專利名稱：一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法。
背景技術(shù)：
李砧瑪麗安娜無(wú)性砧是優(yōu)良半矮化砧木品種之一，其根系發(fā)達(dá)、產(chǎn)量高，成年樹(shù)相對(duì)矮小，適于密植和保護(hù)地栽培。同時(shí)對(duì)潮濕土壤適應(yīng)性強(qiáng)，對(duì)真菌引起的各類病害和線蟲(chóng)有較強(qiáng)抗性，是嫁接梨、扁桃、李子等的標(biāo)準(zhǔn)砧木，可以作為抗線蟲(chóng)砧木的首選品種。國(guó)內(nèi)核果類苗木繁殖和培育主在存在以下問(wèn)題(1)目前選擇的砧木主要以實(shí)生砧為主，例如陜甘山桃、山桃、毛桃等，具有較強(qiáng)的抗寒、抗旱、耐鹽堿能力，與油桃的嫁接親合性好等優(yōu)點(diǎn)。但樹(shù)體結(jié)果期偏晚，易受線蟲(chóng)、根癌病、根腐病和真菌的侵染；(2)育苗方式主要以常規(guī)的繁殖手段，常規(guī)的大田育苗勞動(dòng)強(qiáng)度大，育苗周期長(zhǎng)，受到自然環(huán)境影響大， 苗木的質(zhì)量不易保證，特別是在種子或插條等繁育材料緊缺的情況下，常規(guī)繁殖手段會(huì)受到極大的制約。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，旨在解決目前對(duì)李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的研究并不充分、全面以及采用常規(guī)的繁殖手段時(shí)，李砧瑪麗安娜的苗木質(zhì)量不能保證的問(wèn)題。本發(fā)明的目的在于提供一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，所述方法包括以下步驟準(zhǔn)備越冬枝條；以越冬的休眠枝條葉片為外植體；對(duì)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)篩選及對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)；對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選。本發(fā)明提供的用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，該方法根據(jù)植物葉片再生原理，首先準(zhǔn)備越冬的枝條，以越冬的休眠枝條的葉片為外植體，接種至培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)篩選，然后對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選，從而獲得了誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的最佳的激素配方，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，解決了采用常規(guī)的繁殖手段時(shí)，苗木質(zhì)量不能保證的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培技術(shù)系統(tǒng)地研究，為砧木的工廠化、 標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)?；a(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。


圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法的實(shí)現(xiàn)流程圖；圖2示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的越冬的休眠枝條處理培養(yǎng)為外植體的實(shí)現(xiàn)流程CN 102524079 A
圖；圖3示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行研究的實(shí)現(xiàn)方法的流程圖；圖4示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究的實(shí)現(xiàn)方法的流程圖。
具體實(shí)施例方式為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明， 并不用于限定發(fā)明。圖1示出了本發(fā)明實(shí)施例提供的用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法的實(shí)現(xiàn)流程。該方法包括以下步驟在步驟SlOl中，準(zhǔn)備越冬枝條；在步驟S102中，以越冬的休眠枝條葉片為外植體；在步驟S103中，對(duì)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)篩選及對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)；在步驟S104中，對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選。在本發(fā)明實(shí)施例中，準(zhǔn)備越冬枝條的實(shí)現(xiàn)方法在冬季來(lái)臨時(shí)剪下生長(zhǎng)健康植株的枝條埋于地下，并覆蓋土 5 6cm。如圖2所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，以越冬的休眠枝條葉片為外植體包括以下步驟在步驟S201中，次年開(kāi)春后將上年越冬的的枝條取出，去泥沙后以一芽一莖段剪下，插在培養(yǎng)土中，放在光照培養(yǎng)箱里；在步驟S202中，在溫度洸 下，每天3000L ux光照處理12小時(shí)，透氣1 2次，透氣時(shí)間視室外溫度而定；在步驟S203中，當(dāng)枝條的葉子展開(kāi)時(shí)，對(duì)外殖體的葉子進(jìn)行滅菌處理。