專利名稱：一株耐旱地衣共生菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株耐旱地衣共生菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
地衣(lichen)是由真菌與藻類或藍(lán)細(xì)菌整合共生形成的，在形態(tài)上全然不同于真菌和藻類或藍(lán)細(xì)菌的生命形式，是自然界中互惠共生的典范。地衣的主要成分是參與共生的真菌，地衣的形態(tài)特征幾乎完全由其共生菌所決定，因此地衣共生菌的分類地位即為地衣的分類地位，即地衣共生菌的學(xué)名就是其地衣體的物種學(xué)名。地衣具有極強(qiáng)的生命力， 號(hào)稱“拓荒者”和“先鋒生物”，廣泛分布于包括裸露的巖石、荒漠的地表、固化的火山巖漿、 極地冰洞介質(zhì)的內(nèi)部或表面的各種生境中。地衣與人類的關(guān)系十分密切。主要可以概括為兩大類一是直接利用如作為草藥入藥，魏江春等(中國藥用地衣，北京科學(xué)出版社.198 描述了與醫(yī)藥衛(wèi)生有關(guān)的71 種地衣；地衣次生代謝產(chǎn)物可作為抗生素、抗癌物質(zhì)，譬如有抗菌活性的松蘿酸、地衣酚類， 有抗癌活性的地衣多糖、石耳多糖等；二是間接利用如地衣監(jiān)測(cè)、評(píng)定大氣質(zhì)量。另外，一些種屬的地衣因適應(yīng)了荒漠生境，它們能幾個(gè)月甚至幾年耐受超過50°C的高溫和干燥，在荒漠生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著不可替代的生態(tài)功能。如上所述，地衣不僅有藥用價(jià)值，在荒漠生境中還具有穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)的重要作用。 但是，地衣生長(zhǎng)緩慢，需要幾年、幾十年甚至上百年的生長(zhǎng)期才能達(dá)到人們所需要的生物量，進(jìn)而限制了對(duì)地衣的利用及其優(yōu)勢(shì)作用的發(fā)揮。幸運(yùn)的是可以通過分離培養(yǎng)的方法，獲得大量的地衣共生菌，直接或通過人工合成地衣的方式加以利用。因此，對(duì)地衣共生菌進(jìn)行分離培養(yǎng)具有重要意義。Ahmadjian V.和HeikilS H.，曾對(duì)采集自美國愛荷華州韋弗利地區(qū)的石果衣標(biāo)本進(jìn)行分離培養(yǎng)，并得到石果衣Endocarpon pusillum Hewdig的共生菌與共生藻(1970， The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima. Lichenologist,4 :259-267.)，但其地衣共生菌生長(zhǎng)緩慢，需要一年之久。在國內(nèi)，蘇敏、 魏江春(Su Min, Wei Jiangchun,2008. Research on liquid culture of mycobiont and photobiont isolated from cladonia pyxidata. Journal of fungal research,6 57-62.)報(bào)道，分離得到喇叭石蕊Cladonia pyxidata (L. ) Hofm的共生菌與共生藻，但該分離標(biāo)本采集地年均降雨量在500mm。隨后曹叔楠、魏江春0009，荒漠地衣糙聚盤衣共生菌耐旱生物學(xué)研究及液體優(yōu)化培養(yǎng).菌物學(xué)報(bào)觀790-796.)報(bào)道對(duì)采集自年均降雨量不足 IOOmrn甘肅文殊溝的Glypholecia scabra進(jìn)行分離培養(yǎng)，但是只得到了共生菌，無相應(yīng)的共生藻。最主要的問題是以上幾株地衣共生菌并沒有相應(yīng)的耐旱能力的數(shù)據(jù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株耐旱地衣共生菌及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的地衣共生菌為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020，已于2010年5月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJ* 址北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No.3893。所述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的分離標(biāo)本采集自騰格里沙漠東南緣的沙坡頭地區(qū)，該采集地干旱多風(fēng)，年均降雨量不足200mm，是沙漠生物資源“儲(chǔ)存庫”。所述石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893具有以下特征1)菌落直徑0. 8-0. 9cm,菌落呈形不規(guī)則圓形，表面粗糙，邊緣整齊或否，暗褐色至淺灰色；nrDNA-ITS(ITSl-5. 8S-ITS2)基因序列長(zhǎng)度為557bp，其核苷酸序列如序列表序列1所示；2)生長(zhǎng)周期短，在22°C、黑暗條件下、PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)30天達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，生長(zhǎng)曲線見圖2;耐旱性強(qiáng)，在干燥條件下(相對(duì)濕度彡10%)可以存活7個(gè)月之久(圖3， h)。