專利名稱：一種甘菊繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物組織培養(yǎng)的方法，特別涉及甘菊離體培養(yǎng)和植株再生的方法，屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)又名巖香菊，甘野菊，為菊科菊屬甘菊系多年生草本植物，是菊花(ChrysanthemumXmorifolium)起源的重要親本之一，具有較好的觀賞價(jià)值，屬于野生觀賞植物。其分布于我國(guó)多個(gè)省市，多生于海拔630-2300米的山坡、 巖石、河谷、河岸、荒地以及黃土丘陵地區(qū)。甘菊是一種較好的節(jié)水野生地被植物材料，具有抗逆性強(qiáng)、適用范圍廣、管理粗放等優(yōu)點(diǎn)，適于山坡綠色、公路護(hù)坡、河提種植，可防止水土流失；也可用于公園、庭院，增加景觀的野趣性；可與郊野綠地及植物配景，可形成艷麗的綴花草坪，可給園林增添許多生機(jī)。 此外，甘菊為菊屬植物中的二倍體植物，倍性較低，是栽培菊花起源中參與起源且遺傳背景最為簡(jiǎn)單的菊屬野生植物，適合用作菊科植物遺傳育種研究的模式植物。目前人們已經(jīng)針對(duì)甘菊做了不少研究工作，其中包括甘菊栽培繁殖技術(shù)，再生及轉(zhuǎn)化體系，花發(fā)育基因的克隆、表達(dá)及功能驗(yàn)證和抗逆性等多方面的研究，這些研究為將甘菊作為菊科植物研究的模式植物奠定了基礎(chǔ)。例如劉占磊等人在2009年14期《安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)》上發(fā)表的甘菊遺傳轉(zhuǎn)化再生體系的建立，以甘菊無菌苗葉片為外植體，通過添加不同濃度的NAA和6-BA建立了甘菊遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，在芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0. lmg/L的NAA 和0. lmg/L 6-BA時(shí)再生頻率最高，可達(dá)98%，其不定芽生根率可達(dá)100%，該研究為進(jìn)行甘菊轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)打下了基礎(chǔ)。又如北京林業(yè)大學(xué)的丁焱等人在2005年《中國(guó)觀賞園藝研究進(jìn)展》上發(fā)表的甘菊再生體系的建立，以甘菊無菌苗葉片為外植體，誘導(dǎo)植株再生，建立再生體系，結(jié)果表明甘菊種子用0. 8%次氯酸鈉溶液20分鐘效果最好；切莖增殖用1/2MS+0. 5% 活性炭最好；誘導(dǎo)葉盤愈傷和分化采用MS+lmg/L6-BA+0. 2mg/L NAA最為迅速；生根培養(yǎng)中采用1/2MS+0. 1% NAA效果更好，生根的小苗在溫室里生長(zhǎng)良好。穩(wěn)定的再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系是對(duì)甘菊進(jìn)行轉(zhuǎn)基因工作和分子遺傳學(xué)分析的基礎(chǔ)。通常，一個(gè)穩(wěn)定、高效的再生體系必須具備以下條件(1)外植體的組織細(xì)胞具有再生愈傷組織和完整植株的能力；( 具有較高的芽分化率；C3)易于離體培養(yǎng)，具有高度可重復(fù)性；(4)體細(xì)胞無性系統(tǒng)變異小。雖然對(duì)甘菊再生體系的研究較多，但是迄今為止，甘菊穩(wěn)定的再生體系始終未獲得?，F(xiàn)有技術(shù)中以甘菊的葉片作為外植體雖然能夠建立甘菊的再生體系，但其再生時(shí)間較長(zhǎng)，愈傷組織誘導(dǎo)率以及不定芽的分化率低，再生體系不夠穩(wěn)定，重復(fù)及再現(xiàn)性差，從而不利于甘菊的規(guī)模化、工廠化生產(chǎn)及培育。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的問題提供一種愈傷組織誘導(dǎo)率高、 不定芽分化率高、生根率高及穩(wěn)定的甘菊離體培養(yǎng)再生體系的建立方法。該方法可以在較短時(shí)間內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良的甘菊試管苗，可進(jìn)行規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)，可用于甘菊轉(zhuǎn)化體系研究，也可以用于分子育種研究。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一方面提供一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌幼苗培養(yǎng)，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成愈傷組織；3)將誘導(dǎo)生成的愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，培養(yǎng)得到不定芽；4)將不定芽接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進(jìn)行煉苗、移栽，即得。其中，所述步驟1)中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂 6g/L，pH 值為 6. 18。特別是，步驟1)中所述無菌幼苗為由種子萌發(fā)的子葉完全張開，真葉尚未展開的幼苗。其中，所述無菌幼苗的下胚軸長(zhǎng)度為12_17mm。特別是，所述下胚軸為無菌幼苗子葉著生處到根尖的一端胚軸。