專利名稱：一個(gè)水稻kt471基因在提高植物耐逆性能上的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物基因工程和植物生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及來(lái)源于水稻的與抗逆 相關(guān)的KT471基因在提高植物耐逆性能中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
水稻、玉米和小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物，三大作物的產(chǎn)量、品質(zhì)對(duì)于我國(guó)的 糧食生產(chǎn)和糧食安全都至關(guān)重要。干旱、鹽堿、高溫和凍害等非生物逆境會(huì)直接影響糧 食作物的正常生長(zhǎng)和產(chǎn)量。隨著分子生物學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的應(yīng)用與普及，以農(nóng)作物性狀改良 為主要目標(biāo)的轉(zhuǎn)基因生物新品種的培育越來(lái)越受到重視。美國(guó)、日本、加拿大、韓國(guó)以 及歐洲一些國(guó)家的政府都投入了相當(dāng)多的資金開(kāi)展植物功能基因組的研究；同時(shí)，一些 高端的生物技術(shù)公司投入大量的人力物力分離各類功能基因的全長(zhǎng)cDNA，搶先獲得有用 的基因資源。如美國(guó)的CERES公司，利用高質(zhì)量的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，在短短幾年時(shí)間里 已經(jīng)在玉米，擬南芥、大豆、小麥、棉花、油菜等植物上申請(qǐng)了將近15000個(gè)基因的專 利；使得實(shí)力強(qiáng)大的MONSANTO公司出巨資與其合作，共同研究基因的功能。但是， 一些通過(guò)基因缺失突變體等手段獲得的功能明確的基因，尤其是抗逆相關(guān)基因，很難真 正應(yīng)用于農(nóng)作物的性狀改良，其原因主要是在改善了抗逆性能的同時(shí)，也影響了植物的 正常生長(zhǎng)，無(wú)法保持優(yōu)良農(nóng)藝性狀。但有些抗逆相關(guān)基因在受逆境誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的調(diào)控 時(shí)基本上不影響作物的正常生長(zhǎng)。針對(duì)這一狀況，美國(guó)的Mendel Biotechnology公司將擬 南芥全部轉(zhuǎn)錄因子與不同的啟動(dòng)子組合，分別轉(zhuǎn)入到番茄中，獲得了一批在農(nóng)作物改良 方面有很大應(yīng)用潛力的基因。證明通過(guò)基因的規(guī)模化功能驗(yàn)證尋找作物性狀改良的有效 基因的方法是一條切實(shí)可行的途徑。轉(zhuǎn)錄因子是一類調(diào)控基因表達(dá)的關(guān)鍵基因，對(duì)作物的生長(zhǎng)發(fā)育起著重要的調(diào)節(jié) 作用。利用生物信息手段，根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)從基因組水平推測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子基因 是一組最有可能具有明確功能的基因。多年以來(lái)，轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能研究一直是科 學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。科學(xué)家們利用不同的研究路線分離鑒定了大量的轉(zhuǎn)錄因子，豐富了 轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù)，也從中發(fā)現(xiàn)了一些與農(nóng)藝性狀相關(guān)調(diào)控因子，為農(nóng)作物的性狀改良提 供了重要基因資源。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一個(gè)與耐逆性相關(guān)的水稻基因KT471，以用于提高植物的 耐逆性能。發(fā)明所提供的與耐逆性相關(guān)的KT471基因，來(lái)源于稻屬水稻(Oryza sativa L.)， 編碼具有下述氨基酸序列的蛋白質(zhì)1)序列表中的 SEQ IDNO 1 ；序列表中的SEQ ID NO 1由170個(gè)氨基酸殘基組成，為蛋白KT471。
本發(fā)明中KT471的編碼基因既可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的 基因組DNA序列，或者是與所述基因具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA 序列。具有SEQ ID NO 1所示氨基酸序列的編碼基因可以具有序列表中SEQ ID NO 2的核苷酸序列。含有本發(fā)明基因的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范 圍。擴(kuò)增KT471任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種提高植物耐逆性的方法。本發(fā)明所提供的提高植物耐逆性的方法，是將編碼本發(fā)明與耐逆性相關(guān)的 KT471基因?qū)胫参锝M織、細(xì)胞或器官，植物耐逆性獲得提高。