本發(fā)明還提供一種培養(yǎng)所述石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的方法，該方法包括將所述的 Endocarpon pusillum F07020 在 20_24°C、如 22°C， 黑暗條件下培養(yǎng)的步驟，以獲得所述Endocarpon pusillum F07020菌體。本發(fā)明所提供的Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893還可以用于生產(chǎn)水楊酸。具體的生產(chǎn)方法是從所述Endocarpon pusillum F07020菌體中提取水楊酸。本發(fā)明所提供的Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893單獨(dú)使用即可與沙粒形成結(jié)皮，30天結(jié)皮厚度可達(dá)2mm，預(yù)示了該菌Endocarpon pusillum F07020CGMCC No. 3893在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生態(tài)環(huán)境將有廣闊的應(yīng)用前景。


圖 1 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 在不同培養(yǎng)
溫度下的生長(zhǎng)量。圖 2 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生長(zhǎng)曲線。圖 3 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 干旱脅迫實(shí)驗(yàn)結(jié)果。其中，a為對(duì)照，未進(jìn)行干燥脅迫；h為干燥脅迫210天后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基仍可生長(zhǎng)。圖 4 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成的結(jié)皮。圖 5 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 形成結(jié)皮的微觀照。圖6為水楊酸高效液相色譜圖。其中，上圖為標(biāo)樣譜圖，水楊酸含量 1. 18Χ1(Γ8πιο1/μ 1 ；下圖為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893譜圖，每克鮮重菌體中水楊酸含量為2. 3631X 10_7mol。圖 7 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A0702 OCGMCC No. 3892 在不同培
養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)量。圖 8 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生長(zhǎng)曲線。
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圖 9 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性驗(yàn)證。其中a為對(duì)照，未進(jìn)行干燥脅迫；b為干燥脅迫30天后，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基仍可生長(zhǎng)。圖 10 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的結(jié)皮。圖 11 為石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成結(jié)皮的微觀照。圖12為實(shí)驗(yàn)室條件下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 形成的結(jié)皮。圖 13 為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892在室內(nèi)共培養(yǎng)形成結(jié)皮的縱剖面電鏡掃描圖。圖14為噴灑樣方的制作。其中，左圖為示意圖，右圖為實(shí)際的草障方格。圖15為野外固沙實(shí)驗(yàn)形成人工地衣結(jié)皮。其中，左上圖結(jié)皮已初具規(guī)模，右上圖結(jié)皮厚度已達(dá)到0.4-0. 6cm，左下圖對(duì)照未形成結(jié)皮，右下圖已出現(xiàn)Endocarpon sp.。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。本實(shí)施例中所使用的培養(yǎng)基成分如下瓊脂(1. 5% WA)培養(yǎng)基瓊脂粉15g，蒸餾水IL0大豆蛋白胨(DBD)液體培養(yǎng)基蛋白胨10g，酵母膏5g，葡萄糖lg，蒸餾水1L。土豆浸汁(PDA)培養(yǎng)基葡萄糖20g，瓊脂粉15g，土豆浸汁1L，不加瓊脂粉即為液體PDA培養(yǎng)基。實(shí)施例1、石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020的分離、鑒定及特性1、地衣標(biāo)本的采集與鑒定從騰格里沙漠東南緣的沙坡頭地區(qū)(干旱多風(fēng)，年均降雨量不足200mm)采集獲得新鮮地衣標(biāo)本，采用形態(tài)解剖學(xué)方法對(duì)該標(biāo)本進(jìn)行鑒定。