專利名稱：垃圾堆肥復(fù)合菌劑在提高草坪草抗旱性方面的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及以城市生活垃圾堆肥中提取出的有益菌種為原料，配制高效堆肥復(fù)合菌劑。更具體的說是復(fù)合菌劑在制備提高草坪植物抗旱性方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
堆肥化(composting)是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等) 或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)〔humicsubstance，HS) 轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程。這一過程也是地球表面生態(tài)過程的一部分，它參與地球表面的物質(zhì)和能量循環(huán)。在人為控制條件下，通過堆肥化可以將固體廢物中的有機(jī)物轉(zhuǎn)化成為有機(jī)肥料一堆肥(compost)，這種有機(jī)肥料作為堆肥化的最終產(chǎn)物，不僅性能穩(wěn)定，并且對(duì)環(huán)境的危害甚小。因此，堆肥化是固體廢物，尤其是城市生活垃圾無害化、穩(wěn)定化和資源化的有效途徑之一。堆肥化發(fā)展至今，已經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歷史，對(duì)其產(chǎn)生和發(fā)展的歷史過程進(jìn)行回顧和分析，可為今后開發(fā)新的堆肥工藝技術(shù)提供理論和實(shí)踐上的借鑒和幫助。陳世和等(1989)采用垃圾培養(yǎng)基，在城市生活垃圾堆肥處理過程中，溫度達(dá) 45°C和55°C時(shí)，對(duì)堆肥菌株進(jìn)行分離，發(fā)現(xiàn)在45°C時(shí)曲霉菌[Aspergillus]、芽孢桿菌屬[Bacillus]、假單孢菌屬[Pseudomonas]禾Π 芽孢乳桿菌屬[Sporolactobaci Ilus] 等是堆肥中的優(yōu)勢(shì)菌群。而到55°C時(shí)則有所不同，除了芽孢桿菌屬[Bacillus]和假單孢菌屬Pseudomonas]仍然為優(yōu)勢(shì)菌群外，乳酸桿菌屬[LactcAacilIus]、鏈球菌屬 [Streptococcus]和小單孢菌[Micromonospora]屬則成為新的優(yōu)勢(shì)菌群，替代了其它種微生物，表明在堆肥化過程中，微生物種群處在一個(gè)不斷變化的動(dòng)態(tài)平衡之中。從城市生活垃圾中分離出大量參與高溫好氧堆肥的微生物，經(jīng)鑒定分別為芽孢桿菌屬、假單孢菌屬，乳酸桿菌屬、葡萄球菌屬、埃希氏菌屬等5屬細(xì)菌；曲霉屬，毛霉屬、紅曲霉屬，青霉屬、地霉屬、霉屬、脈孢苗屬、頭孢霉屬等8屬霉菌；鏈霉菌屬1屬放線菌；酵母菌屬，裂殖酵母菌等2屬酵母菌。該研究結(jié)果有力地促進(jìn)了對(duì)垃圾堆肥中微生物的研究和利用。Hassen (2001)對(duì)城市垃圾堆肥過程誒生物變化的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，分解有機(jī)物產(chǎn)生的高溫引起微生物群落的重要變化，使致病菌、酵母菌及中溫菌大量減少，而產(chǎn)芽孢的桿菌大量存在，在堆肥過程中，高溫階段初期和中文階段細(xì)菌均占主要地位。馬文漪等也報(bào)道了嗜熱真菌，嗜熱褐色放線菌等參與垃圾堆肥的微生物種群。從城市生活垃圾中有機(jī)物的組成來看，而被微生物所分解利用。但各種微生物對(duì)各種物質(zhì)的分解能力和分解速度是不盡相同的，不同溫度下(中溫、高溫)堆肥過程中出現(xiàn)的微生物種群和數(shù)量上亦截然不同。近期的相關(guān)文獻(xiàn)及實(shí)際生產(chǎn)表明目前如何提高城市生活垃圾堆肥處理的技術(shù)水平、提高處理效率、改善產(chǎn)品質(zhì)量，一直是相關(guān)科研人員所重點(diǎn)關(guān)注的研究?jī)?nèi)容；在堆肥物料中針對(duì)特定物質(zhì)有目的的添加一些人工微生物制劑，已經(jīng)被很多研究所證實(shí)是可以加快堆肥腐熟，提高堆肥效率的方法。考慮到在很多研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，合理配比的復(fù)合菌劑往往較單一菌株更具好的效果，于是如何將堆肥中提取和篩選出來的各種功能菌株結(jié)合起來開發(fā)高效堆肥復(fù)合菌劑，從根本上優(yōu)化和合理配制使用城市垃圾堆肥基質(zhì)便成了相關(guān)科研人員研究的熱點(diǎn)問題。