在上述提高植物耐逆性的方法中，本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的KT471基因既 可為所述基因的cDNA序列，也可為所述基因的基因組基因序列；與所述基因具有90% 以上同源性且編碼相同功能蛋白的DNA序列，是將所述基因的cDNA或基因組基因序列 用已知的方法進(jìn)行分離和/或修飾和/或設(shè)計(jì)得到的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該理解的是， 特定基因序列中核苷酸同一性的微小改變可能會(huì)導(dǎo)致該基因效能的降低或者加強(qiáng)，而且 在一些應(yīng)用(例如，反義或共抑制技術(shù))中，部分序列經(jīng)常會(huì)和全長(zhǎng)序列同樣有效地發(fā)揮 作用?；蛐蛄凶兓蚩s短的方法，以及測(cè)試這些發(fā)生變化的基因的有效性的方法均是 本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)KT471基因或其同源序列可通過(guò)植物表達(dá)載體導(dǎo)入植 物組織、細(xì)胞或器官；用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的出發(fā)載體可為任意一種可用于根瘤 農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物微彈轟擊的載體等，如pBin系列 載體(如pBinl9等)、pBI系列載體(如pBI 101等)、Gateway 系列載體(如pH2GW7 等)、pCAMBIA系列載體(如pCAMBIA 3301等)、per8、pX6或其它衍生植物表達(dá)載 體，所述出發(fā)載體還可為可在原核生物中復(fù)制的載體，如pENTER-TOPO、pUC系列載 體或pBluescript系列載體等。使用本發(fā)明中水稻與耐逆性相關(guān)的KT471基因或其同源序列構(gòu)建植物表達(dá)載 體時(shí)，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型 (ABA、干旱、鹽堿或化學(xué)誘導(dǎo)等)啟動(dòng)子。所述組成性表達(dá)啟動(dòng)子可為花椰菜花葉病毒 (CAMV) 35S啟動(dòng)子，玉米Ubiquitin啟動(dòng)子或水稻actinl啟動(dòng)子等；所述組織特異性表 達(dá)啟動(dòng)子可為根特異性表達(dá)啟動(dòng)子、葉片特異性表達(dá)啟動(dòng)子、維管特異性表達(dá)啟動(dòng)子、 種子特異性表達(dá)啟動(dòng)子、花特異性表達(dá)啟動(dòng)子或花粉特異性表達(dá)啟動(dòng)子，如2S1啟動(dòng)子 (GenBank 號(hào)NM_118848.2，GI: 30687489)禾Π NapinA (GenBank 號(hào)Μ64633.1，GI: 349405)啟動(dòng)子等；所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可為受低溫、干旱、ΑΒΑ、乙烯、鹽堿或化學(xué)等 誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。上述啟動(dòng)子可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子結(jié)合使用。此外，使用 本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子和/或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng) 子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需與編碼序 列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子的來(lái)源 是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來(lái)自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié) 構(gòu)基因。
為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn) 行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS 基因、GFP基因、螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (NPTII)基因、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因、慶大霉素標(biāo)記 物或卡那霉素標(biāo)記物等)或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。所述含新霉 素磷酸轉(zhuǎn)移酶(NPTII)基因的宿主植物細(xì)胞、組織或器官可由卡那霉素或其替代衍生物 如G418等進(jìn)行篩選，含潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(Hygromycin phosphotransferase)基因的宿主植 物細(xì)胞、組織或器官可由潮霉素進(jìn)行篩選。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選 擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。