選取成熟、發(fā)育良好的地衣體，放于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中，使地衣體浸透變軟，隨后用干凈濾紙吸去地衣體上的多余水分， 冷凍切片，在解剖鏡下選取較薄的切片置于載玻片水滴中，加蓋玻片，在顯微鏡下觀察，結(jié)果如下地衣體鱗片葉狀，鱗片葉聚集，緊密貼生于基物，寬約2_5mm，圓形至不規(guī)則形狀，邊緣完整至鋸齒狀，上表面深棕色至淺棕色，平坦至微下凹，下表面黑色具有菌絲和假根，假根黑色，5-7mm長(zhǎng)，單一少分枝，每個(gè)鱗片葉單個(gè)或多個(gè)假根。子囊殼球形，直徑 0. 1-0. 2mm每個(gè)鱗片葉1_6個(gè)，埋生于地衣體中，孔口周圍深棕色。地衣體厚140-200 μ m，上皮層厚25-50 μ m，透明無色，為假薄壁組織；藻層厚 75-100 μ m,藻細(xì)胞直徑5-10 μ m ；髓層厚10-25 μ m ；下皮層厚30-50 μ m,下部淺黑色，菌絲
細(xì)胞壁加厚。子囊殼通常圓形，內(nèi)腔高220-400 μ m，寬200-380 μ m，果殼棕色，厚25-37 μ m，側(cè)絲25-65 μ m長(zhǎng)，子實(shí)層藻直徑4-7 μ m,子囊棒狀，50-65 X 15-22 μ m,子囊內(nèi)含2個(gè)子囊孢子，磚壁型，長(zhǎng)橢圓形，25-50 X 12-17 μ m。基物為沙土。通過以上觀察結(jié)果，鑒定該荒漠地衣標(biāo)本為石果衣Endocarpon pusillum Hedwig, Descript. Adumbr. Muse. Frondos. 56 (1789)。2、地衣共生菌的分離、培養(yǎng)利用孢子釋放方法從步驟1獲得的地衣標(biāo)本中分離地衣共生菌，具體方法為將新鮮地衣標(biāo)本的成熟子囊器，用水浸濕后吸去表面多余水分，用凡士林將子囊器倒置在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)，培養(yǎng)皿下部為1. 5% WA培養(yǎng)基，每Ia1轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿蓋一次(因共生菌與共生藻孢子同時(shí)噴射，所以可以通過上述孢子釋放方法同時(shí)得到共生菌與共生藻)，以獲得單一孢子形成的菌落。當(dāng)觀察到孢子萌發(fā)后，將含有萌發(fā)子囊孢子的瓊脂塊轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基， 22°C黑暗培養(yǎng)地衣共生菌，生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)入DBD液體培養(yǎng)基，150rpm黑暗培養(yǎng)。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行。通過上述方法獲得一株地衣共生菌，將其命名為 F07020。3、地衣共生菌F07020的鑒定1)形態(tài)特征將地衣共生菌F07020接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，22 °C黑暗培養(yǎng)30天，觀察菌落形態(tài)。觀察結(jié)果為菌落直徑0.8-0. 9cm，呈不規(guī)則圓形，表面粗糙，邊緣整齊或否，暗褐色至淺灰色。2)nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)序列的 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定A) DNA 提取分別取地衣體及其共生菌F0702010-20mg ；液氮研磨后加入300 μ 1 2 X CTAB,輕輕混勻，90°C水浴anin ；加入300μ 1酚氯仿異戊醇Q5 24 1)，振蕩混勻，12000r/ min離心5min去除蛋白質(zhì)；取上清加入等體積的DNA結(jié)合液(結(jié)合液成分4. Omol/L異硫氰酸胍，0. 5mol/L、pH5. 0乙酸鉀，終體積濃度為30%的異丙醇)顛倒混勻，隨即移入吸附柱靜置2min，12000r/mim離心15s，棄殘液；加入300 μ 1洗滌液(洗滌液成分:10mmol/L，終體積濃度為80%的乙醇)，12000r/min離心15s，去殘液，重復(fù)一次；12000r/min離心干燥 Imin ；將吸附柱移入新無菌離心管，加入30 μ ITE洗脫液靜置5min, 12000r/min離心15s, 重復(fù)洗滌一次，去除吸附柱，離心管內(nèi)即為DNA模板。B) nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)基因的 PCR 擴(kuò)增及序列測(cè)序用實(shí)施例1的地衣標(biāo)本及其共生菌F07020 PCR擴(kuò)增的正向引物為ITS15，-TC CGTAGGTGAACCTGCGG-3，(SSU ntl769_1787)，反向引物為 ITS45，-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3，(LSU nt60-79) ；PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1) :10Xbuffer5y 1 ；25mmol/L MgCl2 3μ 1 ； 2. 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ； 10ymol/L 引物各 1 μ 1 ；ddH2034y 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1(0. 