專利名稱：一種誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸ｂ產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于利用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)天然產(chǎn)物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法。
背景技術(shù)：
丹參(fehia miltiorrhiza bunge)的根是中國(guó)傳統(tǒng)的中草藥，臨床主要用來(lái)治療胸腹刺痛，熱痹疼痛，瘡瘍腫痛，心煩不眠，肝脾腫大，心絞痛等癥。丹參中的次生代謝物——酚酸類化合物具有抗血栓形成的作用，對(duì)小鼠腦缺血再灌注引起的腦損傷有保護(hù)作用(Chen等，2000)，其中丹酚酸B具有很強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用(黃詒森等，1992)。 以丹酚酸B為代表的酚酸類成分被認(rèn)為是丹參中發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)基礎(chǔ)，逐漸受到研究者們的關(guān)注(杜冠華等，2000)。目前，利用細(xì)胞培養(yǎng)法成為定向生產(chǎn)目標(biāo)次生代謝物的有效方法，但往往由于培養(yǎng)細(xì)胞中次生代謝物的產(chǎn)量很低而成為制約其大規(guī)模生產(chǎn)的主要因素(董娟娥等，2009)。 利用添加外源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)、改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件等方法可在一定程度上提高丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B的產(chǎn)量，但提高的幅度很有限(柳福智等，2006)。利用誘導(dǎo)子誘發(fā)成為大幅度提高細(xì)胞培養(yǎng)物中次生代謝產(chǎn)物含量的重要方法(董娟娥等，2009)。利用酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌提取物等生物誘導(dǎo)子能提高丹參培養(yǎng)細(xì)胞丹參酮的產(chǎn)量，但不產(chǎn)生丹參酚酸類物質(zhì)(Chen 等，2000 ；Chen 等，2001 ；宴瓊等，2006)。參考文獻(xiàn)
Chen Y. H. , Du G. H. , Zhang J. T. . Protective effects of salvianolic acid B against the brain injuries induced by ischemia reperfusion. Sino Acta Pharmacal, 2000，5: 81 84.
黃詒森，張均田.丹參中三種水溶性成分的體外抗氧化作用.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992， 27(2) 96 100.
杜冠華，張均田.丹參水溶性有效成分-丹酚酸研究進(jìn)展.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床， 2000，20(5) 1(Γ14.
董娟娥，張康健，梁宗鎖.植物次生代謝與調(diào)控.西北農(nóng)林科技大學(xué)出版社，楊凌2009.
王和勇，羅恒，孫敏.誘導(dǎo)子在藥用植物細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用.中草藥，2004， 35(8) Γ5.
柳福智，董娟娥，梁宗鎖.外源激素對(duì)丹參愈傷組織誘導(dǎo)和有效成分含量的影響. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006, 21 (5): 151 153.
晏瓊，胡宗定，吳建勇.生物與非生物誘導(dǎo)子協(xié)同作用對(duì)丹參毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)丹參酮的影響.中國(guó)中藥雜志，2006，31(3) 18纊191.
Chen H, Chen F, Francis C K Chiu. The effect of yeast elicitor on the growth and secondary metabolism of hairy root cultures of Salvia miltiorrhiza. Enzymeand Microbial Technology, 2001， 28: 10(Tl05.
Chen H, Chen F. Effect of yeast elicitor on the secondary metabolism of Ti-transformed Salvia miltiorrhiza cell suspension cultures. Plant Cell Reports, 2000， 19: 710 717。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題與缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單、 成本低、誘導(dǎo)時(shí)間短、效率高的誘導(dǎo)提高丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B (丹參酚酸類物質(zhì))的方法。該方法克服了添加酵母提取物、寡半乳糖醛酸等誘導(dǎo)子誘導(dǎo)后不產(chǎn)生丹酚酸B的問題， 利用該方法可使丹參培養(yǎng)細(xì)胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右。實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的技術(shù)解決方案是一種誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸 B產(chǎn)量的方法，具體包括以下步驟
1)培養(yǎng)無(wú)菌苗步驟；
2)誘導(dǎo)愈傷組織步驟；
3)愈傷組織繼代培養(yǎng)步驟；
4)愈傷組織懸浮培養(yǎng)步驟；
5)誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B步驟；
6)收獲培養(yǎng)細(xì)胞步驟；
所述培養(yǎng)無(wú)菌苗步驟是將新鮮的丹參種子用水沖洗2、h，用紗布去除表面的蠟質(zhì)層， 用自來(lái)水沖洗3次，然后在無(wú)菌操作間進(jìn)行滅菌處理。滅菌處理的步驟是，用70%乙醇沖泡 30 s (秒)，用無(wú)菌水沖洗3次，再用0. 1%的HgCl2溶液滅菌1(T15 min后，再用無(wú)菌水沖洗 3次，接種在MS固體培養(yǎng)基上。在培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為1(T12 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的條件下培養(yǎng)2個(gè)月，長(zhǎng)出無(wú)菌苗。所述誘導(dǎo)愈傷組織步驟是取出生長(zhǎng)2個(gè)月的無(wú)菌苗，將葉片剪成0.5 cm X0. 5 cm 的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織。