuclear Factor YA6 (簡稱NF-YA6)。2、含NF-YA6的植物誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶Xho I和Spe I對上述I構(gòu)建的質(zhì)粒SK_NF_YA6進(jìn)行雙酶切，對雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收長度約927bp的NF-YA6基因片段并對其進(jìn)行純化，然后連接到與經(jīng)相同酶雙酶切的載體PER10連接，得到連接產(chǎn)物。PER10是一個(gè)有雌二醇誘導(dǎo)的植物表達(dá)載體，記載在Applications of Chemical-Inducible Expression Systems in Functional Genomics and Biotechnology,Nam-Hai Chua,Methods in Molecular Biology,323 (III),329-342,2006， 公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E. coli)DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆， 將其接種于含50mg/L潮霉素的5mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C、200rpm下培養(yǎng)16小時(shí)，提質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶Xho I和Spe I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果經(jīng)酶切獲得了 927bp DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再用引物Pl和P2做進(jìn)一步的PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了927bp的DNA片段，也與預(yù)期結(jié)果一致，再將該質(zhì)粒送去測序，結(jié)果為將序列表中的序列2插 A PERlO的Xho I和Spe I酶切位點(diǎn)間得到的載體，表明得到了插入序列及位置正確的含有的植物表達(dá)載體，命名為PER10-NF-YA6。3、轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的獲得將步驟2構(gòu)建的植物表達(dá)載體PER10-NF-YA6用電激法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞(購自BI0VECT0R CO.，LTD，產(chǎn)品貨號BI0VECT0R_375)，將其涂布于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的LB抗性平板上在28°C、150rpm下培養(yǎng)16小時(shí)，挑取長出的農(nóng)桿菌單菌落經(jīng)過用引物Pl和P2的PCR鑒定，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增得到了 927bp的DNA片段，說明為陽性重組農(nóng)桿菌，命名為GV3101/PER10-NF-YA6。再將GV3101/PER10-NF-YA6接種于含50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的20mLLB 液體培養(yǎng)基中在28°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)2天，然后，再按2%的接種量菌將菌液接種于含 50mg/L壯觀霉素和50mg/L利福平的300mL LB液體培養(yǎng)基中在28 V、150rpm下振蕩培養(yǎng) 18小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，5000rpm離心20分鐘收集菌體，再將菌體溶于250mL含有5%蔗糖的侵染液中，慢慢搖勻。最后，將菌液轉(zhuǎn)于250mL燒杯中，將已去掉花和果莢的野生型擬南芥倒置于燒杯中5分鐘，得到TO代轉(zhuǎn)NF-YA6植物。將上述陽性TO代轉(zhuǎn)NF-YA6植物進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，收獲種子，所得種子經(jīng)50mg/L卡那霉素篩選后得到20株Tl代轉(zhuǎn)NF-YA6植物。經(jīng)過自交，得到大約500株T2代轉(zhuǎn)NF-YA6 植物。二、轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的表型鑒定I、轉(zhuǎn) PER10-NF-YA6 植物的鑒定將步驟一獲得的編號為#3和#14的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥(PER10-NF-YA6)的 T2代種子播在含IOii M雌激素(17-P-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號E8875)的MS培養(yǎng)基上 (1/2MS，I %蔗糖，0. 8 %瓊脂)培養(yǎng)10天的幼苗提取全苗的RM,以野生型擬南芥作為對照。 反轉(zhuǎn)錄獲得 cDNA，用 Pl (上游引物):5’-CCCTCGAGATGCAAGAGTTCCATAGTAG-3’和 P2 (下游引物)5 ’ -AACCCGGGCATGAGGACTGAGACATGGT-3，進(jìn)行 RT-PCR，檢測了 NF-YA6 基因在 T2 代轉(zhuǎn)基因植物中的表達(dá)水平，以野生型擬南芥為對照，以Actin7為內(nèi)參，內(nèi)參的引物為ACTIN7F 5 ‘-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3’ 和 ACTIN7B :5 ‘-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3’。結(jié)果如圖2A所示，為RT-PCR技術(shù)檢測NF-YA6基因的表達(dá)水平，從圖中看出，與野生型擬南芥相比，編號為#3和#14的T2代轉(zhuǎn)PER10-NF-YA6擬南芥(PER10-NF-YA6)中NF-YA6基因的表達(dá)水平均具有不同程度地升高，說明編號為#3和#14的T2代轉(zhuǎn)PER10-NF-YA6擬南芥 (PER10-NF-YA6)為陽性的過表達(dá)擬南芥。