25U)；模板1μ l(50ug)。PCR擴(kuò)增條件為 95°C 180s, 94°C 30s, 52°C 30s, 72°C 90s，37 個(gè)循環(huán)；72°C 600s，4°C 保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京標(biāo)凱生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman5. 2. 2進(jìn)行雙序列比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果表明，荒漠地衣及其共生菌F07020的IirDNA-ITSdTS1-S. 8S_ITS2)序列長(zhǎng)度均為^7bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列1所示)，表明該荒漠地衣共生菌
6由其相應(yīng)標(biāo)本分離得到。根據(jù)地衣共生菌的學(xué)名就是其地衣物種的學(xué)名，以及荒漠地衣共生菌F07020與荒漠地衣標(biāo)本nrDNA-ITSdTSi-5. 8S_ITS2)同源序列的比對(duì)結(jié)果，將荒漠地衣共生菌F07020鑒定為石果衣共生菌Endocarpon pusillum Hedwig。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020已于2010年5月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3893。4、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的生長(zhǎng)特性1)培養(yǎng)溫度的篩選定量挑取石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo. 3893，轉(zhuǎn)接于DBD液體培養(yǎng)基中，黑暗條件，分別在10°C，16 °C，22 °C，觀°C， 340C 150rpm振蕩培養(yǎng)45天，每個(gè)溫度3個(gè)重復(fù)，取平均值篩選地衣共生菌最適培養(yǎng)溫度。 以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制柱形圖(圖1)。2)生長(zhǎng)曲線的繪制挑取定量石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCCNo. 3893，轉(zhuǎn)接于DBD液體培養(yǎng)基中，22°C，黑暗條件，150rpm振蕩培養(yǎng)，每15天測(cè)定一次菌絲干重，每次3個(gè)重復(fù)，取平均值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌絲干重為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(圖2)。圖1中對(duì)不同培養(yǎng)溫度下石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893的生長(zhǎng)量進(jìn)行多重比較(α = 0. 05)，以標(biāo)記字母法(a、b、c)表示比較的結(jié)果， 結(jié)果顯示，該共生菌在10°C到均可生長(zhǎng)，在22°C培養(yǎng)時(shí)顯著高于其他培養(yǎng)溫度下的生長(zhǎng)量；從圖2可以看出，該菌在22°C培養(yǎng)30天后到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，與AhmadjianV. and Heikila H. (1970) 艮道的地衣共生菌(The culture and synthesis of Endocarpon pusillum and Staurothele clopima. Lichenologist,4 :259-267.)需培養(yǎng) 1 年相比，差異顯者。5、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的耐旱性1)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893轉(zhuǎn)接入PDA液體培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)30天。2)干燥脅迫在無菌條件下，將步驟1)得到的菌液轉(zhuǎn)入不含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑35mm)中，將培養(yǎng)皿放入含變色硅膠的干燥器中(相對(duì)空氣濕度< 10%，環(huán)境溫度為 20 27°C，自然光照條件)，以造成干燥脅迫。每月將脅迫處理的石果衣共生菌轉(zhuǎn)接到含固體PDA培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度20 270C，黑暗培養(yǎng)，并觀察石果衣共生菌的生長(zhǎng)情況。對(duì)照初始未脅迫的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No.3893。上述石果衣共生菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No. 3893在干燥脅迫210 天后仍未死亡，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，證明其仍有活性(圖3，h)。