專利名稱：一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及牡丹組織培養(yǎng)方法，特別是涉及一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法。
背景技術(shù)：
牡丹國色天香，是深受人們喜愛的傳統(tǒng)名花，也是園林綠化和盆花、切花等的理想材料，在園林花卉中具有獨(dú)特的優(yōu)勢和巨大的市場需求。牡丹繁殖困難，長期以嫁接繁殖為主，至今難以實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)種苗的規(guī)?；a(chǎn)；牡丹育種周期長，從播種到開花穩(wěn)定通常需要 10年以上(Cheng，2007)。組織培養(yǎng)作為現(xiàn)代生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)展最為迅速與成熟的技術(shù)之一，大大提高種苗繁殖系數(shù)和質(zhì)量，并為轉(zhuǎn)基因定向育種提供平臺(tái)，是解決牡丹繁殖和育種難題的有效途徑，但是經(jīng)過幾十年的大量研究，至今仍然沒有建立成熟的技術(shù)體系。牡丹組織培養(yǎng)研究最多的是芽培養(yǎng)(shoot culture)，即通過將牡丹的芽接入培養(yǎng)基，誘導(dǎo)腋芽原基萌發(fā)的方式實(shí)現(xiàn)芽的增殖，然后將得到的芽進(jìn)行生根培養(yǎng)，最終得到完整的植株。對(duì)牡丹這種難以生根的植物來說，這一繁殖方式的關(guān)鍵是生根(李萍和成仿云， 2007 ；Buchheim and Meyer，199 。目前，牡丹芽的離體增殖和生根研究已經(jīng)取得一些進(jìn)展，并得到了開花的植株(Beruto and Curir,2007)o芽培養(yǎng)的繁殖方式能較好地保持新植株與母體植株的一致性，是很多植物中廣泛采用的繁殖方法(George et al. 2008)。但這種方法的整個(gè)過程通常在固體培養(yǎng)基上進(jìn)行，每次增殖和繼代培養(yǎng)都需要繁重的手工勞動(dòng)，限制了繁殖的規(guī)模和效率；同時(shí)腋芽增殖的次數(shù)很有限，多次增殖后會(huì)出現(xiàn)生活力下降的現(xiàn)象。因此，芽培養(yǎng)的方式雖然理論上比嫁接和分株效率高很多，但由于存在上述的種種局限，仍然不是一種理想的繁殖方式。此外，牡丹植株再生體系的研究已經(jīng)有一些報(bào)道，主要是以種胚、花粉、花藥為外植體的直接體細(xì)胞胚發(fā)生(Buchheim和Meyer, 1992 ；何桂梅，2006 ；周秀梅等，2008)和以葉片、葉柄、莖段、根、花瓣為外植體的間接器官發(fā)生(李玉龍等，1984;BUChheim and Meyer, 1992 ；Beruto et al.，2004)兩類。這兩類研究目前都取得了不同程度的進(jìn)展，但普遍存在胚或芽的誘導(dǎo)率和生活力低，畸形率高的問題，再加上再生途徑本身的問題，難以達(dá)到實(shí)際應(yīng)用的程度。目前的牡丹植株再生體系主要存在以下問題(1)再生體系選擇的外植體不合適用于牡丹品種繁殖。種胚是有性生殖的產(chǎn)物，由于牡丹品種在基因型上多是高度雜合的，有性繁殖不能保持子代的一致性和穩(wěn)定性。所以，作為外植體的種胚與母體植株在遺傳上存在一定差異。而基因型往往是決定誘導(dǎo)條件的關(guān)鍵因素之一，所以，以種胚作為外植體一方面為誘導(dǎo)條件的選擇設(shè)置了障礙，難以獲得高的誘導(dǎo)率；另一方面即使能夠建立起穩(wěn)定的再生體系，獲得的再生植株與母體在基因型上也不一致，因此在良種繁殖和遺傳改良中的應(yīng)用前景也很有限。(2)間接的器官發(fā)生需要經(jīng)過愈傷組織的階段，增殖系數(shù)提高通常是通過愈傷組織的增殖來實(shí)現(xiàn)的。由于愈傷組織經(jīng)過長期無序增殖容易發(fā)生變異，再生植株常常會(huì)與母體植株的表現(xiàn)不一致；同時(shí)愈傷組織的分化能力也往往不能長期保持，所以，間接的器官發(fā)生在作為一種克隆繁殖方法時(shí)存在致命的問題。分生結(jié)節(jié)(meristematic nodules)是一種致密的球形細(xì)胞團(tuán)，具有穩(wěn)定的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)，至少包含三種類型的細(xì)胞(分生細(xì)胞、富含質(zhì)體的薄壁細(xì)胞和維管分子)和兩層組織(外部的表皮和內(nèi)部的皮層、維管組織)(McCown et al.，1988)。分生結(jié)節(jié)既不同于一般的不規(guī)則的愈傷組織，又不同于任何一種植物器官，它具有一定的外部特征和內(nèi)部的組織結(jié)構(gòu)，處于從完全未分化到開始分化之間的一種過渡狀態(tài)，是一種組織化的愈傷組織(organized callus) (George et al. 2008)。分生結(jié)節(jié)的生長發(fā)育經(jīng)歷發(fā)生、生長、增殖和分化四種狀態(tài)。作為一種具有分化潛力的結(jié)構(gòu)，分生結(jié)節(jié)再生植株通常是經(jīng)過器官發(fā)生的途徑，即結(jié)節(jié)先分化出芽，又在芽上生出根進(jìn)而發(fā)育成完整的植株。除了直接再生植物器官外，分生結(jié)節(jié)還可以直接再生體細(xì)胞胚(Ziv et al. ,1994 ；Lilien-Kipnis et al. , 1994)；或在培養(yǎng)過程中發(fā)生脫分化，產(chǎn)生胚性愈傷組織進(jìn)而間接再生體細(xì)胞胚 (Chaudhuri et al. ,2004 ；Sane et al. ,2006 ；Cameron 2010)；或者在器官發(fā)生的同時(shí)伴隨著體細(xì)胞胚發(fā)生的現(xiàn)象(McCown et al.