2.轉(zhuǎn)PER10-NF-YA6植物的表型分析將上述鑒定為陽性的編號為#3和#14的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥(PER10-NF-YA6) 的種子播在含10 PM雌激素(17-0-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號E8875)的MS培養(yǎng)基上 (1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂)(其中，MS鹽、瓊脂和蔗糖購自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號M531、A7848和S391，)置于溫室中在22°C、光照強(qiáng)度80-120 y E-2S-1條件下培養(yǎng) 16小時(shí)，以野生型擬南芥作為對照。10天后，觀察T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥和野生型植株的生長情況，結(jié)果如圖2B所示， 可以看出，T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上生長10天時(shí)有明顯的生長抑制表型，具體表現(xiàn)為NF-YA6過表達(dá)植株矮小、子葉變小或不能正常發(fā)育、頂端分生組織的發(fā)育完全受阻，根的生長發(fā)育異常。同時(shí)，在T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的下胚軸和根部形成明顯的胚性組織，主要表現(xiàn)為根部和下胚軸顏色變綠，明顯膨大變粗。三、NF-YA6組成型表達(dá)轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得I、構(gòu)建NF-YA6基因組成型過量表達(dá)的重組表達(dá)載體將上述一得到的SK-NF-YA6經(jīng)過XhoI和SpeI酶切得到酶切產(chǎn)物與經(jīng)過同樣酶切的植物誘導(dǎo)表達(dá)載體 pBA002 (記載在 A GFP-mouse talin fusion protein labels plant actin filaments in vivo and visualizes the actin cytoskeleton in growing pollen tubes, Benedikt Kost, Pius Spielhofer, Nam-Hai Chua, The Plant Journal,16 (3), 393-401，1998，公眾可從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到克隆，在含有50毫克/升壯觀酶素的LB平板上37度培養(yǎng)16小時(shí)，最后篩選得到具有抗壯觀酶素抗性的克隆，提取該克隆的質(zhì)粒，送去測序，結(jié)果為將序列2插入 PBA002的XhoI和SpeI酶切位點(diǎn)間得到的質(zhì)粒，該質(zhì)粒命名為pBA_NF_YA6。2、轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥的獲得將上述獲得的pBA-NF-YA6轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (購自Biovector Co.，LTD,產(chǎn)品貨號Bi0Vect0r-375)，然后用花侵染轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥Col-O (購自美國擬南芥生物資源中心，The Arabidopsis Biological Resource Center, ABRC,產(chǎn)品編號為 CS28166,以下簡稱野生型擬南芥)的花序,通過除草劑Basta (50mg/L)篩選出10株Tl代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥，經(jīng)過擴(kuò)繁，得到約250株T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥。3、轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥的表型分析 分別將編號為#5、#6和#7的T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥(35S-NF-YA6)的種子播種在含有MS營養(yǎng)液(1/2MS，購自北京西美杰科技有限公司，產(chǎn)品貨號M531)上22度24小時(shí)光照培養(yǎng)，觀察植物的生長發(fā)育表型。觀察結(jié)果表明，用組成型啟動子驅(qū)動NF-YA6過量表達(dá)，對于苗期T2代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥的生長沒有明顯影響，觀察T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6 擬南芥所結(jié)的種子，發(fā)現(xiàn)在同樣的生長條件下，#5和#7號T2代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥所結(jié)的種子在形狀上更為飽滿，肉眼觀察這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因植物的種子顆粒較野生型種子更大一些 (圖 4)。實(shí)施例2、轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的脂肪酸代謝檢測及其機(jī)制研究一、蘇丹紅染色指示轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥體內(nèi)脂肪酸含量的變化蘇丹紅是一種能夠與種子特有的中性脂特異結(jié)合的染料，植物材料著色的深淺可以指示植物體內(nèi)中性脂的含量高低。