實(shí)施例2、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 的固沙實(shí)驗(yàn)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893轉(zhuǎn)接入液體PDA培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)30天。將活化后的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌絲球在無菌條件下研碎，用無菌水稀釋至濃度為1. 57g/ml (以菌絲球濕重計(jì))后撒播于鋪有無菌沙粒培養(yǎng)皿中 (培養(yǎng)皿直徑10cm，沙粒厚5mm，以無菌水剛剛潤(rùn)濕沙粒為準(zhǔn))，每皿噴施5mL，使該共生菌的撒播量為0. lg/cm2(以菌絲球濕重計(jì))，12h光照/1 黑暗，20°C培養(yǎng)30天后觀察。石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 在 30 天后有新鮮菌絲長(zhǎng)出，同時(shí)可以見到新形成的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020菌絲與沙粒形成的結(jié)皮，厚2mm(圖4，圖5)以上實(shí)施例(實(shí)施例1-實(shí)施例2)表明，本發(fā)明提供的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893具有可培養(yǎng)、生長(zhǎng)周期短、耐旱性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)。并且在人工培養(yǎng)條件下可與沙粒形成結(jié)皮，預(yù)示利用該石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893進(jìn)行人工生物結(jié)皮固沙、防沙的巨大潛力，在人工防沙固沙、治理荒漠和改善生態(tài)環(huán)境方面具有廣闊的應(yīng)用前景。實(shí)施例3、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 生產(chǎn)水楊
酸取0. 3g培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893, 5mL 5%三氯乙酸研磨勻漿后，用1 1體積乙醚浸提，旋轉(zhuǎn)蒸干后加入ImL緩沖液溶解(甲醇乙酸=1 1，ρΗ3. 2)，采用高效液相色譜測(cè)定化學(xué)物質(zhì)含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893中含有水楊酸(圖6)，這是第一次在地衣共生菌中發(fā)現(xiàn)該物質(zhì)。圖6為水楊酸高效液相色譜圖。其中，上圖為標(biāo)樣譜圖，水楊酸含量 1. 18Χ10_8πιΟ1/μ 1，水楊酸峰面積是3651. 13，保留時(shí)間是22. 990分鐘；下圖為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020譜圖，水楊酸峰面積是7. 3177，保留時(shí)間是23. 005分鐘， 每克鮮重菌體中水楊酸含量為2. 3631X 10_7mol。實(shí)施例4、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與藻形成地衣共同固沙一、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分離鑒定1、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的分離鑒定1)分離培養(yǎng)利用孢子釋放方法從實(shí)施例1獲得的地衣標(biāo)本中分離地衣共生藻，具體方法為 將新鮮地衣標(biāo)本的成熟子囊器，用水浸濕后吸去表面多余水分，用凡士林將子囊器倒置在培養(yǎng)皿蓋內(nèi)側(cè)，培養(yǎng)皿下部為1. 5% WA培養(yǎng)基，為獲得單一孢子萌發(fā)形成的藻落，每1 轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿蓋一次(因共生菌與共生藻孢子同時(shí)噴射，所以可以通過上述孢子釋放方法同時(shí)得到共生菌與共生藻)，當(dāng)觀察到有藻生長(zhǎng)后，轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基，220C，12h光照/1 黑暗，光照強(qiáng)度20001UX條件下培養(yǎng)地衣共生藻，大量生長(zhǎng)后轉(zhuǎn)入DBD液體培養(yǎng)基，150rpm振蕩培養(yǎng)。以上操作均在無菌條件下進(jìn)行，通過上述方法獲得一株地衣共生藻，將其命名為 A07020。2)地衣共生藻A07020的鑒定A)形態(tài)特征將地衣共生藻藻株A07020接種于PDA斜面培養(yǎng)基，在22°C，12h光照12h黑暗，光