其中，所述步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+2，4-二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。特別是，步驟幻中所述2，4-二氯苯氧基乙酸優(yōu)選為lmg/L，6_芐氨基腺嘌呤優(yōu)選為 0. 5mg/L。尤其是，步驟2~)中將下胚軸切成長(zhǎng)度為3_5mm的下胚軸段后再接種，進(jìn)行所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中，所述步驟幻中所述不定芽分化培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18 ；所述步驟4)中所述生根培養(yǎng)基是大量元素減半的V2MS基本培養(yǎng)基 + 萘乙酸 0. 1-0. 3mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 瓊脂 6g/L，pH 值為 6. 18。特別是，步驟4)中所述萘乙酸優(yōu)選為0. lmg/L。特別是，步驟1)中在所述接種之前先將甘菊種子在體積百分比濃度為70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用無菌水沖洗3-5次，再用體積百分比濃度為2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒10-15min，用無菌水沖洗3_5次。其中，所述步驟1)中的無菌幼苗培養(yǎng)、步驟幻中愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件，培養(yǎng)溫度為22 士 1°C。特別是，步驟1)中所述無菌幼苗培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為黑暗條件，培養(yǎng)溫度為 22士 1°C，培養(yǎng)時(shí)間為5-7天。尤其是，所述培養(yǎng)時(shí)間為6-7天，進(jìn)一步優(yōu)選為7天。特別是，步驟2、中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為黑暗條件，培養(yǎng)溫度為 22 士 1°C，培養(yǎng)時(shí)間為14-16天。其中，步驟幻中不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)、步驟4)中生根培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為22士 1°C，光照強(qiáng)度為20001x，光周期為14-16小時(shí)光照/8-10小時(shí)黑暗。特別是，所述光周期優(yōu)選為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗。
特別是，步驟幻中所述在不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，每6-7天繼代培養(yǎng)一次，即不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，每6-7天將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)的愈傷組織取出后，轉(zhuǎn)移至新鮮的不定芽分化培養(yǎng)基中繼續(xù)進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，直到愈傷組織分化形成不定芽；也就是將愈傷組織在不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-7天后，取出，接著將愈傷組織轉(zhuǎn)移到另一新鮮的不定芽分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)6-7天后取出，重復(fù)操作4-5次，直到愈傷組織分化形成不定芽。尤其是，步驟幻中在所述不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，每7天繼代培養(yǎng)一次；繼代培養(yǎng)次數(shù)優(yōu)選為4次。特別是，步驟幻中所述不定芽長(zhǎng)度達(dá)到0.8-1. 2cm;步驟4)中所述不定根長(zhǎng)度達(dá)到 0. 8-1. 2cm。步驟幻中所述的煉苗移栽包括如下順序進(jìn)行的步驟移栽前打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋， 在組培室中煉苗1天，接著將生根的試管苗取出，用自來水洗凈試管苗根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，然后移栽到甘菊無土栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，在溫度為20士 1°C，相對(duì)濕度為50-80%，光照強(qiáng)度為30001x，光照周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗，培養(yǎng)一個(gè)月后，在溫度為20士 1°C，相對(duì)濕度為50-80%，光照強(qiáng)度為30001x，光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)至甘菊開花。特別是，所述的甘菊無土栽培基質(zhì)為泥炭與蛭石混合基質(zhì)，其中泥炭與蛭石的體積比為1 1。