專利名稱：一種拮抗油茶病害的菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，尤其涉及一種防治油茶主要病害的生防菌株，具體地說(shuō)尤其涉及一株高效防治油茶炭疽病的短短芽孢桿菌Z26及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
油茶(Camellia oleifera)是我國(guó)特有的食用油料樹種，亦是世界四大木本油料樹種之一，已有2000多年的利用和栽培歷史。它適應(yīng)性廣，抗逆性強(qiáng)，適種于廣大的紅壤丘陵低地區(qū)。主要生長(zhǎng)在南方，以湖南、江西、廣西為主，其中湖南省是國(guó)內(nèi)最大的油茶產(chǎn)地和最大的茶油消費(fèi)區(qū)。油茶全身都是寶，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。據(jù)統(tǒng)計(jì)，油茶面積在10萬(wàn)畝以上的縣有 130個(gè)，30萬(wàn)畝以上的縣有56個(gè)，50萬(wàn)畝以上的縣有19個(gè)。年產(chǎn)茶油1. 3 1. 5億公斤， 是二億多人口的主要食用油來(lái)源。目前全國(guó)有油茶林400萬(wàn)公頃，占全國(guó)木本食用油料面積的80%以上，常年產(chǎn)油15萬(wàn)噸。目前，油茶的病害種類繁多，其危害程度也愈發(fā)嚴(yán)重。每年因病害而造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)，其中油茶炭疽病是一種常見的油茶病害。油茶炭疽病是由膠胞炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)侵染引起的一種毀滅性病害，是我國(guó)油茶產(chǎn)區(qū)的主要病害之一，發(fā)生普遍，引起嚴(yán)重落果、落蕾、落葉、枝枯，甚至整株衰亡。病害落果率通常在20%左右，嚴(yán)重時(shí)40%以上。據(jù)浙江省的資料，由于油茶炭疽病，嚴(yán)重病區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%，病樹的平均存果率比無(wú)病樹降低了 63.3%。當(dāng)前對(duì)油茶炭疽病的防治主要通過(guò)種植抗性品種和化學(xué)防治來(lái)控制，但有害生物抗性問(wèn)題日益嚴(yán)重，且化學(xué)農(nóng)藥殘留造成嚴(yán)重的危害，如造成殘毒、污染環(huán)境，對(duì)人體健康、 生態(tài)環(huán)境造成了很大的威脅，不利于油茶產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)、安全、有效的防治措施是當(dāng)務(wù)之急。生物防治以其安全、高效及無(wú)污染等特點(diǎn)已經(jīng)成為植物病害防治的重要途徑，其中拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中起到非常重要的作用，其主要優(yōu)勢(shì)在于1)種類和數(shù)量眾多，在植物葉際、葉內(nèi)大量存在；2)對(duì)病原菌的作用方式多種多樣，包括競(jìng)爭(zhēng)、拮抗、寄生、誘導(dǎo)植物抗性的產(chǎn)生等；3)繁殖速度快；4)許多細(xì)菌在植物的葉內(nèi)或葉際定殖力強(qiáng)；5)細(xì)菌大多能夠人工培養(yǎng)，易于操作，便于生產(chǎn)應(yīng)用；6)有些細(xì)菌不僅能夠防治病害而且可以增加作物產(chǎn)量。從油茶林地分離篩選獲得對(duì)油茶炭疽病菌具有拮抗作用的生防菌株，對(duì)油茶炭疽病的防治具有重要的意義，但目前相關(guān)技術(shù)仍舊很薄弱甚至空白，至今20多年能有效防治油茶炭疽病病的拮抗細(xì)菌少見報(bào)道，也少有防治油茶炭疽病的生物農(nóng)藥的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的空白，提供一種高效防治油茶主要病害，尤其是油茶炭疽病的短短芽孢桿菌Z26，炭疽病的短短芽孢桿菌Z26是一種從油茶林地內(nèi)分離篩選獲得對(duì)油茶炭疽病菌具有高效拮抗作用的生防細(xì)菌菌株，對(duì)油茶炭疽病的防治具有重要
眉、ο
本發(fā)明另一個(gè)目的是提供所述高效防治油茶主要病害，尤其是炭疽病的短短芽孢桿菌Z26在防治炭疽病等災(zāi)害方面的多種應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種拮抗油茶病害的菌株，所述的菌株為短短芽孢桿菌 Z26 (Bacillus brevis Z26)，已于2011年1月10日在中國(guó)湖北省武漢市武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)CCTCC M 2011013。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落平、光滑、黃灰色或淺黃色、無(wú)可溶性色素，菌體桿狀，0. 7 0. 9 μ mX 3 5 μ m，革蘭 染色陽(yáng)性，在膨大孢囊內(nèi)含橢圓形芽孢。所述的菌株應(yīng)用于防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半邊瘋、柑橘根腐病或柑橘炭疽病或蘆薈根腐病病原菌；尤其是用于防治油茶炭疽病。