8強(qiáng)20001UX條件下培養(yǎng)10天，觀察藻細(xì)胞形態(tài)。觀察結(jié)果為細(xì)胞橢圓形至鈍圓柱形；橢圓形細(xì)胞大小為3. 8 X 4. 8 μ m，圓柱形細(xì)胞長(zhǎng)5. 8-8. 6 μ m，寬3. 8-4. 8 μ m ；葉綠體片狀、側(cè)生； 細(xì)胞外側(cè)有水質(zhì)膠殼包裹。B) nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)序列的 PCR 擴(kuò)增和序列測(cè)定DNA提取分別取10_20mg荒漠地衣標(biāo)本及其地衣共生藻A07020 ；液氮研磨；加入 300 μ 1 2父07^，輕輕混勻，901水浴&^11 ；加入300 μ 1酚氯仿異戊醇05 24 1)， 振蕩混勻，12000r/min離心5min去除蛋白質(zhì)；取上清加入等體積的DNA結(jié)合液(4. Omol/L 異硫氰酸胍，0. 5mol/L,pH5. 0乙酸鉀，終體積濃度為30%異丙醇)顛倒混勻，隨即移入吸附柱靜置2min, 12000r/mim離心15s，棄殘液；加入300 μ 1洗滌液(10mmol/L, ρΗ5· 0乙酸鉀， 終體積濃度為80%乙醇)，12000r/min離心15s，去殘液，重復(fù)一次；12000r/min離心干燥 Imin ；將吸附柱移入新無菌離心管，加入30 μ 1 TE洗脫液靜置5min，12000r/min離心15s， 重復(fù)洗滌一次，去除吸附柱，離心管內(nèi)即為DNA模板。nrDNA-ITS(ITSr5. 8S_ITS2)基因的PCR擴(kuò)增及序列測(cè)序用實(shí)施例1的地衣標(biāo)本及其地衣共生藻A07020PCR擴(kuò)增的正向引物為nr-SSU-1780-5’ -CTGCGGAAGGATCATTGAT TC-3，(18S nt 1780-1800)，反向引物為 nr-LSU-0012-5，-AGTTCAGCGGGTGGTCTTG-3，(28S nt0012-0030)。PCR 擴(kuò)增體系(50 μ 1) :10Xbuffer5y 1 ；25mmol/L MgCl23 μ 1 ；2. 5mmol/L dNTPs 4 μ 1 ;10 μ mol/L 引物各 1 μ 1 ；ddH2034 μ 1 ；Taq DNA 酶 1 μ 1 ；模板 1 μ 1。PCR 擴(kuò)增條件為 95°C 180s, 94°C 30s, 52°C 30s，72°C 90s，37 個(gè)循環(huán)；72°C 600s，4°C保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)北京標(biāo)凱生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAman5. 2. 2進(jìn)行雙序列比對(duì)分析。測(cè)序結(jié)果表明，地衣標(biāo)本及其共生藻A07020 WnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列長(zhǎng)度均為744bp，其核苷酸序列完全相同(如序列表序列2所示)，表明該地衣標(biāo)本的共生藻由其相應(yīng)標(biāo)本分離得到。將地衣共生藻A07020 WnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列在Genbank中進(jìn) 亍同源比對(duì)分析，其序列與Stichococcus diplosphaera Chodat = Diplosphaera chodatii BialosukniamnrDNA-ITS(ITS1-S-SS-ITS2)序列相似性相似度為100%。根據(jù)形態(tài)特征以及IirDNA-ITSaTS1-S^S-ITS2)序列在Genbank中同源序列的比對(duì)結(jié)果，將地衣共生藻A07020鑒定為Diplosphaera chodatii Bialosuknia。石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020已于2010年5月31日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所)，保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3892。2、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的生長(zhǎng)特性1)培養(yǎng)溫度的篩選挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo. 3892，轉(zhuǎn)接于DBD液體培養(yǎng)基中，1 光照12h黑暗，光照強(qiáng)度為20001ux分別在 IO0C，16°C，220C ,28°C, 34°C 150rpm振蕩培養(yǎng)30天，每個(gè)溫度3個(gè)重復(fù)，取平均值篩選地衣共生藻最適培養(yǎng)溫度。以培養(yǎng)溫度為橫坐標(biāo)，藻細(xì)胞葉綠素在665nm處的吸光值為縱坐標(biāo)繪制柱形圖(圖7)?；蒙L(zhǎng)曲線的繪制挑取定量石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCCNo. 3892，轉(zhuǎn)接于DBD液體培養(yǎng)基中，22 °C，150rpm 12h光照12h黑暗，光照強(qiáng)度為 20001ux培養(yǎng)，通過葉綠素在665nm處的吸光值測(cè)定共生藻的生長(zhǎng)量，每3天測(cè)定一次，每次3個(gè)重復(fù)，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，665nm處吸光值為縱坐標(biāo)繪制生長(zhǎng)曲線(圖8)。