在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)外殖體進(jìn)行滅菌的實(shí)現(xiàn)方法為先用75%酒精處理5 6s，然后用加有2 3滴吐溫的0. 1 %升汞消毒5 6min ；消毒后用無(wú)菌水沖洗5 6遍，每遍aiiin。如圖3所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行研究的實(shí)現(xiàn)方法的實(shí)現(xiàn)方法為在步驟S301中，在MS培養(yǎng)基中，加入不同濃度的NAA、6BA和2，4_D構(gòu)成12種激素配比的培養(yǎng)基；在步驟S302中，將消毒好的無(wú)菌外植體葉片切成0. 7cmX0. 7cm左右大小，分別接種在上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基接25瓶，每瓶5 6個(gè)；在步驟S303中，愈傷組織的誘導(dǎo)率的計(jì)算；在步驟S304中，根據(jù)誘導(dǎo)效果，確定最佳誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。在本發(fā)明實(shí)施例中，12種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比如下配比1 :1. 5mg/L NAA, 1. Omg/L 6-BA，1. 0mg/L2，4_D ；配比2 :1. 5mg/L NAA, 1. Omg/L 6_ΒΑ，0· 5mg/L2，4_D ；配比3 :1. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. 5mg/L 6-BA, 1. 0mg/L2，4_D ；
配比4 1. 5mg/L NAA,0. 5mg/L 6-BA，0. 5mg/L2，4-D ；配比5 :1. Omg/L NAA, 1. Omg/L 6-BA, 1. 0mg/L2，4_D ；配比6 :1. Omg/L NAA, 1. Omg/L 6_BA，0. 5mg/L2，4_D ；配比7 :1. Omg/L ΝΑΑ,Ο. 5mg/L 6-BA, 1. 0mg/L2，4_D ；配比8 :1. Omg/L NAA,0. 5mg/L 6-BA,0. 5mg/L2，4_D ；配比9 :0. 5mg/L NAA, 1. Omg/L 6-BA, 1. 0mg/L2，4_D ；配比10 :0. 5mg/L NAA, 1. Omg/L 6-BA,0. 5mg/L2，4_D ；配比11 :0. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. 5mg/L 6-BA, 1. 0mg/L2，4_D ；配比12 :0. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. 5mg/L 6_ΒΑ，0· 5mg/L2，4_D。如圖4所示，在本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選的實(shí)現(xiàn)方法為在步驟S401中，在1/2MS培養(yǎng)基中加入1. Og/L的活性炭，再添加IAA和6-BA配比構(gòu)成9種不同激素組合的生根培養(yǎng)基；在步驟S402中，將已長(zhǎng)成的愈傷組織在分化培養(yǎng)基MS+NAA0. 2 0. 5+6BA0. 5 1 培養(yǎng)后；在步驟S403中，分別轉(zhuǎn)接到上述不同配比激素組合的1/2MS培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接25瓶，每瓶5 6個(gè)；在步驟S404中，觀察生根條數(shù)和生根率，篩選生根培養(yǎng)基配方。在本發(fā)明實(shí)施例中，所述9種加入IAA和6-BA不同濃度組合的生根培養(yǎng)基如下配比1 0. 5mg/LIAA，0. lmg/L 6-BA ；配比2 :0. 5mg/LIAA,0. 3mg/L 6-BA ；配比3 :0. 5mg/LIAA,0. 5mg/L 6-BA ；配比4 :0. 3mg/LIAA，0. lmg/L 6-BA ；配比5 :0. 3mg/LIAA,0. 3mg/L 6-BA ；配比6 :0. 3mg/LIAA，0. 5mg/L 6-BA ；配比7 :0. lmg/LIAA，0. lmg/L 6-BA ；配比8 :0. lmg/LIAA，0. 3mg/L 6-BA ；配比 9 :0. lmg/LIAA，0. 5mg/L 6-BA。本發(fā)明實(shí)施例提供的用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，該方法根據(jù)植物葉片再生原理，首先準(zhǔn)備越冬的枝條，以越冬的休眠枝條的葉片為外植體，接種至培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基設(shè)計(jì)篩選，然后對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選，從而獲得了誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的最佳的激素配方，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，解決了采用常規(guī)的繁殖手段時(shí)，苗木質(zhì)量不能保證的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培技術(shù)系統(tǒng)地研究，為砧木的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。以上僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟準(zhǔn)備越冬枝條；以越冬的休眠枝條葉片為外植體； 對(duì)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)篩選及對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)； 對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述準(zhǔn)備越冬的休眠枝條實(shí)現(xiàn)方法為 在冬季來(lái)臨時(shí)剪下生長(zhǎng)健康植株的枝條埋于地下，并覆蓋土 5 6cm。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述以越冬的休眠枝條葉片為外植體包括以下步驟次年開(kāi)春后將上年越冬的的枝條取出，去泥沙后以一芽一莖段剪下，插在培養(yǎng)土中，放在光照培養(yǎng)箱里；在溫度沈 下，每天3000L ux光照處理12小時(shí)，透氣1 2次，透氣時(shí)間視室外溫度而定；當(dāng)枝條的葉子展開(kāi)時(shí)，對(duì)外殖體的葉子進(jìn)行滅菌處理。