，1988 ；Trindade and Pais，2003)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前已有 Linum(Salaj et al. 2005),Populus (McCown et al. 1988),Humulus (Batista et al. 2000), Vriesea(Alves et al. 2006), Eucalyptus(Warrag et al. 1991, Trindade and Pais 2003)， Acacia(Xie and Hong 2001)， Sclerocarya(Moyo et al.2009), Ananas(Teng 1997), Charybdis(Kongbangkerd 2005), Garcinia(Te-chato andLim 2000), Cichorium(Pieron et al. 1993), Pinus(Aitken-Christie and Singh 1988), Lilium(Godo et al. 1998)等十幾個(gè)屬的植物通過分生結(jié)節(jié)培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)了植株再生?？梢姡稚Y(jié)節(jié)是植物中普遍存在的一種介于直接發(fā)生與間接發(fā)生之間的離體植株再生途徑。但目前，還沒有關(guān)于牡丹分生結(jié)節(jié)的相關(guān)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的在于提供一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟1)將表面滅菌的葉柄薄層接種于前誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行前誘導(dǎo)；2)將步驟1)誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)，其中，所述的前誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以SH為基本培養(yǎng)基Gchenk和Hildebrandt，1972)， 添加0. 1 2mg/L的2，4-D和30g/L的蔗糖；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以SH為基本培養(yǎng)基，添加 0. 5mg/L 的 2，4-D、4mg/L 的 6-BA 和 30g/L 的蔗糖。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法，還包括將步驟2) 獲得的分生結(jié)節(jié)接種到所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖。其中，所述的繼代增殖為在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域公知的方法對(duì)葉柄進(jìn)行表面滅菌，優(yōu)選的，包括如下步驟用洗潔精將外植體表面洗凈，自來水沖洗1 2小時(shí)，用70%乙醇溶液浸洗30s lmin，再用1/5-1/10體積的84消毒液浸洗12-15min，最后用無菌水至少清洗3次。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的葉柄為0. 4 0. 6mm的葉柄薄層，優(yōu)選為0. 5mm 的葉柄薄層。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的葉柄優(yōu)選為萌芽后生長30 55d的復(fù)葉的總?cè)~柄，最優(yōu)選為生長^d的總?cè)~柄。在本發(fā)明中，所述的步驟1)中的前誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)選為30 60d，最優(yōu)選為45d。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述的前誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為以SH為基本培養(yǎng)基，添加 0. lmg/L 的 2,4-D 和 30g/L 的蔗糖。本發(fā)明旨在通過采自牡丹成年植株?duì)I養(yǎng)體的外植體，誘導(dǎo)牡丹分生結(jié)節(jié)發(fā)生并實(shí)現(xiàn)其增殖培養(yǎng)，建立牡丹營養(yǎng)體離體培養(yǎng)和增殖的新體系——牡丹分生結(jié)節(jié)培養(yǎng)。本發(fā)明采用來自牡丹成年植株?duì)I養(yǎng)體的外植體——葉柄，能夠真實(shí)繼承母體植株的遺傳特性。本發(fā)明采用SH為基本培養(yǎng)基和葉柄薄層培養(yǎng)的方法，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá) 100%，并且首次誘導(dǎo)出牡丹分生結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)率最高達(dá)到85. 7%。在固體和液體培養(yǎng)基上分別實(shí)現(xiàn)了牡丹分生結(jié)節(jié)的增殖，提供了一種牡丹組織離體增殖的新體系。分生結(jié)節(jié)特有的較強(qiáng)的分化能力和次生代謝活動(dòng)，將為牡丹植株再生和藥用有效成分生產(chǎn)提供一種潛在的有效手段。


圖1所示為前誘導(dǎo)的2，4_D濃度對(duì)分生結(jié)節(jié)誘導(dǎo)率的影響。圖2所示為前誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)分生結(jié)節(jié)誘導(dǎo)率的影響。圖3所示為外植體取材時(shí)間對(duì)分生結(jié)節(jié)誘導(dǎo)率的影響。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若無特別說明，涉及的培養(yǎng)基還包括30g/L的蔗糖，若為固體培養(yǎng)基，則還包括6. Og/L的瓊脂，培養(yǎng)基的pH值為 5. 8 6. 0。本發(fā)明中涉及的任何藥品，均可以市售獲得。實(shí)施例1紫斑牡丹‘高原圣火’分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)萌芽后30、40、55天，分別取大田栽培的紫斑牡丹‘高原圣火’的葉柄，用洗潔精將葉柄外植體表面洗凈，自來水沖洗約1小時(shí)，轉(zhuǎn)入超凈工作臺(tái)中操作。先用70%乙醇溶液浸洗1分鐘，接著用1/5(體積比)的84消毒液浸洗15分鐘，最后用無菌水清洗5次。將經(jīng)過表面滅菌的葉柄切成0. 5mm的薄層，平貼至含有2，4_D0. l-2mg · L—1的SH 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行前誘導(dǎo)，培養(yǎng)基配方如表1所示。