將由實(shí)施例I的一得到T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥 (PER10-NF-YA6)與野生型擬南芥分別浸泡于I %蘇丹紅(Fat Red 7B) (Sigma，產(chǎn)品貨號 201161-8)，室溫(25°C )染色6小時(shí)，用去離子水清洗3遍，每遍30s，染色結(jié)果如圖3所示，在T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的根部、葉片和下胚軸處，蘇丹紅著色的程度明顯高于野生型植物，說明轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)形成胚性細(xì)胞，且胚性細(xì)胞中的種子特異的脂肪酸的積累量明顯高于野生型。二、GC-MS方法檢測轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥經(jīng)誘導(dǎo)后體內(nèi)各種脂肪酸組分的含量變化情況分別取由實(shí)施例I的一得到編號為3 (#3)和14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥和野生型擬南芥在誘導(dǎo)培養(yǎng)基(含10 μ M雌激素，17-β-Estradiol，Sigma，產(chǎn)品貨號E8875， 的MS培養(yǎng)基上(配方為1/2MS，1%蔗糖，0.8%瓊脂))中萌發(fā)后生長10天，各取O. I克植物整株幼苗，在液氮中研磨成干粉，然后轉(zhuǎn)移到帶密封蓋的試管中，加入3mL甲醇(含2. 5% (V/V)濃硫酸)，在80°C水浴加熱90分鐘，再加入4. 5mL 0.9% NaCl水溶液和ImL正己烷， 混勻，4000rpm離心10分鐘，收集正己烷相。真空抽干，用IOOul乙酸乙酯溶解，取Iul上樣,用PerkinElmer公司的TurboMass GC/MS儀分析各種脂肪酸組分的含量變化情況,所用 GC柱為30mX0. 25mmBPX-70柱，GC升溫程序?yàn)槌跏紲囟?20°C，保持I分鐘，再以每分鐘 10°C的速率升至150°C，然后以每分鐘4°C的速率升溫至230°C，保持10分鐘，以C17:0的三酯酰甘油(Sigma，貨號201161-8)作內(nèi)標(biāo)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。根據(jù)樣品質(zhì)譜出現(xiàn)的時(shí)間和分子量可以確定組分，根據(jù)質(zhì)譜峰圖的面積與內(nèi)標(biāo)的面積相比，可以計(jì)算含量。脂肪酸含量的計(jì)算公式是樣品含量=(樣品峰圖面積/內(nèi)標(biāo)峰圖面積)χ內(nèi)標(biāo)含量/樣品重量。結(jié)果如圖5所示，野生型和編號為3(#3)、14(#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的棕櫚酸(C16:0)的含量分別為 O. 56 μ g/mg、0. 91 μ g/mg、0. 95 μ g/mg ；野生型和編號為3 (#3)、14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的硬脂酸(C18:0)的含量分別為 O. 14 μ g/mg、0. 19 μ g/mg、0. 21 μ g/mg ；野生型和編號為3 (#3)、14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的油酸(C18:1)的含量分別為 O. 12 μ g/mg、I. 25 μ g/mg、I. 39 μ g/mg ；野生型和編號為3 (#3)、14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的亞油酸(C18:2)的含量分別為 O. 55 μ g/mg、2. 86 μ g/mg、3. 06 μ g/mg ；野生型和編號為3 (#3)、14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的亞麻酸(C18:3)的含量分別為 I. O μ g/mg、I. 4 μ g/mg、I. 5 μ g/mg ；野生型和編號為3 (#3)、14 (#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥的二十碳烯酸(C20:1) 的含量分別為 O μ g/mg、I. 04 μ g/mg、I. 11 μ g/mg ；從上述可以看出，與野生型擬南芥相比，編號為3(#3)和14(#14)的T2代轉(zhuǎn)NF-YA6擬南芥經(jīng)誘導(dǎo)后脂肪酸的各個(gè)組分含量都明顯上升，其中，C16:0分別升高了 62. 5% 和 69. 6% ；C18:0 分別升高了 35. 7 % 和 50% ；C18:1 分別升高了 941. 67 % 和 1058. 3% ;C18:2分別升高了 420%和456. 4% ;C18:3分別升高了 40%和50%。尤其值得注意的是，種子油脂中特有的C20:l在10天的野生型幼苗中是檢測不到的，但在轉(zhuǎn)基因植物中，該組分的含量分別達(dá)到了 I. 04 μ g/mg和I. 11 μ g/mg。同時(shí)，也檢測了組成型啟動子驅(qū)動NF-YA6過量表達(dá)的T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥的種子中的油脂含量，具體如下分別將在同樣生長條件下生長、同時(shí)期收獲的野生型、編號為#5、#6和#7的T3代轉(zhuǎn)pBA-NF-YA6擬南芥(從T2代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥收獲種子) 的種子各取50粒，用上述GS-MS方法檢測了每粒種子中的油脂含量。每粒種子脂肪酸含量的計(jì)算公式是樣品含量=(樣品峰圖面積/內(nèi)標(biāo)峰圖面積)X內(nèi)標(biāo)含量/種子總數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，結(jié)果取平均值。結(jié)果如圖6所示，野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的棕櫚酸(C16:0)的含量分別為O. 45 μ g、0. 67 μ g、0. 43 μ g和O. 55 μ g ;野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的硬脂酸(C18:0)的含量分別為 O. 29 μ g、0. 34 μ g、0. 