專利名稱：一種復合生防制劑及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬生物技術領域，涉及生防制劑-植物提取液與生物菌復合的生防制劑及其制備方法和在防治植物病害方面的應用。
背景技術：
在世界范圍內(nèi)，植物病害普遍地給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的損失?，F(xiàn)以水稻根線蟲 (Hirschmannielaspp.)為例，根線蟲是水稻的重要寄生線蟲病害，主要侵染稻根，直接影響水稻分蘗，據(jù)估計全世界有58%的水稻田遭潛根線蟲的嚴重侵害，產(chǎn)量損失達25%，重者達40%。目前，化學防治仍是植物寄生線蟲病害最主要的防治措施，但諸如氯化苦、溴甲烷、 克百威、克線磷、滅多威等傳統(tǒng)化學殺線劑的使用成本高，環(huán)境相容性較差。隨著綠色消費觀念的形成和迅速普及，迫切需要開發(fā)出安全、高效、低毒的新型生物合理殺線蟲劑。這類植物病害在目前生產(chǎn)上主要以化學防治為主，不僅藥劑難以長期持續(xù)有效，還嚴重污染環(huán)境。農(nóng)作物施用農(nóng)藥后，極大影響品質(zhì)，且嚴重危害人體健康，導致人畜中毒等后果。隨著人類環(huán)保意識的加強，大力發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)已經(jīng)成為新的時代要求，生物防治作為綠色農(nóng)業(yè)的內(nèi)容越來越受到人們的關注。在植物病害生物防治領域中，微生物所發(fā)揮的作用越來越大，微生物農(nóng)藥的研究逐步成為生物防治的支柱產(chǎn)業(yè)。目前，植物病害的生防菌多，是從土壤、根際或植物體表分離的真菌和細菌，但其所處的生態(tài)環(huán)境因受到外界的紫外線、暴風雨和化學物質(zhì)等惡劣環(huán)境因素的影響，致使其定殖力差，往往在實驗室中有一定的防治效果，而在大田生產(chǎn)實際中往往會出現(xiàn)防效不穩(wěn)定。加之由于生物防治菌對化學殺菌劑普遍敏感，且其效期短，對多數(shù)疫病難以起到防治作用，嚴重限制了其應用范圍。因此，增加生物防治菌的抗化學殺菌劑的能力、擴大對病菌的防治范圍，成為當前急需解決的技術難題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明著眼點在于選用對多種植物病原菌有抑菌活性并且可使作物增產(chǎn)的植物， 對其組織液進行提取，再與自篩菌種復配，制成一種復合生防制劑，使其能夠防治多種病害，且又具有增產(chǎn)作用，在多效性及廣譜性上優(yōu)于現(xiàn)有的微生物制劑。本發(fā)明的目的是提供一種廣譜抗病促生長的植物提取液、生物菌復合生防制劑。 本發(fā)明人以植物生態(tài)學原理為基礎，從具有抗菌作用的臭椿(Ailanthus altissima)、夾竹桃(Amsonia tabernaemontana)等植物組織中，提取具有防治植物病害作用的組織提取液， 經(jīng)與生物菌復配后，進行抑菌能力測試等試驗，經(jīng)過大量實驗篩選，確定了抑菌能力強、抑菌譜寬的復配方案，最終得到本發(fā)明臭椿提取液復合生防制劑。經(jīng)過實驗室、盆栽和大田實驗對比，證明本發(fā)明復合生物制劑可以直接對病原菌產(chǎn)生拮抗作用和誘導作物產(chǎn)生抗病作用，同時具有防治線蟲病效果，克服了目前一些生防藥物防治效果單一的問題。另外，本發(fā)明的定殖性好、受環(huán)境影響小，能與植物長期共存，作用穩(wěn)定持久。