經(jīng)上述方法進(jìn)行篩選后還可采用Southern、 PCR或點(diǎn)雜交等分子檢測(cè)手段對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行檢測(cè)，以確定其是否轉(zhuǎn)化有目的基因。其中，本發(fā)明以pCAMBIA1300為出發(fā)載體，構(gòu)建的含有本發(fā)明水稻與耐逆性 相關(guān)的KT471基因的植物表達(dá)載體命名為pCactF-KT471。攜帶有本發(fā)明水稻與耐逆性相 關(guān)的KT471基因或其同源序列的植物表達(dá)載體可通過(guò)使用原生質(zhì)體_化學(xué)介導(dǎo)法(Ca2+、 PEG)、Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、花粉管導(dǎo)入、微注射、電 激、基因槍、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法中的任何一種或幾種方法的組合轉(zhuǎn)化植物細(xì) 胞、組織或器官，并將轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株；所述組織和器官可包 括宿主植物的果莢、愈傷組織、莖尖、葉片和種子等。此外，通過(guò)將轉(zhuǎn)化有本發(fā)明水稻與耐逆性相關(guān)的KT471基因或其同源序列的轉(zhuǎn) 基因植株進(jìn)行繼代培養(yǎng)后，可從中進(jìn)一步篩選出基因純合的轉(zhuǎn)基因植株。此外，還可對(duì) 該轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行擴(kuò)繁，可使轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性進(jìn)一步改善和提高。所述轉(zhuǎn)基因植物 的擴(kuò)繁包括無(wú)性繁殖和/或種子繁殖。本發(fā)明的方法對(duì)雙子葉植物和單子葉植物均適用，因此，所述被轉(zhuǎn)化的植物細(xì) 胞、組織或器官既可來(lái)源于煙草、油菜、棉花、大豆、楊樹(shù)、桉樹(shù)、馬鈴薯或牧草等雙 子葉植物，也可來(lái)源于水稻、玉米、小麥、大麥、高梁、谷子或草坪草等單子葉植物。本發(fā)明提供了一個(gè)與耐逆性相關(guān)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子家族基因KT471。實(shí)驗(yàn)證明， 將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可提高水稻對(duì)高鹽和低溫逆境脅迫的耐受性。本發(fā)明的蛋白及 其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重 要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作 用，應(yīng)用前景廣闊。下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1表達(dá)載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜。LB和RB分別為T-DNA的左邊界和 右邊界；hyg表示潮霉素抗性；p35S表示35S基因的啟動(dòng)子；CaMV35S ter表示35S基因 的終止子；pActl表示水稻Actinl基因的啟動(dòng)子；3flag表示3倍的flag標(biāo)簽序列；OCS 表示ocs基因的終止子；HindIIK KpnK SpeK XbaK SalI和PstI分別表示限制性內(nèi)切酶
的酶切位點(diǎn)。圖2KT471轉(zhuǎn)基因株系的耐鹽性分析。A:鹽處理前苗生長(zhǎng)狀態(tài)；B:鹽處理后 苗生長(zhǎng)狀態(tài)；C:正常培養(yǎng)一周后苗生長(zhǎng)狀態(tài)；D:鹽處理存活率統(tǒng)計(jì)。
圖3KT471轉(zhuǎn)基因株系的耐冷性分析。A 冷處理前苗生長(zhǎng)狀態(tài)；B 苗生長(zhǎng)狀態(tài)；C:正常培養(yǎng)一周后苗生長(zhǎng)狀態(tài)；D:冷處理存活率統(tǒng)計(jì)。圖4KT471轉(zhuǎn)基因株系的耐旱性分析。A:旱處理前苗生長(zhǎng)狀態(tài)；B 苗生長(zhǎng)狀態(tài)；C:正常培養(yǎng)一周后苗生長(zhǎng)狀態(tài)；D:旱處理存活率統(tǒng)計(jì)。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)《分子克 隆》。所用引物及DNA序列均由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，測(cè)序由北京華大基因 研究中心完成，載體構(gòu)建過(guò)程中的核酸限制性內(nèi)切酶及T4 DNA連接酶等均購(gòu)自NEB公 司，方法均參照試劑盒提供的方法進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中所用的載體骨架來(lái)自于pCAMBIA1300。1、KT471基因的分離從KT471基因的編碼起始位點(diǎn)ATG開(kāi)始設(shè)計(jì)5’端引物，于終止密碼處設(shè)計(jì)3’ 端引物引物1:5，GCACGCtctagaATGCAGCATGATGCCATATCCAAC 3’引物2:5，GCACGCgtcgacTTAAGCTACTTCTAATGTTCGTGG 3，弓丨物1中tctaga序列為限制性內(nèi)切酶XbaI的酶切位點(diǎn)，下劃線標(biāo)識(shí)的序列為 KT471基因的編碼序列；弓丨物2中g(shù)tcgac序列為限制性內(nèi)切酶SalI的酶切位點(diǎn)，下劃線 標(biāo)識(shí)的序列為KT471基因的編碼序列。