4.如權(quán)利要求1或3所述的方法，其特征在于，所述對(duì)外殖體葉片進(jìn)行滅菌的實(shí)現(xiàn)方法為先用75%酒精處理5 6s，然后用加有2 3滴吐溫的0. 升汞消毒5 6min ； 消毒后用無(wú)菌水沖洗5 6遍，每遍aiiin。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的設(shè)計(jì)篩選的實(shí)現(xiàn)方法為在MS培養(yǎng)基中，加入不同濃度的NAA、6BA和2，4_D構(gòu)成12種激素配比的培養(yǎng)基； 將消毒好的無(wú)菌外植體葉片切成0. 7cmX0. 7cm左右大小，分別接種在上述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每種培養(yǎng)基接25瓶，每瓶5 6個(gè)； 愈傷組織的誘導(dǎo)率的計(jì)算方法為愈傷組織的誘導(dǎo)率％ =(形成愈傷組織外植體塊數(shù)/接種外植體塊數(shù))X 100 根據(jù)誘導(dǎo)效果，確定最佳誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述12種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比如下配比11.5mg/L NAA,1.Omg/L 6-BA,1.0mg/L2"I-D配比21.5mg/L NAA,1.Omg/L 6-BA，0.5mg/L2"I-D配比31.5mg/L ΝΑΑ,Ο.5mg/L 6-BA,1.0mg/L2"I-D配比41.5mg/L ΝΑΑ,Ο.5mg/L 6-BA，0.5mg/L2"I-D配比51.Omg/L NAA,1.Omg/L 6-BA,1.0mg/L2"I-D配比61.0mg/L NAA,1.Omg/L 6-BA，0.5mg/L2"I-D配比71.Omg/L ΝΑΑ,Ο.5mg/L 6-BA,1.0mg/L2"I-D配比81.Omg/L ΝΑΑ,Ο.5mg/L 6-BA，0.5mg/L2"I-D配比90.5mg/L NAA,1.Omg/L 6-BA,1.0mg/L2"I-D配比 10 :0. 5mg/L NAA, 1. Omg/L 6-BA,0. 5mg/L2，4_D ； 配比 11 :0. 5mg/L ΝΑΑ,Ο. 5mg/L 6-ΒΑ，1. 0mg/L2，4_D ；配比 12 0. 5mg/L NAA,0. 5mg/L 6-BA,0. 5mg/L2，4_D。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選的實(shí)現(xiàn)方法為在1/2MS培養(yǎng)基中加入1. Og/L的活性炭，再添加IAA和6-BA配比構(gòu)成9種不同激素組合的生根培養(yǎng)基；將已長(zhǎng)成的愈傷組織經(jīng)分化培養(yǎng)基MS+NAA0. 2 0. 5+6BA0. 5 1培養(yǎng)后，分別轉(zhuǎn)接到上述不同配比激素組合的1/2MS培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基接25瓶，每瓶5 6個(gè)； 觀察生根條數(shù)和生根率，篩選生根培養(yǎng)基配方。
8.如權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述9種加入IAA和6-BA不同濃度組合的生根培養(yǎng)基如下配比10.5mg/xLIAAjO.lmg/7L6--BA配比20.5mg/xLIAAjO.3mg/7L6--BA配比30.5mg/xLIAAjO.5mg/7L6--BA配比40.3mg/xLIAAjO.lmg/xL6--BA配比50.3mg/7LIAAjO.3mg/xL6--BA配比60.3mg/7LIAAjO.5mg/xL6--BA配比70.lmg/7LIAAjO.lmg/xL6--BA配比80.lmg/7LIAAjO.3mg/xL6--BA配比90.lmg/7LIAAjO.5mg/xL6--BA。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，提供了一種用于研究李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培的方法，該方法根據(jù)植物葉片再生原理，首先準(zhǔn)備越冬的枝條，以越冬的休眠枝條的葉片為外植體，接種至培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行設(shè)計(jì)篩選，然后對(duì)生根培養(yǎng)基進(jìn)行研究篩選，從而獲得了誘導(dǎo)培養(yǎng)基及生根培養(yǎng)基的最佳的激素配方，方法簡(jiǎn)單實(shí)用，解決了采用常規(guī)的繁殖手段時(shí)，苗木質(zhì)量不能保證的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)李砧瑪麗安娜無(wú)性砧組培技術(shù)系統(tǒng)地研究，為砧木的工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)模化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102524079SQ20121005730
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月7日
發(fā)明者吳坤, 王寧, 王方妹, 蔡妙珍, 黃文方 申請(qǐng)人:浙江師范大學(xué)