實驗同時表明，本發(fā)明復合生防制劑，在防治多種植物病害的同時，對植物生長具有顯著促進作用，使綜合防治與作物增產(chǎn)的目的實現(xiàn)成為可能。本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗研究，創(chuàng)新了制備臭椿植物組織提取液關鍵技術，并利用自篩菌種進行復配，成功地研制出制出含有臭椿提取液的復合生防制劑，收到非常好的防病抗病和殺線蟲效果，經(jīng)過盆栽試驗、大田試驗及相關對比試驗證明，本發(fā)明復合生防制劑在農(nóng)作物、果樹、蔬菜等植物方面具有廣譜抗菌、防病治病效果。本發(fā)明所述的含有臭椿提取液的復合生防制劑，其主要活性組分包括臭椿植物組織提取液、夾竹桃植物組織提取液以及自篩哈茨木霉(Trichoderma harzianum)復合菌種 MDCGTH 18的發(fā)酵培養(yǎng)物。其中，哈茨木霉復合菌種MDCGTH 18已在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)進行保藏，地址為北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學院微生物研究所，保藏日期為2009年3月19號，保藏編號為CGMCCN0. 2965。上述復合生物制劑中，各活性組分的重量用量比例為臭椿提取液夾竹桃提取液哈茨木霉復合菌發(fā)酵培養(yǎng)物=(1 2) (1 2) (1 2)。依據(jù)藥效和經(jīng)濟成本多方綜合考慮，各活性組分的優(yōu)選用量比例為1 2 1。上述臭椿植物組織提取液是采集臭椿葉、皮為原料，經(jīng)烘干、粉碎后，用乙醇提取制得。上述夾竹桃植物組織提取液是采集夾竹桃花、葉、皮為原料，經(jīng)烘干、粉碎后，用乙醇提取制得。上述哈茨木霉復合菌發(fā)酵培養(yǎng)物是用哈茨木霉(Trichodermaharzianum)復合菌種MDCGTH 18，經(jīng)培養(yǎng)發(fā)酵制得。本發(fā)明所述復合生防制劑的具體制備步驟如下1.植物組織提取液的制備方法(1)臭椿提取液的制備方法如下①臭椿采集于四月份分別收集選取無蟲害、無菌感染、無腐爛的臭椿的葉、皮，洗去浮塵，晾干備用。②烘干將采集到的臭椿葉、皮原料分別置于干燥箱，50°C烘干Mh③粉碎將烘干后的臭椿葉、皮按(50 80) (20 50)重量比例混合，用破碎機粉碎，過20目分樣篩，④提取以95%乙醇為提取劑，按每100L乙醇處理6kg干燥臭椿粉的配料比例， 將臭椿葉、皮混合粉末投入預熱至50°C的提取劑乙醇中，攪拌均勻并自然冷卻至25°C，然后在300r/min攪拌下，浸泡提取M小時。⑤過濾過濾除去固體殘渣，所得提取液用于復配。(2)夾竹桃提取液制備方法如下①夾竹桃采集分別收集選取無蟲害、無菌感染、無腐爛的夾竹桃的花、葉、皮，洗去浮塵，晾干備用。②烘干將采集到的夾竹桃的花、葉、皮分別置于干燥箱，50°C烘干Μι。③粉碎將烘干后的夾竹桃的花、葉、皮按(40 50) (30 40) (20 30) 重量比例混合，用破碎機粉碎，過20目分樣篩。
④提取以95%乙醇為提取劑，按每100L乙醇處理6kg干燥夾竹桃粉的配料比例，將夾竹桃的花、葉、皮混合粉末投入預熱至50°C的提取劑乙醇中，攪拌均勻并自然冷卻至25°C，然后在300r/min攪拌下，浸泡提取M小時。⑤過濾過濾除去固體殘渣，所得提取液用于復配。2.哈茨木霉復合菌發(fā)酵培養(yǎng)物的制備(1)哈茨木霉菌(Trichoderma harzianum)的篩選①樣品的采集山東萊蕪果園蘋果樹下土壤；②分離純化用無菌生理鹽水作梯度稀釋，TSM培養(yǎng)基(木霉菌半選擇培養(yǎng)基)平板上培養(yǎng)，挑取菌落形態(tài)近似木霉菌的單菌落，轉(zhuǎn)接PDA平板純化培養(yǎng)，經(jīng)鏡檢、其它理化檢驗鑒定為哈茨木霉菌，編號保存于PDA斜面上。