所述菌株應(yīng)用于抑制或致畸油茶炭疽病病菌菌絲；或者應(yīng)用于抑制油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子的萌發(fā)。所述的菌株還可以應(yīng)用于制備防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半邊瘋、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或蘆薈根腐病病原菌的制劑；尤其是制備防治油茶炭疽病的制劑。本發(fā)明的有益效果是(1)短短芽孢桿菌Z26對(duì)油茶炭疽病菌抑制作用強(qiáng)，對(duì)多種病原真菌具有拮抗作用，具有拮抗細(xì)菌在植物病害生物防治中所起到的非常重要的作用，例如種類和數(shù)量眾多； 對(duì)病原菌的作用方式多種多樣；繁殖速度快等優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)油茶炭疽病的防治具有重要
眉、ο(2)該菌株培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存，易于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。


圖1為短短芽孢桿菌Z26菌落形態(tài)；圖2為10 X 100倍顯微鏡下觀察短短芽孢桿菌Z26的菌體及芽孢形態(tài)；圖3為短短芽孢桿菌Z26菌株對(duì)油茶炭疽病菌的平板對(duì)峙拮抗作用；圖4為短短芽孢桿菌Z26對(duì)油茶炭疽病孢子的致畸作用；圖5為短短芽孢桿菌Z26菌株對(duì)油茶炭疽病菌等6種病害的平板對(duì)峙拮抗作用；
具體實(shí)施例方式本發(fā)明提供短短芽孢桿菌Z26新菌株，其展現(xiàn)出對(duì)油茶炭疽病具有較強(qiáng)的拮抗活性。本發(fā)明的新菌株分離自油茶林地。本發(fā)明的短短芽孢桿菌Z26顯示出以下形態(tài)和生化特征在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落平、光滑、黃灰色或淺黃色、無(wú)可溶性色素，菌體桿狀，0. 7 0. 9 μ mX 3 5 μ m，革蘭氏染色陽(yáng)性，在膨大孢囊內(nèi)含橢圓形芽孢。菌株的生化反應(yīng)過(guò)氧化氫酶、葡萄糖發(fā)酵、需氧性測(cè)定呈陽(yáng)性，V-P、甲基紅反應(yīng)陰性，其生長(zhǎng)能水解淀粉、明膠。下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，而非限制本發(fā)明。實(shí)施例1細(xì)菌的分離采集油茶林地土樣，鏟去表層土 5cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的自封袋中。在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)將IOg 土樣加入裝有90ml生理鹽水的250ml三角瓶中，充分搖勻，吸取上清液1ml，轉(zhuǎn)移至裝有9ml生理鹽水的無(wú)菌試管中，依次等比稀釋至10_7稀釋度，并按 10_7-10_3稀釋度的順序分別吸取0. Iml在事先準(zhǔn)備好的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上進(jìn)行平板涂布，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，涂抹均勻后放入培養(yǎng)箱中30°C培養(yǎng)，48h后記錄菌量，并根據(jù)菌落形態(tài)、顏色和大小選取，在平板上進(jìn)行純化保存，共分離5個(gè)批次。 實(shí)施例2拮抗細(xì)菌的篩選初篩采用對(duì)峙培養(yǎng)法。篩選病原真菌的拮抗細(xì)菌。將打好直徑為6mm的油茶炭疽病菌菌餅放于平板中央，然后用接菌環(huán)蘸取待測(cè)細(xì)菌的懸浮液等距離(距平板中央3cm) 點(diǎn)接2 3種細(xì)菌，放于培養(yǎng)箱中25°C黑暗培養(yǎng)，4d后觀察記錄抑菌帶的有無(wú)及大小，共重復(fù)3次。選出抑菌帶寬度大于等于4mm的10個(gè)菌株進(jìn)行復(fù)篩，依次為Z5、Z12、Z17、Z20、 Z26、Z30、Z31、Z47、Z52、Z66 進(jìn)行復(fù)篩(見表 1)。表1分離細(xì)菌對(duì)油茶炭疽病菌的抑菌作用
抑菌帶寬度L (mm)菌株編號(hào)
ZU Z2、Z3、Z4、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、ZlK Z13、Z14、Z15、Z16、Z18、Z19、Z21、Z22、 L<4Z23、Z24、Z25、Z27、Z28、Z29、Z32、Z33、
Z34、 Z35、 Z36、 Z37、 Z38、 Z39、 Z40、 Z41、 Z42、 Z43、 Z44、 Z45、 Z46、 Z48、 Z49、 Z50、
aikUMJJUMaMiJilliniiiTMMfiMiJiasgaiMmwanmBMsmmmsnmBMsmta- —·= — · ·^·—·= — · ·^·· ^—η·—>—- ■—’■■■_■,:,,,! ·,.π1 ,, ■,『，，！,, ■ , ι；,-,■,■,-,■, ■■ ...............................................................................................