27 μ g 和 O. 33 μ g ;野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的油酸(C18:l)的含量分別為 O. 75μ g、l. 29μ g、0. 76μ g和 I. 01 μ g ；野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的亞油酸(C18:2)的含量分別為 I. 45 μ gU. 76 μ gU. 43 yg 1.69yg；野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的亞麻酸(C18:3)的含量分別為 O. 81 μ g、0. 92 μ g、0. 78 μ g 和 0· 86 μ g ;野生型和編號為5 (#5)、6 (#6)和7 (#7)的T3代轉(zhuǎn)pBA_NF_YA6擬南芥每粒種子中的二十碳烯酸(C20:1)的含量分別為O. 87 μ g、I. 08 μ g、0. 83 μ g和0· 93 μ g ;在所檢測的3個(gè)轉(zhuǎn)基因系中，其中有2個(gè)轉(zhuǎn)基因系的單粒種子中的各種組分的油脂含量都顯著高于野生型，說明在植物或種子中過量表達(dá)該基因，可以有效地提高種子中的油脂含量。上述結(jié)果表明，NF-YA6是脂肪酸合成的正向調(diào)控因子，過量表達(dá)該基因可以顯著提高植物體內(nèi)的脂肪酸含量，如果在種子中過量表達(dá)該基因，可以顯著地增加種子中油脂含量。
權(quán)利要求
1.一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將NF-YA6蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；所述NF-YA6蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列I。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述方法為如下A或B :A為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因通過重組載體A導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物A ； 所述轉(zhuǎn)基因植物A具有如下a-c中3種或至少一種或至少兩種特征a、所述轉(zhuǎn)基因植物的幼苗中脂肪酸含量高于所述目的植物；b、所述轉(zhuǎn)基因植物A的植株生長受到抑制；c、所述轉(zhuǎn)基因植物A植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞；B為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因通過重組載體B導(dǎo)入目的植物，得到轉(zhuǎn)基因植物B ； 所述轉(zhuǎn)基因植物B具有如下c和d中2種或任一一種特征c、所述轉(zhuǎn)基因植物B的種子中脂肪酸含量高于所述目的植物；d、所述轉(zhuǎn)基因植物B的種子顆粒大于所述目的植物；所述重組載體A為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；所述重組載體B為將所述NF-YA6蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體；所述NF-YA6蛋白的編碼基因的核苷酸序列為序列表中的序列2或序列表中的序列3。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的方法，其特征在于所述脂肪酸為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、亞麻酸和/或二十碳烯酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)基因植物A的植株生長受到抑制體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物A的株高或子葉大小均小于所述目的植物；所述轉(zhuǎn)基因植物A植株的根部或下胚軸均形成胚性細(xì)胞體現(xiàn)在所述轉(zhuǎn)基因植物A的根或下胚軸均大于所述目的植物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于所述目的植物為雙子葉植物或單子葉植物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于所述雙子葉植物為擬南芥、油菜、花生、棉花、大豆、向日葵、棕櫚樹、橄欖樹、蓖麻、馬鈴薯或煙草；所述單子葉植物為水稻、玉米、小麥、大麥、燕麥、黑麥、高梁或草坪草。
7.—種重組載體，為如下I)或2)1)將所述NF-YA6蛋白的編碼基因插入PERlO中得到的載體；2)將所述NF-YA6蛋白的編碼基因插入PBA002中得到的載體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種NF-YA6蛋白及其編碼基因在培育脂肪酸含量提高的植物中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，為將NF-YA6蛋白的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，得到轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的脂肪酸含量高于所述目的植物；所述NF-YA6蛋白的氨基酸序列為序列表中的序列1。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明提供了將一個(gè)調(diào)控植物脂肪酸代謝的轉(zhuǎn)錄因子NF-YA6及其編碼基因?qū)霐M南芥(Arabidopsis thaliana)哥倫比亞生態(tài)型中，得到轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)錄因子可用于調(diào)控植物體內(nèi)和/或植物種子中的脂肪酸代謝。
文檔編號A01H5/00GK102604966SQ20121006581
公開日2012年7月25日 申請日期2012年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月13日
發(fā)明者左建儒, 牟金葉 申請人:中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所