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。生活垃圾堆肥化是利用自然界廣泛存在的微生物(細(xì)菌、放線菌、真菌等)或商業(yè)菌株，有控制地促進(jìn)可被生物降解的有機(jī)物向穩(wěn)定腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化的生物化學(xué)過程，是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用而實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化、無害化的動(dòng)態(tài)過程。研究表明，單一的細(xì)菌、真菌、放線菌群體，無論其活性多高，在加快堆肥化進(jìn)程中的作用都比不上復(fù)合微生物菌群的共同作用。Ros和Wrez-Piqueres等人研究了接種外源微生物復(fù)合菌劑對(duì)堆肥化過程中微生物的影響，有利于了解堆肥過程的生物化學(xué)過程及加入微生物制劑對(duì)堆肥的影響。近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)堆肥過程中的微生物現(xiàn)象進(jìn)行了一系列理論和實(shí)踐研究，Vaz-Moreira等人對(duì)堆肥中細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行分析，以期深入認(rèn)識(shí)堆肥過程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝的研究提供理論基礎(chǔ)。但在復(fù)合微生物菌劑研究過程中，有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及將堆肥微生物菌劑應(yīng)用于正常條件下對(duì)植物生長(zhǎng)的影響方面，相關(guān)研究也鮮為報(bào)道。而有關(guān)堆肥內(nèi)部微生物種類的鑒定和分類，堆肥菌種之間共生及相互影響關(guān)系具有模糊性和復(fù)雜性，以及從城市生活垃圾堆肥中提取篩選和配制堆肥復(fù)合有益微生物菌劑，對(duì)草坪植物生長(zhǎng)、生理特性的影響方面的研究還未見報(bào)道。干旱脅迫是制約干旱半干旱地區(qū)植物生長(zhǎng)和發(fā)育的重要環(huán)境因子。通過接種外源基因和人工合成菌劑來提高植物在干旱環(huán)境中的適應(yīng)能力，是近年來國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域。微生物能夠與80%以上的植物建立共生關(guān)系，而共生關(guān)系的建立往往可以提高植物的抗逆性，促進(jìn)植物生長(zhǎng)；對(duì)此，已有學(xué)者展開相關(guān)研究工作。賀學(xué)禮等人研究了水分脅迫條件下AM真菌對(duì)檸條錦雞兒生長(zhǎng)和抗旱性的影響。宋瑞勇等人利用人工合成微生物菌劑來提高作物抗逆性，證明了干旱脅迫條件下，微生物誘導(dǎo)劑可促進(jìn)玉米根系的生長(zhǎng)發(fā)育，提高根系的干物質(zhì)積累，從而提高玉米的抗干旱能力。盡管植物接種微生物的效應(yīng)研究報(bào)道較多，但大部分研究工作涉及的微生物菌劑只限于從土壤中提取。從城市生活垃圾堆肥中提取和制備微生物菌劑，并應(yīng)用于植物抗旱性的研究還未見報(bào)道。城市生活垃圾堆肥是由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多種微生物群體共同作用而實(shí)現(xiàn)有機(jī)廢棄物資源化、無害化的動(dòng)態(tài)過程。堆肥中微生物數(shù)量及種群分布與堆肥有機(jī)物質(zhì)成分和含量、微生物間的相互作用等多種因素密切相關(guān)。顧文杰等人研究接種外源菌劑對(duì)堆肥中微生物數(shù)量和酶活性變化的影響，為微生物菌劑的應(yīng)用和堆肥工藝的改進(jìn)提供依據(jù)。Ivone等人對(duì)堆肥中細(xì)菌的群落多樣性進(jìn)行分析，以期深入認(rèn)識(shí)堆肥過程的本質(zhì)，為堆肥技術(shù)和工藝研究提供理論基礎(chǔ)。