所述愈傷組織繼代培養(yǎng)步驟是將誘導(dǎo)出的愈傷組織每20 d (天)繼代培養(yǎng)一次， 繼代培養(yǎng)3次后形成具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織，然后在培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為200(T3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月，待用。所述愈傷組織懸浮培養(yǎng)步驟是選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)。所述誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B步驟是當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近靜止期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為6. 25^25 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。所述收獲培養(yǎng)細(xì)胞步驟是收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)細(xì)胞在4(T60°C真空干燥箱中干燥至恒量。所述MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由0. 5 1. 5 mg/L的ΝΑΑ、0. 5 1. 5 mg/L的6_BA、0. 5 1. 5 mg/L的2，4-D、5. 5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖組成。所述誘導(dǎo)形成愈傷組織的誘導(dǎo)條件是培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為2000 3000 Lx0所述懸浮培養(yǎng)是按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=5、g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。所述MS液體培養(yǎng)基不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖。所述懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm,培養(yǎng)壙8 d。向培養(yǎng)基中加入水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)是條件是培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為 125 rpm，培養(yǎng) 1 3 d。與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的效果和益處是工藝過程簡(jiǎn)單、誘導(dǎo)時(shí)間短、易于操作、成本低、效率高，完全避免了利用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)丹酚酸B含量過低而導(dǎo)致效率不高的問題，適合于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。在此工藝參數(shù)下，丹參培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B的含量為8. 16 g/kg，是傳統(tǒng)培養(yǎng)法含量(1. 53 g/kg)的5. 3倍。


圖1為加入不同濃度的水楊酸(SA)后對(duì)丹參培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。圖2為水楊酸(SA)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)丹酚酸B產(chǎn)量的影響。圖3為水楊酸(SA)誘導(dǎo)濃度對(duì)丹酚酸B產(chǎn)量的影響。圖4水楊酸誘導(dǎo)與其他方法誘導(dǎo)的效果比較圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合發(fā)明人給出的具體試驗(yàn)例和實(shí)施例，進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的有益效果。試驗(yàn)例1
本發(fā)明中影響丹酚酸B產(chǎn)量的因素主要有培養(yǎng)基中生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的濃度、蔗糖濃度、 水楊酸的加入時(shí)間、水楊酸的誘導(dǎo)濃度、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)細(xì)胞的干燥溫度等。在誘導(dǎo)愈傷組織的步驟中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的種類和使用濃度是影響丹參愈傷組織誘導(dǎo)與分化頻率的關(guān)鍵因素。2，4-D對(duì)丹參愈傷組織有強(qiáng)的誘導(dǎo)作用，以0.5 2.0 mg/L的2，4-D 誘導(dǎo)的出愈率較高，且生長(zhǎng)狀況好。高濃度的2，4-D會(huì)誘導(dǎo)愈傷組織內(nèi)多酚氧化酶活性升高，從而導(dǎo)致愈傷組織褐化。0.5 1.0 mg/L的NAA誘導(dǎo)的愈傷組織生長(zhǎng)好，呈乳白色，有光澤。NAA的濃度為3.0 mg/L以上時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)緩慢、逐漸褐化。培養(yǎng)液中6-BA的濃度為l.(T2.0 mg/L時(shí)出愈率高，愈傷組織生長(zhǎng)好。如果濃度過低，容易形成多核體阻止細(xì)胞分化，加速細(xì)胞衰老，逐漸死亡。高濃度的6-BA使細(xì)胞體積因強(qiáng)烈的分裂活動(dòng)而急劇縮小， 已形成的愈傷組織不能正常生長(zhǎng)，逐漸變褐。在進(jìn)行懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中，接入培養(yǎng)細(xì)胞的濃度是影響細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵因素。隨著接入培養(yǎng)細(xì)胞重量的增大，生長(zhǎng)速率逐漸下降。 愈傷組織濃度越大，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的程度越高。但愈傷組織濃度過低，繁殖的細(xì)胞數(shù)量也較低。故接入愈傷組織與培養(yǎng)液的重量體積比為5、g/100 ml培養(yǎng)基時(shí)較合適。在誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B的過程中，加入水楊酸的濃度和誘導(dǎo)時(shí)間是影響丹酚酸B產(chǎn)生的兩個(gè)關(guān)鍵因素。 高濃度的水楊酸明顯抑制愈傷組織的生長(zhǎng)，隨著水楊酸濃度的增大，培養(yǎng)細(xì)胞的鮮重增長(zhǎng)率逐漸降低。水楊酸的終濃度為50 mg/L時(shí)，培養(yǎng)細(xì)胞鮮重增長(zhǎng)率約為對(duì)照的48%。水楊酸的濃度在(Γ25 mg/L范圍內(nèi)誘導(dǎo)后的丹參細(xì)胞內(nèi)丹酚酸B含量均高于對(duì)照。過高濃度的水楊酸(50 mg/L)抑制丹酚酸B的積累。適宜于誘導(dǎo)丹酚酸B積累的水楊酸濃度為6. 25 25 mg/L，見圖1。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，丹酚酸B在廣3 d有誘導(dǎo)高峰。在(Tl d時(shí)，細(xì)胞中丹酚酸B含量逐漸增加，顯著高于對(duì)照。隨著誘導(dǎo)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)至2 d，細(xì)胞中丹酚酸 B含量急劇上升達(dá)到高峰，隨后緩慢下降。培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞中丹酚酸B的含量降低，見圖2 和圖3。收集的培養(yǎng)細(xì)胞在干燥的過程中應(yīng)注意干燥溫度，干燥溫度過高，會(huì)導(dǎo)致丹酚酸B 進(jìn)一步分解成為丹參素等其他酚酸類物質(zhì)，因此，干燥溫度以4(T60°C為宜。試驗(yàn)例2