Ζ51、Ζ53、Ζ54、Ζ55、Ζ56、Ζ57、Ζ58、Ζ59、 Ζ60、Ζ61、Ζ62、Ζ63、Ζ64、Ζ65、Ζ67、Ζ68、 Ζ69、Ζ70、Ζ71、Ζ72、Ζ73、Ζ74、Ζ75
4<L<7Ζ20、Ζ31、Ζ47、Ζ52、Ζ66、
7<L<10Ζ5、Ζ12、Ζ17、Ζ30
10<LΖ26復(fù)篩采用發(fā)酵法。將初步篩選出的10株菌分別在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d后，用接菌環(huán)移取一環(huán)置入裝有150mlNB培養(yǎng)液的三角瓶中(250ml)，在28°C、150rpm的搖床上振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)液用0. 22 μ m細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾得到培養(yǎng)濾液，將濾液與約50°C PDA培養(yǎng)基按1 19混勻倒入培養(yǎng)皿，冷卻后在平板中央放入d = 6mm的炭疽菌菌餅，5d后測(cè)量病菌菌落直徑，以無(wú)菌水為對(duì)照，Z26菌株發(fā)酵液的抑菌效果最明顯，抑制率達(dá)到83. 4%。見表 2。表2各初篩菌株發(fā)酵液對(duì)油茶炭疽病菌的抑制作用
權(quán)利要求
1.一種拮抗油茶病害的菌株，其特征在于，所述的菌株為短短芽孢桿菌Z26 (Bacillus brevis Z26)，保藏號(hào) CCTCC M 2011013。
2.權(quán)利要求1所述的菌株應(yīng)用于防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半邊瘋、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或蘆薈根腐病病原菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的菌株應(yīng)用于防治油茶炭疽病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將所述菌株應(yīng)用于抑制或致畸油茶炭疽病病菌菌絲。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用方法，其特征在于，將所述菌株應(yīng)用于抑制油茶炭疽病病菌菌絲分生孢子的萌發(fā)。
6.權(quán)利要求1所述的菌株應(yīng)用于制備防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半邊瘋、柑橘根腐病、柑橘炭疽病或蘆薈根腐病病原菌的制劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用方法，其特征在于，所述的菌株應(yīng)用于制備防治油茶炭疽病的制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種拮抗油茶病害的菌株及其應(yīng)用，尤其是拮抗油茶炭疽病的菌株，屬植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域。該菌株為短短芽孢桿菌Z26，Bacillus brevis Z26，保藏號(hào)CCTCC NO:M2011013。其經(jīng)平板對(duì)峙試驗(yàn)初篩及液體發(fā)酵液復(fù)篩所得，同時(shí)能有效防治油茶炭疽病、油茶根腐病、油茶半邊瘋、柑橘炭疽病、柑橘根腐病、蘆薈根腐病等多種植物病害，尤其能夠有效抑制油茶炭疽病菌的生長(zhǎng)，防效高；且環(huán)境安全性好，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01N63/02GK102154177SQ20111002795
公開日2011年8月17日 申請(qǐng)日期2011年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月26日
發(fā)明者何苑皞, 劉君昂, 周國(guó)英, 宋光桃, 李河, 李琳 申請(qǐng)人:中南林業(yè)科技大學(xué)