圖7中，對(duì)在不同溫度下培養(yǎng)的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892的吸光值進(jìn)行多重比較(α = 0. 05)，以標(biāo)記字母法(a、b、c)表示比較的結(jié)果，結(jié)果顯示，該地衣共生藻在10°C到34°C之間都可以生長(zhǎng)，在培養(yǎng)溫度為22°C時(shí)具有最大生長(zhǎng)量。從圖8可以看出，在22°C，150rpm 1 光照1 黑暗，光照強(qiáng)度為20001ux 條件下培養(yǎng)10天后石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。3、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的耐旱性1)活化將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892轉(zhuǎn)接入液體PDA培養(yǎng)基中，150rpm黑暗培養(yǎng)10天。2)干燥脅迫無菌條件下，將1)得到的藻液轉(zhuǎn)入不含培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑 35mm)中，將培養(yǎng)皿放入含變色硅膠的干燥器中(相對(duì)空氣濕度< 10 %，環(huán)境溫度為20 27°C，自然光照條件)，以造成干燥脅迫。每月將脅迫處理的荒漠地衣共生藻A07020轉(zhuǎn)接到固體PDA培養(yǎng)基中，環(huán)境溫度 20 27°C，黑暗培養(yǎng)，并觀察共生藻的生長(zhǎng)情況(圖9)。對(duì)照初始未脅迫石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892(圖 9，a)。上述石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 在干燥脅迫 30天后仍未死亡，轉(zhuǎn)接于PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后，證明其仍有活性(圖9，b)。4、石果衣共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 的固沙實(shí)驗(yàn)活化將石果衣共生藻Diplosphaerachodatii A07020 CGMCC No. 3892接入土豆浸汁(PDA)液體培養(yǎng)基中，22°C、150rpm，12h光照(20001ux)/12h黑暗培養(yǎng)10大。將活化后的石果衣共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 藻懸液在無菌條件下撒播于鋪有無菌沙粒培養(yǎng)皿中(沙粒厚約5mm，以無菌水剛剛潤(rùn)濕沙粒為準(zhǔn))，使該共生藻的撒播量為0. 42X IO6個(gè)細(xì)胞/平方厘米，12h光照(20001uX)/12h黑暗條件下，20°C培養(yǎng)，60天后觀察到該共生藻與沙粒形成的藻結(jié)皮，綠色藻層厚約2mm(圖10， 圖 11)。二、石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 共培養(yǎng)制備地衣與固沙1、室內(nèi)共培養(yǎng)制備地衣與固沙實(shí)驗(yàn)將石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892 分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，活化 15 天后，當(dāng)觀察到培養(yǎng)基上有上述地衣共生菌和共生藻生長(zhǎng)后，將地衣共生菌和共生藻分別轉(zhuǎn)接入PDA液體培養(yǎng)基中150rpm大量培養(yǎng)，培養(yǎng)周期分別為30天和20天，培養(yǎng)條件分別為 共生菌22°C暗培養(yǎng)；共生藻22°C、l i光照(光照強(qiáng)度20001ιιΧ)/1 !暗培養(yǎng)。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892 混勻，使共生菌與共生藻的濃度分別為0.785g/mL(以菌絲球濕重計(jì))和3. 25X IO6個(gè)細(xì)胞/mL。將得到的混合液均勻噴灑于無菌沙土表面，沙土顆粒大小均一，盛于直徑IOcm的無菌平皿中，厚約
100. 5cm,每皿噴施5mL混合液，做3皿重復(fù)，平皿密封后置于光照培養(yǎng)箱中，22°C、1 光照 (20001ux)/12h黑暗條件下培養(yǎng)，定期觀察。培養(yǎng)12個(gè)月后，三個(gè)重復(fù)均觀察到石果衣地衣共生菌與共生藻形成結(jié)皮，并且固著在沙土顆粒之上，覆蓋了平皿的80% (圖12)。同時(shí)，對(duì)結(jié)皮進(jìn)行縱切，通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 與共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892發(fā)生接觸，并且菌絲將藻細(xì)胞包裹在內(nèi)(圖13)，說明二者已經(jīng)共生形成地衣的初始階段，并且起到固著沙粒的作用。2、野外固沙實(shí)驗(yàn)在平整固定沙丘上清理3個(gè)約0. 5m2的沙面，然后用麥草將每個(gè)沙面分成兩部分， 形成草障方格，即0. 4X0. 5m區(qū)作為噴灑清水對(duì)照方，0. 6X0. 