將本發(fā)明的誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法與其他方法誘導(dǎo)作對(duì)比，詳見圖4。從圖4可以看出，利用本發(fā)明的方法可使丹參培養(yǎng)細(xì)胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右，明顯優(yōu)與其它方法。實(shí)施例1
將新鮮的丹參種子在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長(zhǎng)出無(wú)菌苗。選取健壯無(wú)菌苗的葉片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含有1. 0 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織在培養(yǎng)溫度為26°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月。選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=5 g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上(不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖)，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)5 d。向培養(yǎng)基中加入終濃度為10 mg/ L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)2 d。收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀部分(培養(yǎng)細(xì)胞)。 將收集到的培養(yǎng)細(xì)胞在50 °C真空干燥箱中干燥至恒量。實(shí)施例2
將新鮮的丹參種子在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長(zhǎng)出無(wú)菌苗。選取健壯無(wú)菌苗的葉片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含有1. 5 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織在培養(yǎng)溫度為M°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月。選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=7 g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上(不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖)，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)8 d。向培養(yǎng)基中加入終濃度為12. 5 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)1 d。收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀部分(培養(yǎng)細(xì)胞)。將收集到的培養(yǎng)細(xì)胞在60°C真空干燥箱中干燥至恒量。實(shí)施例3
將新鮮的丹參種子在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長(zhǎng)出無(wú)菌苗。選取健壯無(wú)菌苗的葉片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含有1. 0 mg/L的NAA、1. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織在培養(yǎng)溫度為27°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月。選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=7 g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上(不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖)，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)4 d。向培養(yǎng)基中加入終濃度為6. 25 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)2 d。收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀部分(培養(yǎng)細(xì)胞)。將收集到的培養(yǎng)細(xì)胞在40°C真空干燥箱中干燥至恒量。實(shí)施例4
將新鮮的丹參種子在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長(zhǎng)出無(wú)菌苗。選取健壯無(wú)菌苗的葉片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含有1. 5 mg/L的NAA、0. 5 mg/L 的6-BA、0.5 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織在培養(yǎng)溫度為23°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月。選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=8 g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上(不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖)，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)6 d。向培養(yǎng)基中加入終濃度為25 mg/ L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)1 d。收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀部分(培養(yǎng)細(xì)胞)。 將收集到的培養(yǎng)細(xì)胞在40°C真空干燥箱中干燥至恒量。實(shí)施例5