提取幼苗期的日本晴水稻的總RNA，通過(guò)反轉(zhuǎn)錄得到CDNA作為模板，用以上 引物擴(kuò)增KT471基因的全長(zhǎng)，其大小為513bp，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 2 所示，所編碼的蛋白質(zhì)氨基酸序列如序列表中的SEQIDNO : 1所示。具體反應(yīng)為取約2 μ g的總RNA，力卩入1 μ 1 10 X DNase buffer, 1 μ 1的 DNase,補(bǔ)DEPC處理過(guò)的水至10 μ 1體系，混勻，37 °C溫育30min后，力卩入1 μ 1 的 RQ DNase stop solution, 65 °C 溫育 IOmin 以終止反應(yīng)后，力卩入 2μ1 Oligo (dT) 18 primer (0.1 μ g/ μ 1), 4 μ 1 5 X First-strand buffer, 1 μ 1 Ribonuclease inhibitor (40U/ μ 1)，
2 μ 1 4 X dNTP (各 IOmM)，1 μ 1 MMLV Reverse Transcriptase (200U/ μ 1)，小心混勻， 37°C保溫1小時(shí)。然后90°C處理5分鐘，冰上冷卻，離心收集即獲得相應(yīng)的反轉(zhuǎn) 錄產(chǎn)物cDNA。將得到的cDNA稀釋10倍，取1 μ 1作為PCR反應(yīng)的模板，上、下 游弓 I 物(ΙΟμΜ)各 Ιμ ，LA Taq 酶(5U/μ 1) 0.5 μ 1，4 XdNTPs (各 IOmM) 1 μ 1， 2 X GCbuffer (Mg2+) 25 μ 1，H2O 20.5 μ 1。PCR 反應(yīng)條件為預(yù)熱 95 °C 5min，變性 94°C Imin,退火56°C30sec，延伸72°C lmin50sec，34個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得了大小分別與預(yù)期結(jié)果相符的DNA片段。分 別回收并純化上述片段，將其連接入載體pEASY-Tl (全式金公司)中，通過(guò)熱激法轉(zhuǎn)化 大腸桿菌(E.coli)TOP 10菌株，挑選陽(yáng)性菌落加入到5ml含50mg/L卡那霉素的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C、200rpm的搖床中培養(yǎng)12-16小時(shí)，提取質(zhì)粒，分別得到含有目的片段 的重組質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證正確后，用XbaI和SalI雙酶切切下目的片段KT471，連入進(jìn)行相 同雙酶切的pCactF植物表達(dá)載體，構(gòu)建得到載體pCactF-KT471。挑取菌落PCR鑒定為 陽(yáng)性的菌落進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。植物表達(dá)載體pCactF的T-DNA區(qū)圖譜如圖1所示。2、KT471轉(zhuǎn)基因水稻的獲得
冷處理后 旱處理后
用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將按具體實(shí)施方式
1獲得的與耐逆性相關(guān)的基因KT471轉(zhuǎn)化水 稻，具體方法如下利用熱激法將上述重組載體pCactF_KT471轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌AGLO菌株(中國(guó)科學(xué)院 遺傳所贈(zèng)送)，利用農(nóng)桿菌對(duì)水稻進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。將獲得的水稻轉(zhuǎn)基因植株的部分葉片，按常規(guī)方法提取總DNA，在正向引物 5，-ACTCACCGCGACGTCTGT-3，和反向引物 5，-TTCCTTTGCCCTCGGACG-3，的
引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因，經(jīng)擴(kuò)增獲得1009bpDNA片段的為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因 植株，檢測(cè)結(jié)果表明用上述方法獲得了轉(zhuǎn)化有pCactF-KT471的轉(zhuǎn)基因水稻。3、KT471轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽性分析收獲KT471的Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取6個(gè)系進(jìn)行鹽脅迫實(shí)驗(yàn)。用水浸種 培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以轉(zhuǎn)空載體的水稻中花11 作對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn) 基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無(wú)抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表明獲 得了具有單位點(diǎn)插入的KT471& T1轉(zhuǎn)基因株系，待苗長(zhǎng)到8cm左右時(shí)，將小苗從培養(yǎng)皿 中轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每瓶10株，三個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期(第3片葉完全舒展)，其生 長(zhǎng)狀態(tài)如圖2A。