但無論如何，在復(fù)合微生物菌劑研究過程中，有關(guān)堆肥微生物菌劑對(duì)植物生長(zhǎng)和生理特性的影響等相關(guān)研究還未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以堆肥微生物菌種作為接種劑，篩選出合適的有益微生物菌株，配制成不同濃度的復(fù)合微生物菌劑接種到草坪建植體系中。試驗(yàn)在中度干旱脅迫處理下進(jìn)行，通過研究不同濃度的復(fù)合微生物菌劑對(duì)黑麥草和高羊茅生理生態(tài)特性的影響，目的是為篩選優(yōu)良抗旱堆肥復(fù)合微生物菌劑，提高草坪植物抗旱性，促進(jìn)干旱環(huán)境草坪植物的建植提供依據(jù)。為實(shí)現(xiàn)上述目的本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案
高效堆肥復(fù)合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應(yīng)用；所述的堆肥復(fù)合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 :1 :1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。本發(fā)明所述的應(yīng)用，其中3菌種的菌落數(shù)在2.44X 109-2.47X 109/ml之間；草芽孢桿菌的0D_值為0. 567，酵母菌的OD值為0. 5450其中草坪植物抗旱性指的是丙二醛含量，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性。其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。本發(fā)明進(jìn)一步公開了高效堆肥復(fù)合菌劑，其中3菌種的篩選方法如下
(1)富集將采集的堆肥樣品稱取10g置于無菌三角瓶中，加入100 ml無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOml懸浮液于盛有100 ml富集培養(yǎng)基的三角瓶中，分別在適合的溫度下?lián)u床振蕩培養(yǎng)3天；
(2)初篩將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進(jìn)行復(fù)篩；
(3)復(fù)篩將初篩得到的菌株接種到相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中，在適合的溫度和搖床速度的條件下培養(yǎng)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線；
(4)合微生物菌劑的制備將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上，具體步驟為
①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；
②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC、180r/ min培養(yǎng)1 得到種子液， 放線菌和酵母菌在觀220 r / min培養(yǎng)48 h得到種子液；
③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)4 得到發(fā)酵液。按體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1:1:1配制復(fù)合微生物菌液。本發(fā)明所述的草坪植物為黑麥草和高羊茅。其中按體積比枯草芽孢桿菌放線菌 酵母菌=1:1:1配制。其中采用的復(fù)合菌劑為稀釋200倍的液體。本發(fā)明更加詳細(xì)的制備方法如下
特別加以說明的是枯草芽孢桿菌(保藏號(hào)CCTCCM207094)、放線菌(保藏號(hào) CPCa60118)、酵母菌(保藏號(hào)CGMCCN0. 1147)均由市售，但根據(jù)需要也可以采用下述的方法制備得到3個(gè)菌株。其得到的3個(gè)菌株的生化特性與市售的相同。研制材料與方法菌株的篩選
