專利名稱：東亞砂蘚組織培養(yǎng)過程中配子體消毒方法
技術領域：
本發(fā)明屬于苔蘚植物組織培養(yǎng)技術，確切地說是涉及東亞砂蘚組織培養(yǎng)過程中配子體的消毒方法。
背景技術：
目前，苔蘚植物中的小立碗蘚在國外已成為研究植物分子生物學的理想實驗材料和研究基因功能的模式植物，土生墻蘚還成為研究耐旱蘚類生理生態(tài)和抗旱機理的主要模型。然而與之形成鮮明對比的是國內外有關于紫萼蘚科植物的研究報道在卻少之又少，為了填補這一空白，我們開展了東亞砂蘚配子體再生體系建立方法的課題研究，雖然整個研究過程都進展得比較順利，并取得了理想的實驗效果，然而在研究中我們也遇到了這樣一個問題，就是在我們的部分培養(yǎng)試驗中所得到的東亞砂蘚配子體再生體系很不穩(wěn)定，通過分析發(fā)現(xiàn)其主要原因是出在培養(yǎng)過程中的消毒環(huán)節(jié)。據(jù)此我們曾采用了許多種常規(guī)的消毒方法進行彌補，但是其效果都不夠理想，因為苔蘚植物的配子體與大多數(shù)高等植物不同，它是由單層細胞組成的，消毒不徹底染菌率高，消毒過度會褐化死亡，對消毒液的種類、濃度、 消毒時間等許多因素都很難把握。多年來有關用配子體作為實驗材料的報道之所以特別少見，苔蘚植物配子體的消毒困難顯然是其中的一個主要原因，通過長時間不斷的探索，我們終于取得了突破性的進展，本發(fā)明就是對于這項內容所做的具體總結。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種適合于東亞砂蘚配子體的消毒方法，以克服組織培養(yǎng)過程中無法利用孢子體、配子體消毒難的問題。本發(fā)明公開的東亞砂蘚組織培養(yǎng)過程中配子體的消毒方法按以下步驟
(1)取培養(yǎng)一段時間后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段，放到空的培養(yǎng)瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；
(2)用洗潔精溶液浸泡IOmin左右，于流水下沖洗30min左右，于無菌水中沖洗數(shù)次；
(3)在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0. 1%的升汞溶液中消毒 15s_60s ；
(4)用無菌水反復沖洗7-8次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于MS培養(yǎng)基上。所述方法中需挑選粗壯、長勢好的東亞砂蘚，剪成長度為0. 5-lcm的小段。所述方法中浸泡用的洗潔精溶液濃度為1%-洲。所述方法中滅菌處理用0. 02%的升汞處理配子體45s。本發(fā)明消毒方法在解決苔蘚植物的配子體方法方面取得了重要的進展，這一成功為東亞砂蘚配子體再生體系建立方法的課題研究提供了重要的支持和保證。雖然從技術方面看并不十分復雜，但是卻成功地解決了一項長期困擾該項課題的一大難題，克服了以往苔蘚植物組織培養(yǎng)中主要以孢子體作為原始材料的弊端，填補了現(xiàn)有技術的空白。本發(fā)明消毒方法效果特別好，消毒后的配子體污染率低，損傷率小。同時，本發(fā)明消毒方法還有操作簡單，成本低，省時省力等優(yōu)點。
具體實施例方式本發(fā)明東亞砂蘚組織培養(yǎng)過程中配子體的消毒方法，包括如下步驟
1.試驗材料試驗材料采自于黑龍江省五大連池風景區(qū)石龍，現(xiàn)保存于齊齊哈爾大學生命科學與農林學院標本室，編號為20090627。將材料采回后進行培養(yǎng)，選取長勢較好的用于實驗。2.試驗方法
(1)器材試驗中所用到的鑷子、剪刀、培養(yǎng)皿、組培瓶等器材均經過高壓蒸汽滅菌法 121 °C 滅菌 30min。(2)培養(yǎng)基的滅菌所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基。采用高壓蒸汽滅菌法121°C滅菌 15min。(3)配子體的消毒選取長勢較好的東亞砂蘚配子體，自頂端往下依次剪成小段， 放到空的培養(yǎng)瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；再用洗潔精溶液浸泡 IOmin左右，同時設置對照不用洗潔精溶液浸泡，流水下沖洗30min左右，于無菌水中沖洗數(shù)次，轉入超凈工作臺。在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0. 1% 的升汞溶液中消毒15s-60s。不同消毒處理如下