改用含有200mM NaCl的Hoagland溶液進(jìn)行鹽篩，約3天左右，對(duì)照 出現(xiàn)葉尖發(fā)黃泛白，葉片下垂或半卷甚至全卷時(shí)(圖2B)，洗去鹽溶液，正常培養(yǎng)。期 間每1.5天更換一次鹽溶液。復(fù)水第二天再更換一次營(yíng)養(yǎng)液，以去除剩余的鹽分。三角 瓶中的營(yíng)養(yǎng)液2天更換一次，以保持營(yíng)養(yǎng)液的新鮮狀態(tài)。一周后照相(圖2C)，統(tǒng)計(jì)成 活苗數(shù)，計(jì)算耐鹽苗比例，結(jié)果如圖2D(橫坐標(biāo)為不同的轉(zhuǎn)基因株系編號(hào)，縱坐標(biāo)為耐 鹽苗百分比)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，T1代轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)鹽的耐受能力明顯高于未轉(zhuǎn)基因 水稻植株，經(jīng)鹽處理后，KT471轉(zhuǎn)基因水稻T1代陽(yáng)性株系的植株恢復(fù)培養(yǎng)后能夠繼續(xù)生 長(zhǎng)，轉(zhuǎn)空載體的中花11對(duì)照(CK)植株的葉片發(fā)黃、卷曲、干枯，莖桿不能直立，恢復(fù) 培養(yǎng)后很快死亡(圖2C)。在獲得KT471轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們?cè)僖淮芜M(jìn)行了耐鹽性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明KT471基因具有增強(qiáng)水稻耐鹽性的能力。4、KT471轉(zhuǎn)基因植株耐低溫性分析收獲KT471的Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取5個(gè)以上的系進(jìn)行低溫篩選。用水 浸種培養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以轉(zhuǎn)空載體的水稻中 花11作對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分 析轉(zhuǎn)基因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無(wú)抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表 明獲得了具有單位點(diǎn)插入的KT471的Tl轉(zhuǎn)基因株系，待苗長(zhǎng)到8cm左右時(shí)，將小苗從培 養(yǎng)皿中轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每瓶10株，三個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期(第3片葉完全舒展)， 其生長(zhǎng)狀態(tài)如圖3A。開(kāi)始4°C冷篩，當(dāng)對(duì)照新葉、老葉全卷后1至2天(圖3B)，重新 正常培養(yǎng)，期間三角瓶中的營(yíng)養(yǎng)液2天更換一次，以保持營(yíng)養(yǎng)液的新鮮狀態(tài)。低溫篩選 結(jié)果如圖3C所示，轉(zhuǎn)空載體對(duì)照株系大部分都已發(fā)黃、萎蔫、死亡，而轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn) 出很強(qiáng)的低溫耐受力和恢復(fù)能力，恢復(fù)一周后的存活率統(tǒng)計(jì)如圖3D所示，轉(zhuǎn)基因株系的 存活率均比對(duì)照要高。在獲得KT471轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們?cè)僖淮芜M(jìn)行了耐低溫實(shí)驗(yàn)，結(jié)果與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明KT471基因具有增強(qiáng)水稻耐受低溫的能力。5、KT471轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性鑒定收獲KT471的Tl代轉(zhuǎn)基因水稻種子，選取4個(gè)系進(jìn)行干旱脅迫。用水浸種培 養(yǎng)3天使其萌發(fā)，然后用50mg/L潮霉素進(jìn)行抗性篩選，同時(shí)以轉(zhuǎn)空載體的水稻中花11作 對(duì)照，篩選5天后，對(duì)照植株全部死亡，統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)基因植株抗性苗與死亡苗數(shù)，分析轉(zhuǎn)基 因植株的抗性分離比，選擇抗性苗與無(wú)抗性苗的分離比約為3 1的株系，結(jié)果表明獲得 了具有單位點(diǎn)插入的KT471的Tl轉(zhuǎn)基因株系，待苗長(zhǎng)到8cm左右時(shí)，將小苗從培養(yǎng)皿中 轉(zhuǎn)移到三角瓶中，每瓶10株，三個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)至三葉期時(shí)(第3片葉完全舒展)，進(jìn)行 急性干旱處理。