本發(fā)明的甘菊繁殖的方法具有以下優(yōu)點(diǎn)1、本發(fā)明利用甘菊成熟種子進(jìn)行高效離體繁殖，每個(gè)培養(yǎng)階段所采用的基本培養(yǎng)基的都是MS基本培養(yǎng)基(除生根培養(yǎng)基外，生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基是1/2MQ，具有無機(jī)鹽濃度高，特別是硝酸鹽、鉀和銨的含量高，可以為組織生長(zhǎng)提供所需礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)和促進(jìn)愈傷組織生長(zhǎng)，MS培養(yǎng)基的無機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和配比適當(dāng)，不需額外添加氨基酸、酪蛋白水解物、酵母提取物及椰子汁等有機(jī)附加成分，節(jié)約了生產(chǎn)成本。2、本發(fā)明采用甘菊植物體上分化狀態(tài)較低的組織——下胚軸作為外植體，進(jìn)行甘菊的繁殖，具有愈傷組織誘導(dǎo)率高、不定芽分化頻率高等優(yōu)點(diǎn)，此外，采用下胚軸作為外植體進(jìn)行甘菊繁殖所需要的時(shí)間更短，更有利于甘菊的大規(guī)模繁殖與栽培。3、本發(fā)明在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2，4- 二氯苯氧基乙酸和 6-芐氨基腺嘌呤，利于外植體愈傷組織的誘導(dǎo)、增殖，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到86. 63%，誘導(dǎo)形成的愈傷組織顏色為淡黃色，質(zhì)地疏松，大小一致，愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分化能力強(qiáng)， 利于不定芽的分化。4、本發(fā)明在生根培養(yǎng)基大量元素減半的1/2MS基本培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑萘乙酸，促進(jìn)了不定芽誘導(dǎo)生根，生根率達(dá)到100%，根系健壯，生根數(shù)可達(dá)到5. 20-6. 89 條，根長(zhǎng)達(dá)到2. 55-3. 34cm ；而且所形成的根系短粗，且根系上布滿根毛，為有效根，從而增加了根的吸收面積利于甘菊不定芽對(duì)營(yíng)養(yǎng)成份的吸收。5、本發(fā)明的不定芽誘導(dǎo)分化培養(yǎng)過程中，每6-7天進(jìn)行繼代轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一次，降低了甘菊愈傷組織誘導(dǎo)不定芽分化培養(yǎng)過程中激素濃度，不定芽生長(zhǎng)茁壯，分化效率高，達(dá)到 20. 25-25. 50%，無玻璃化等現(xiàn)象，平均每個(gè)外植體產(chǎn)生不定芽數(shù)達(dá)到3. 75-4. 25個(gè)。6、本發(fā)明對(duì)各種培養(yǎng)基的組成及含量進(jìn)行優(yōu)化，所使用的培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)組成合理，用量和配比適宜，不僅甘菊離體培養(yǎng)效率高，而且還有效地抵制了不定芽玻璃化、褐化等不良影響，移栽成活率達(dá)到100%，利用本發(fā)明的再生體系甘菊培育結(jié)果重復(fù)性高，再生體系穩(wěn)定，可以在短時(shí)間內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良的甘菊試管苗，有利于進(jìn)行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)，建立的再生體系可用于甘菊轉(zhuǎn)化體系研究，也可以用于分子育種研究。


圖1是甘菊種子萌發(fā)形成的無菌幼苗；圖2是接種到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)甘菊下胚軸；圖3是甘菊下胚軸在黑暗條件下誘導(dǎo)生成的愈傷組織；圖4是甘菊愈傷組織轉(zhuǎn)移到光照條件下不定芽誘導(dǎo)過程中愈傷組織變化；圖5是甘菊下胚軸愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定芽；圖6是甘菊不定芽誘導(dǎo)產(chǎn)生的不定根；圖7是移栽后的甘菊小苗；圖8是移栽后開花的甘菊。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。本發(fā)明實(shí)施例中所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007和SPSS17. 0軟件進(jìn)行方差分析與多重比較(鄧肯式檢驗(yàn)沖=0.01或？ = 0.05)，百分?jǐn)?shù)經(jīng)反正弦(y = arcsin x1/2) 轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行分析和比較。實(shí)施例1一、試驗(yàn)材料1、甘菊種子于2009年秋季采自北京林業(yè)大學(xué)校園，采種植株生長(zhǎng)良好，種子成熟飽滿，種皮完好。2、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑本發(fā)明中所使用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)采用國(guó)產(chǎn)萘乙酸(NAA)、6_芐氨基腺嘌呤 (6-BA)和2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。3、培養(yǎng)基的配制(1) "MS基本培養(yǎng)基”的組成或配制方法；表IMS 培養(yǎng)基(Murashige and Skoog, 1962)