5m區(qū)作為噴灑懸浮液實(shí)驗(yàn)方 (圖 14)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的地衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 和共生藻Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892及野外收集的地衣碎片(經(jīng)鑒定，該地衣為石果衣共生菌Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893和共生藻 Diplosphaera chodatii A07020 CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)與水混合，混合后得到濃度分別為0. 5g/ml (以菌絲球濕重計(jì))、0· 21 X IO7個(gè)細(xì)胞/ml、5X 10_3g/ml的懸浮液， 然后按每平方米IL懸浮液均勻撒播于實(shí)驗(yàn)方沙土表面，每3天用清水澆灌一次，觀察。對(duì)照樣方噴灑清水，用量與懸浮液體積相同，其他管理均相同。以上處理輔以保水劑(Super Absorbent Polymers，簡(jiǎn)稱SAP，購自北京金元易生態(tài)工程技術(shù)中心)，將保水劑以250g/m2的用量撒播于草方格之上保持水分。上述地衣碎片的制備方法如下將地衣(經(jīng)鑒定該地衣為石果衣共生菌 Endocarpon pusillum F07020 CGMCC No. 3893 禾口共生藻 Diplosphaera chodatii A07020CGMCC No. 3892共生形成的石果衣)及其下4mm-12mm的土壤同時(shí)取下，碾碎經(jīng)直徑 0. 5cm的篩網(wǎng)過濾，獲得均一大小的地衣碎片。結(jié)果在12個(gè)月后的地衣結(jié)皮在自然條件下均已初具規(guī)模(圖15，左上)，結(jié)皮厚度均已達(dá)0. 4-0. 6cm(圖15，右上)，與對(duì)照方的差異明顯(圖15，左下)，且有地衣著生 (圖15，右下)。以上結(jié)果表明，該地衣及其共生藻與共生菌可以直接促進(jìn)地衣結(jié)皮的形成，縮短了微型生物結(jié)皮成熟的時(shí)間，操作簡(jiǎn)便，可以有效持久固沙，提高荒漠生態(tài)系統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)元素及生物多樣性，同時(shí)其形成的生態(tài)景觀不僅可以為荒漠地區(qū)旅游業(yè)帶來經(jīng)濟(jì)價(jià)值，而且可以為干旱半干旱地區(qū)城鎮(zhèn)綠化提供材料。
權(quán)利要求
1.Endocarpon pusillum F07020，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏登記號(hào)為CGMCC No. 3893。
2.權(quán)利要求1所述Endocarponpusillum F07020的培養(yǎng)方法，包括將權(quán)利要求1所述的Endocarpon pusillum F07020在如下溫度和光照條件下培養(yǎng)獲得權(quán)利要求1所述的 Endocarpon pusillum F07020 的菌體的步驟:20°C -24°C、黑暗。
3.權(quán)利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在人工防沙固沙中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在治理荒漠中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在改善生態(tài)環(huán)境中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在生產(chǎn)水楊酸中的應(yīng)用。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述生產(chǎn)水楊酸是從權(quán)利要求1所述 Endocarpon pusillum F07020的菌體中提取水楊酸。
8.權(quán)利要求1所述的Endocarponpusillum F07020在制備地衣體中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株耐旱地衣共生菌及其應(yīng)用。該地衣共生菌為Endocarponpusillum F07020，在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏登記號(hào)為CGMCC No.3893。Endocarpon pusillum F07020可用于提取水楊酸，且該菌耐旱性強(qiáng)，單獨(dú)使用即可與沙粒形成結(jié)皮，30天結(jié)皮厚度可達(dá)2mm，預(yù)示了該菌Endocarponpusillum F07020 CGMCC No.3893在人工防沙固沙、治理荒漠和/或改善生態(tài)環(huán)境將有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01H15/00GK102308753SQ20111026196
公開日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月29日
發(fā)明者周啟明, 張濤, 曹叔楠, 魏江春 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院微生物研究所