a)0.01% 15s、30s、45s、60s
b)0. 02% 15s、30s、45s、60s
c)0.05%15s、30s、45s、60s
d)0.10%15s、30s、45s、60s
(4)接種將消毒完后的材料于無菌水中反復沖洗7-8次，每次至少停留Imin鐘以上， 盡可能洗掉殘留的升汞，減少對配子體的損害。每個處理重復3次。(5)培養(yǎng)將材料接種于MS培養(yǎng)基上，放入T=20 士 2°C、光照12h/12h、光強 3000-50001ux光照培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每天觀察其生長情況。3.結果分析
觀察實驗現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，未用洗潔精溶液浸泡的配子體在接種第二天就有部分染菌，約3 天后基本上全部染菌；而用洗潔精溶液浸泡過的配子體在3天后開始部分染菌，總體效果較好。同時，由表1可以看出，不同消毒液濃度和消毒時間對外植體的污染率和成功率會產生不同的影響。在升汞濃度為0. 01%、0. 02%時，隨著處理時間的延長，污染率降低，成活率升高；在升汞濃度為0. 05%,0. 1%時，隨著處理時間的延長，污染率降低，成活率降低， 甚至全部死亡。最后結果得出將配子體用洲洗潔精溶液浸泡IOmin后，用0. 02%的升汞處理4 消毒效果最佳。表1東亞砂蘚配子體不同處理方法及結果
升汞濃度消毒時間污染率成活率0. 01%15s88%12%30s72%28%45s54%46%60s40%60%
權利要求
1.一種東亞砂蘚配子體的消毒方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)取適度培養(yǎng)后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段，放到空的培養(yǎng)瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；(2)用洗潔精溶液浸泡IOmin左右，于流水下沖洗30min左右，于無菌水中沖洗數(shù)次；(3)在超凈工作臺上用無菌濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0. 1%的升汞溶液中消毒 15s_60s ；(4)用無菌水反復沖洗7-8次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于MS培養(yǎng)基上。
2.根據(jù)權利要求1所述的消毒方法，其特征在于步驟(1)中需挑選粗壯、長勢較好的東亞砂蘚，剪成長度為0. 5-lcm的小段。
3.根據(jù)權利要求1所述的消毒方法，其特征在于步驟(2)浸泡用的洗潔精溶液濃度為U。
4.根據(jù)權利要求1所述的消毒方法，其特征在于步驟(3)滅菌處理用0.02%的升汞處理配子體40s。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種東亞砂蘚配子體的消毒方法，步驟如下(1)取培養(yǎng)一段時間后的東亞砂蘚，自頂端往下依次剪成小段，放到空的培養(yǎng)瓶中，用紗布蓋好，放在水龍頭下用自來水沖洗幾小時；(2)用洗潔精溶液浸泡10min左右，于流水下沖洗30min左右，放到無菌水中浸泡；(3)在超凈工作臺上用濾紙吸干材料表面水分，放入0.01%-0.1%的升汞溶液中消毒15s-60s；(4)用無菌水反復沖洗7-8次，無菌濾紙吸干表面水分，接種于MS培養(yǎng)基上。本發(fā)明消毒方法簡單，成本低，既可有效的去除配子體表面所藏大量細菌，又能最大限度的降低對大多為單層細胞的配子體的損傷，保證了后續(xù)實驗的成功。
文檔編號A01H4/00GK102405844SQ201110410348
公開日2012年4月11日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權日2011年12月12日
發(fā)明者張梅娟, 沙偉 申請人:齊齊哈爾大學