①富集將采集的城市生活垃圾堆肥樣品稱取IOg置于無菌三角瓶中，加入IOOmL無菌水和玻璃珠振蕩均勻后，取IOmL懸浮液于盛有IOOmL富集培養(yǎng)基的三角瓶中，在，220 r / min下振蕩培養(yǎng)3—5d。②初篩將富集后的培養(yǎng)液進(jìn)行濃度梯度稀釋后，涂布于分離篩選培養(yǎng)基上，倒置恒溫培養(yǎng)，觀察透明圈的大小，選取透明圈/菌落直徑比值較大菌落的菌株進(jìn)行復(fù)篩。③生長(zhǎng)曲線的繪制將初篩得到的枯草芽孢桿菌和酵母菌接種到相應(yīng)搖瓶培養(yǎng)基中，分別在37°〇和觀1，220 r / min的條件下培養(yǎng)，并分別以波長(zhǎng)600 nm和560 nm 下的OD值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制菌株的生長(zhǎng)曲線。
城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑制備
菌種培養(yǎng)將篩選的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌在相應(yīng)的培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)，具體步驟①用無菌生理鹽水洗滌保存斜面，至無菌三角瓶中搖勻即成菌懸液；②接種斜面培養(yǎng)物于種子瓶，枯草芽孢桿菌在3(TC，180r / min培養(yǎng)12 h得到種子液，放線菌和酵母菌在觀220 r / min培養(yǎng)4 得到種子液；③濃度10%的種子液接種到發(fā)酵瓶中擴(kuò)大培養(yǎng)4 得到發(fā)酵液，復(fù)合微生物菌液按以下處理進(jìn)行配制。復(fù)合微生物菌劑應(yīng)用
采用單因素隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，受限因素分別為①干旱脅迫，測(cè)得土壤田間最大持水量為43. 54%.本試驗(yàn)采用中度干旱脅迫，脅迫程度為55%—65%田間最大持水量(MFC) ’② 不同濃度的復(fù)合微生物菌劑應(yīng)用，在此干旱脅迫條件下設(shè)定處理方式處理1為對(duì)照，不接種菌劑(CK)；處理2加入原菌液(CM1)；處理3加入100倍稀釋液的菌劑(CM2)；處理4加入 200倍稀釋液的菌劑(CM3)；處理5加入300倍稀釋液菌劑(CM4)；處理6加入400倍稀釋液菌劑(CM5)
1. 4草坪建植
選用我國(guó)北方比較常見的多年生黑麥草Holium perenne L.)和高羊茅ifestuca arundinacea L.)為試驗(yàn)材料。供試草坪植物種子籽粒飽滿、大小均勻。所用土壤為天津師范大學(xué)院內(nèi)園土，其理化性質(zhì)為pH 7.44，飽和含水量0. 58mL/g，有機(jī)質(zhì)4. 6896，全氮 0. 21%,有效磷22. 03 mg/kg,全鉀45. 61g/kg。采集后，剔除植物殘根和石礫等雜物，過2mm 篩，在121°C下滅菌30 min，備用。實(shí)驗(yàn)采用盆栽的方法，每培養(yǎng)容器內(nèi)放置滅菌土壤200g， 將0. 4g草坪種子播種其上。每天統(tǒng)一定量給水，以保持培養(yǎng)基質(zhì)有較好的水分狀況，經(jīng)常調(diào)換各培養(yǎng)容器位置，以保證光照一致。當(dāng)植株生長(zhǎng)高度達(dá)到6—7cm時(shí)，加入不同濃度的堆肥復(fù)合微生物菌劑，接種CM 3d后，再進(jìn)行干旱脅迫。各處理3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)在溫室植物培養(yǎng)臺(tái)上進(jìn)行，溫度為20— 25°C，相對(duì)濕度為30%—60%，光照為透入室內(nèi)的自然光。處理 40d后進(jìn)行植物各指標(biāo)的測(cè)定。測(cè)定指標(biāo)
采集新鮮的植物葉片，進(jìn)行以下各指標(biāo)的測(cè)定。脯氨酸含量的測(cè)定采用酸性茚三酮比色法；丙二醛(MDA)含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法；POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；SOD 活性測(cè)定采用NBT法；CAT活性測(cè)定采用紫外分光光度法；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán) G-250染色法進(jìn)行測(cè)定。