將新鮮的丹參種子在MS固體培養(yǎng)基上誘導(dǎo)長(zhǎng)出無(wú)菌苗。選取健壯無(wú)菌苗的葉片，剪成0. 5 cmX0. 5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上(含有1. 0 mg/L的NAA、1. 0 mg/L 的6-BA、1.0 mg/L的2，4-D、5.5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖)，誘導(dǎo)形成愈傷組織。將具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織在培養(yǎng)溫度為25°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為 2000^3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月。選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=7 g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上(不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖)，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)6 d。向培養(yǎng)基中加入終濃度為6. 25 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)2 d。收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀部分(培養(yǎng)細(xì)胞)。將收集到的培養(yǎng)細(xì)胞在60°C真空干燥箱中干燥至恒量。
權(quán)利要求
1.一種誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，具體包括以下步驟1)培養(yǎng)無(wú)菌苗步驟；2)誘導(dǎo)愈傷組織步驟；3)愈傷組織繼代培養(yǎng)步驟；4)愈傷組織懸浮培養(yǎng)步驟；5)誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B步驟；6)收獲培養(yǎng)細(xì)胞步驟；所述培養(yǎng)無(wú)菌苗步驟是將新鮮的丹參種子用水沖洗2、h，用紗布去除表面的蠟質(zhì)層， 再用水沖洗3次，進(jìn)行滅菌處理后用70%乙醇中沖泡30 s,無(wú)菌水沖洗3次，再用0. 1%的 HgCl2溶液中滅菌1(T15 min，再用無(wú)菌水沖洗3次后，接種在MS固體培養(yǎng)基上，在培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為1(T12 h、光照強(qiáng)度為200(T3000 Lx的條件下培養(yǎng)2個(gè)月，長(zhǎng)出無(wú)菌苗；所述誘導(dǎo)愈傷組織步驟是取出生長(zhǎng)2個(gè)月的無(wú)菌苗，將葉片剪成0.5 cm X 0.5 cm的小塊，接種于MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成愈傷組織；所述愈傷組織繼代培養(yǎng)步驟是將誘導(dǎo)出的愈傷組織每20 d繼代培養(yǎng)一次，繼代培養(yǎng)3 次后形成具有穩(wěn)定形態(tài)特征和生長(zhǎng)速率的愈傷組織，然后在培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為200(T3000 Lx的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)1個(gè)月，待用；所述愈傷組織懸浮培養(yǎng)步驟是選擇新鮮疏松的固體愈傷組織，在無(wú)菌狀態(tài)下分散，進(jìn)行懸浮培養(yǎng)；5)所述誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B步驟是當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近靜止期時(shí)，向培養(yǎng)基中加入終濃度為6. 25^25 mg/L的水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；6)所述收獲培養(yǎng)細(xì)胞步驟是收集全部培養(yǎng)液，置離心管中，在1200Xg離心后，傾倒出上清的培養(yǎng)基，收集沉淀培養(yǎng)細(xì)胞，將培養(yǎng)細(xì)胞在4(T60°C真空干燥箱中干燥至恒量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于,所述MS固體誘導(dǎo)培養(yǎng)基由0. 5 1. 5 mg/L的ΝΑΑ、0. 5 1. 5 mg/L的6_BA、0. 5 1. 5 mg/L 的2，4-D、5. 5 g/L的瓊脂、30 g/L的蔗糖組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述誘導(dǎo)形成愈傷組織的誘導(dǎo)條件是培養(yǎng)溫度為23 27°C、光照時(shí)間為12 16 h、光照強(qiáng)度為2000 3000 Lx。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述懸浮培養(yǎng)是按愈傷組織重量培養(yǎng)液體積=5、g 100 ml的比例，將分散的愈傷組織轉(zhuǎn)接到MS液體培養(yǎng)基上，在搖床中進(jìn)行黑暗懸浮培養(yǎng)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述MS液體培養(yǎng)基不含瓊脂和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，含30 g/L蔗糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于，所述懸浮培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)壙8 d。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸B產(chǎn)量的方法，其特征在于，向培養(yǎng)基中加入水楊酸誘導(dǎo)子進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)的條件是培養(yǎng)溫度為25°C，轉(zhuǎn)速為125 rpm，培養(yǎng)1 3 d。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種誘導(dǎo)提高丹參懸浮培養(yǎng)細(xì)胞中丹酚酸Ｂ產(chǎn)量的方法，具體包括以1)培養(yǎng)無(wú)菌苗步驟；2)誘導(dǎo)愈傷組織步驟；3)愈傷組織繼代培養(yǎng)步驟；4)愈傷組織懸浮培養(yǎng)步驟；5)誘導(dǎo)產(chǎn)生丹酚酸B步驟；6)收獲培養(yǎng)細(xì)胞步驟。該方法克服了添加酵母提取物、寡半乳糖醛酸、真菌提取物等誘導(dǎo)子誘導(dǎo)后不產(chǎn)生丹酚酸B的問題，利用該方法可使丹參培養(yǎng)細(xì)胞中的丹酚酸B含量增加5倍左右。本發(fā)明中的工藝條件經(jīng)放大后適宜于利用細(xì)胞培養(yǎng)法工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)丹酚酸B。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102428871SQ20111028607
公開日2012年5月2日 申請(qǐng)日期2011年9月24日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月24日
發(fā)明者梁宗鎖, 焦蒙麗, 碗國(guó)偉, 董娟娥, 陳紅艷 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)