旱篩前將苗根部洗凈，選生長(zhǎng)狀態(tài)(粗細(xì)、株高)一致的苗(圖4A)， 用吸水紙將根部水吸干，放入干燥的新三角瓶中。每瓶詳細(xì)記錄干旱起始時(shí)間，篩選至 對(duì)照莖稈部分九成干或以上。旱篩過(guò)程大約9個(gè)小時(shí)左右(視表型而定)，然后復(fù)水， 三角瓶中的營(yíng)養(yǎng)液2天更換一次，以保持營(yíng)養(yǎng)液的新鮮狀態(tài)。干旱處理后的苗生長(zhǎng)狀態(tài) 如圖4B所示，復(fù)水正常培養(yǎng)一周后苗恢復(fù)狀態(tài)如圖4C所示。最后統(tǒng)計(jì)各株系的苗存活 率，如圖4D的柱形圖所示，CK的存活率為10%，而轉(zhuǎn)KT496基因的株系的存活率均在 40%及以上，存活率遠(yuǎn)高于對(duì)照。在獲得KT471轉(zhuǎn)基因水稻T2代的種子后，我們?cè)僖淮芜M(jìn)行了耐旱性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果 與上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。此實(shí)驗(yàn)說(shuō)明KT471基因具有增強(qiáng)水稻耐旱性的作用。
權(quán)利要求
1.一種增強(qiáng)植物抗逆性的方法，其特征是將植物抗逆相關(guān)蛋白的編碼基因插入表達(dá) 載體，獲得含有植物抗逆相關(guān)蛋白編碼基因的重組表達(dá)載體，將該重組表達(dá)載體導(dǎo)入目 的植物，從表達(dá)所述植物抗逆相關(guān)蛋白的植株或所述植物抗逆相關(guān)蛋白表達(dá)量增加的植 株中篩選得到抗逆性增強(qiáng)的植株；其中，所述植物抗逆相關(guān)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)植物抗逆性的方法，其特征在于所述植物抗性相關(guān)蛋白 的編碼基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQID NO 2所示的核苷酸序列；2)與SEQID NO 2序列具有90%以上相似性且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于將所述抗逆相關(guān)蛋白編碼基因?qū)胫参锝M 織、細(xì)胞或器官，再將被轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞、組織或器官培育成植株，得到耐逆性提高的 轉(zhuǎn)基因植物。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述表達(dá)載體的特征是用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載 體的出發(fā)載體是一種可用于根瘤農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物的雙元載體或可用于植物 微彈轟擊的載體，或者是可在原核生物中復(fù)制的載體。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述表達(dá)載體的特征是用所述抗逆相關(guān)蛋白編碼 基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，用一種增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子來(lái)驅(qū)動(dòng) 其表達(dá)。
6.權(quán)利要求4所述的方法，其中所述出發(fā)載體為pCAMBIA系列載體，優(yōu)選為 pCAMBIA1300。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述增強(qiáng)植物的抗逆性是指增強(qiáng)植物耐受低溫、干旱 和高鹽的能力。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗逆相關(guān)蛋白可用于增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐逆性。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因水稻的耐逆性是指增強(qiáng)了水稻對(duì)低 溫、干旱和高鹽的耐受性。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一個(gè)來(lái)源于水稻的與耐逆性相關(guān)的基因KT471。實(shí)驗(yàn)證明，將本發(fā)明的基因轉(zhuǎn)化水稻可顯著提高水稻對(duì)干旱、高鹽和低溫脅迫的耐受性。本發(fā)明的蛋白及其編碼基因?qū)τ谥参锬湍鏅C(jī)制的研究，以及提高植物的耐逆性及相關(guān)性狀的改良具有重要的理論及實(shí)際意義，將在植物(特別是禾谷類作物)的耐逆基因工程改良中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)A01H5/00GK102021183SQ20101056604
公開(kāi)日2011年4月20日 申請(qǐng)日期2010年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月25日
發(fā)明者劉春霞, 劉雨, 周君莉, 李早霞, 李曉娟, 王喜萍 申請(qǐng)人:北京未名凱拓作物設(shè)計(jì)中心有限公司