外植體培養(yǎng)30、45、60天后分別將愈傷組織切下轉(zhuǎn)移到含有2，4-D 0. 5mg · Γ1和 BA 4mg · L—1的SH固體培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接種21塊愈傷組織，重復(fù)3次。繼續(xù)培養(yǎng)60天后統(tǒng)計(jì)產(chǎn)生分生結(jié)節(jié)的愈傷組織數(shù)量。通過對(duì)外植體取材時(shí)間(3水平)、前誘導(dǎo)的2，4_D濃度(12水平)、前誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間(3水平)等3個(gè)因素進(jìn)行全部實(shí)施的交叉實(shí)驗(yàn)，以確定各個(gè)因素對(duì)分生結(jié)節(jié)產(chǎn)生的影響。結(jié)果如表1所示。結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明前誘導(dǎo)2，4_D濃度為0. lmg/L，滿足了這個(gè)條件后，在取材時(shí)間為萌芽后30d、40d、55d，前誘導(dǎo)時(shí)間30d、45d、60d，這些處理上差不多都可以誘導(dǎo)出分生結(jié)節(jié)。當(dāng)葉柄取材時(shí)間為萌芽后55d，前誘導(dǎo)時(shí)間為45d時(shí)，前誘導(dǎo)2，4-D濃度為 0. 2-2mg/L時(shí)，也能高效誘導(dǎo)出分生結(jié)節(jié)。表1不同處理對(duì)牡丹分生結(jié)節(jié)誘導(dǎo)的影響
權(quán)利要求
1.一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟1)將表面滅菌的葉柄薄層接種于前誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行前誘導(dǎo)；2)將步驟1)誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)，其中，所述的前誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以SH為基本培養(yǎng)基，添加0. 1 2mg/L的2，4-D和20 40g/L的蔗糖；所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以SH為基本培養(yǎng)基，添加0. 5mg/L的2，4_D、^ig/L的 6-BA和20 40g/L的蔗糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，還包括將步驟幻獲得的分生結(jié)節(jié)接種到所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代增殖。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的繼代增殖為在固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)或在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行振蕩培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的葉柄的表面滅菌方法包括如下步驟用洗潔精將外植體表面洗凈，自來水沖洗1 2小時(shí)，用70%乙醇溶液浸洗30s lmin，再用1/5-1/10體積的84消毒液浸洗12-15min，最后用無菌水至少清洗3次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的葉柄薄層厚度為 0. 4 ~ 0. 6mm。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的葉柄薄層取自萌芽后生長 30 55d的復(fù)葉的總?cè)~柄。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的葉柄薄層取自萌芽后生長55d 的復(fù)葉的總?cè)~柄。
8.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的步驟1)的前誘導(dǎo)時(shí)間為30 60d。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的前誘導(dǎo)時(shí)間為45d。
10.根據(jù)權(quán)利要求1 3任一項(xiàng)所述的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的前誘導(dǎo)培養(yǎng)基為以SH為基本培養(yǎng)基，添加0. lmg/L的2,4-D和30g/L的蔗糖。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牡丹分生結(jié)節(jié)的誘導(dǎo)方法，包括如下步驟1)將表面滅菌的葉柄接種于前誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行前誘導(dǎo)；2)將步驟1)誘導(dǎo)的愈傷組織轉(zhuǎn)移到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)分生結(jié)節(jié)。本發(fā)明采用SH為基本培養(yǎng)基和葉柄薄層培養(yǎng)的方法，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100％，并且首次誘導(dǎo)出牡丹分生結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)率最高達(dá)到85.7％。在固體和液體培養(yǎng)基上分別實(shí)現(xiàn)了牡丹分生結(jié)節(jié)的增殖，提供了一種牡丹組織離體增殖的新體系。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102257956SQ20111012555
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年5月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月16日
發(fā)明者成仿云, 秦磊, 鐘原 申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)