葉綠索含量 (mgfFW)干旱脅迫處理CKCM1CM2CM3葉綠素aTl T2 T30.742 ±0.001 0,574± 0.002 0,521± 0.0021.572 ±0.021 1.060± 0.003 0.800 ±0.0030.843± 0.003 0.776 ±0,008 0.652 ±0,0020.845 ±0遞2 0.764 ± 0.004 0.633 ±0.002葉綠素bTl Ti T30.848 ±0.004 0.749 ±0.002 0.659 ±0.0011.075 ±0.017 0.953 ±0.006 0.835 ±0.0090J27± 0,013 0.848± 0.011 0729 ±0.0080.914 ±0.004 0.838 ±0.010 0.733 ±0.003葉綠素a/bTl T2 T30.875± 0.003 0.767± 0.004 0.791 ±0.0021.462± 0.00 1.111 ±0.008 0.958 ±0.0080.卯 9±d010 0.916 ±0.023 0.395±0,0120.926 ±0.002 0.913±0.016 0.864 ±0.005
離體葉片持水力的測(cè)定如下將準(zhǔn)確稱過鮮重的植物葉片，放入25°C—30°C 的干燥器中，在黑暗條件下干燥2—6 h，再稱量失水后葉片的重量，按下式計(jì)算失水率 失水率(％)=(鮮重一失水后重)/鮮重X 100%
失水率高，說明葉片干燥后失水較多，即葉片含水量高，則離體葉片持水力高。數(shù)據(jù)分析
采用Microsoft Excel 2003和SPSS 11. 5軟件進(jìn)行處理。研制結(jié)果分析 2. 1菌種篩選
初篩通過平板分離篩選，得到透明圈/菌落直徑比值較大且生長(zhǎng)較快的菌落。將所得的枯草芽孢桿菌、放線菌、酵母菌分別進(jìn)行劃線分離、編號(hào)并保藏于固體斜面培養(yǎng)基上。復(fù)篩通過測(cè)定枯草芽孢桿菌和酵母菌的生長(zhǎng)曲線(


圖1和圖2)，分析菌種生長(zhǎng)活性最高和繁殖能力最好時(shí)期為對(duì)數(shù)期，將此期的菌種提取出來，稀釋成不同濃度，用于草坪植物接種。由表1可以看出，所得微生物菌劑中富含枯草芽孢桿菌、放線菌和酵母菌，三菌種的菌落數(shù)在2. 44 X IO9-2. 47 X IO9之間，枯草芽孢桿菌的0D_值為0. 545，酵母菌的OD56tl 值為0. 567。表1微生物菌劑所富含的菌落數(shù)
權(quán)利要求
1.城市生活垃圾堆肥復(fù)合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應(yīng)用；所述的堆肥復(fù)合菌劑由體積比例為枯草芽孢桿菌放線菌酵母菌=1 1 :1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。
2.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中3菌種的菌落數(shù)在2.44X 109-2· 47Χ 109/ml之間；草芽孢桿菌的OD6tltl值為0. 567，酵母菌的OD56tl值為0. 545 0
3.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中草坪植物抗旱性指的是丙二醛含量，超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶活性。
4.權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其中的草坪植物為黑麥草和高羊茅。
全文摘要
本發(fā)明公開了城市生活垃圾堆肥復(fù)合菌劑在提高草坪植物抗旱性方面的應(yīng)用；所述的堆肥復(fù)合菌劑它是由體積比例為枯草芽孢桿菌∶放線菌∶酵母菌=1∶1∶1的3菌種稀釋100-200倍的液體組成。結(jié)果表明，接種稀釋后的城市生活垃圾堆肥復(fù)合微生物菌劑，植物能夠通過自身的保護(hù)酶活性和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量來減輕干旱傷害，維持植物體的正常生理代謝功能，從而有效緩解干旱脅迫對(duì)草坪植物的傷害，提高草坪植物的抗旱性，為干旱環(huán)境草坪植物的建植提供依據(jù)。
文檔編號(hào)C05F17/00GK102174403SQ201110037028
公開日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2011年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年2月14日
發(fā)明者多立安, 王晶晶, 趙樹蘭 申請(qǐng)人:天津師范大學(xué)