權(quán)利要求
1.一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌幼苗培養(yǎng)，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成愈傷組織；3)將誘導(dǎo)生成的愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，培養(yǎng)得到不定芽；4)將不定芽接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進(jìn)行煉苗、移栽，即得。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟1)中所述的種子萌發(fā)培養(yǎng)基是MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基+2，4_ 二氯苯氧基乙酸0. 5-1. 5mg/L+6-芐氨基腺嘌呤0. 1-1. Omg/L+蔗糖30g/L+ 瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述不定芽分化培養(yǎng)基是:MS基本培養(yǎng)基+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟4)中所述不定根誘導(dǎo)培養(yǎng)基是大量元素減半的1/2MS基本培養(yǎng)基+萘乙酸0. 1-0. 3mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂6g/L，pH值為6. 18。
6.如權(quán)利要求1所述方法，其特征是步驟1)中所述接種之前先將甘菊種子在體積百分比濃度為70%的乙醇溶液中浸泡20-30s，用無菌水沖洗3-5次，再用體積百分比濃度為 2. 5%的次氯酸鈉溶液消毒10-15min，用無菌水沖洗3_5次。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟1)中所述無菌幼苗培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件，培養(yǎng)溫度為22 士 1°C。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行黑暗條件，培養(yǎng)溫度為22 士 1°C。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中不定芽分化培養(yǎng)、步驟4)生根培養(yǎng)在以下條件下進(jìn)行培養(yǎng)溫度為22士 1°C，光照強(qiáng)度為20001x，光照周期為14-16小時(shí)光照 /8-10小時(shí)黑暗。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟幻中所述的煉苗移栽包括如下順序進(jìn)行的步驟移栽前打開培養(yǎng)瓶的瓶蓋，在組培室中煉苗1天；然后將生根的小苗取出，用自來水洗凈試管苗根部殘留的瓊脂培養(yǎng)基，移栽到甘菊無土栽培基質(zhì)中培養(yǎng)，在溫度為 20士 1°C、相對(duì)濕度為50-80%、光照強(qiáng)度為30001x、光照周期為16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗， 培養(yǎng)一個(gè)月；接著，在溫度為20士 1°C、相對(duì)濕度為50-80%、光照強(qiáng)度為30001x、光照周期為12小時(shí)光照/12小時(shí)黑暗條件下培養(yǎng)至甘菊開花。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種甘菊繁殖的方法，包括以下步驟1)將甘菊種子接種于種子萌發(fā)培養(yǎng)基上進(jìn)行無菌幼苗培養(yǎng)，萌生為無菌幼苗；2)將無菌幼苗的下胚軸作為外植體，接種于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)生成愈傷組織；3)將誘導(dǎo)生成的愈傷組織接種于不定芽分化培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，培養(yǎng)得到不定芽；4)將不定芽接種于生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)不定根，獲得生根苗；5)將生根苗進(jìn)行煉苗、移栽，即得。本發(fā)明方法建立的再生體系中愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)到86.63％、不定芽分化率達(dá)到25.5％，生根率達(dá)到100％，移栽成活率達(dá)到100％，可以在短期內(nèi)形成大量?jī)?yōu)良的甘菊試管苗，可進(jìn)行規(guī)?；⒐S化生產(chǎn)。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102301952SQ201110201439
公開日2012年1月4日 申請(qǐng)日期2011年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月19日
發(fā)明者付建新, 戴思蘭 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)