上述TSM 培養(yǎng)基(木霉菌半選擇培養(yǎng)基)=MgSO4 · 7H20 0. lg, K2HPO4,0. 45g，KCI 0. 08g，NH4NO3O. 5g，葡萄糖1. 54，玫瑰紅0. 08，60%敵克松可濕性粉劑0. 15g，PCNBO. lg，瓊脂7. 5g，水500mL。121°C滅菌20min備用，無菌操作加入氯霉素，使培養(yǎng)基氯霉素含量達到 100μ g/mL0上述PDA培養(yǎng)基取土豆100g，洗凈切成小塊，用水煮沸30min，用紗布過濾，保留濾液，加入5g葡萄糖，7. 5g瓊脂，定容至500mL，121°C滅菌20min備用，無菌操作加入氯霉
素，使培養(yǎng)基氯霉素含量達到100μ g/mL。③篩選PDA平板中加入指示病原菌株，測定自篩哈茨木霉菌的抑菌帶寬、抑菌能力，用以選擇生產(chǎn)菌種。(2)毛殼菌(Chaetomium globosum)的篩選①樣品的采集山東萊蕪果園桃樹下土壤；②篩選分別稱取2g不同土壤樣品各放入一個三角燒瓶中，每瓶加無菌水20mL， 置于恒溫箱中培養(yǎng)3d。然后在無菌室內(nèi)分別接一環(huán)菌懸液到液體培養(yǎng)基中(液體培養(yǎng)基內(nèi)預先放入一條IcmX 5cm的濾紙?zhí)峁┨荚?。在恒溫箱中培養(yǎng)7d，挑選在濾紙條上生長的菌落，分別接入滅菌后的平皿培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)3 4d后，挑取少許菌落制成玻片，鏡檢確定毛殼菌菌株。上述液體培養(yǎng)基為(NH4)2SO4O.2g，MgSO4O. 05g，KH2PO4O. lg, CaCl2O. lg, H2O 100ml, pH 5. 5 ;121°C 滅菌 20min 備用。上述平皿培養(yǎng)基為CMC-Na20g, KH2P042g, (NH4)2SO4L 4g, MgSO4O. 3g, CaCl2O. 3g, FeSO4 ‘ 7H20 5mg，MnSO4L 6mg，ZnCl2L 7mg，瓊脂 20g，H2O 1000ml, pH 5. 5 ;121°C滅菌 20min③分離純化從平皿培養(yǎng)基中挑取長有毛殼菌的菌落，按照平皿稀釋劃線法分離接種。于恒溫箱中倒置培養(yǎng)3d，然后選擇典型的毛殼菌單菌落，轉(zhuǎn)接到相應的斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后得到純的毛殼菌菌種。④篩選抗性能力強的毛殼菌在培養(yǎng)基中加入多菌靈(10yg/ml)，選擇能正常生長的毛殼菌作為生產(chǎn)菌株。C3)混合將上述篩選出的優(yōu)勢明顯的毛殼菌菌株與哈茨木霉菌菌株，按2 1比例進行混合，即獲得哈茨木霉(Trichodermaharzianum)MDCGTH 18菌種。該菌種已于2009 年3月19日在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏編號為CGMCC
6NO. 2965。(4)復合菌的發(fā)酵培養(yǎng)①斜面培養(yǎng)采用固體PDA培養(yǎng)基，將哈茨木霉MDCGTH 18復合菌種接種在試管培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2 3天。②茄瓶培養(yǎng)采用液體PD培養(yǎng)基(除不使用瓊脂外，配方與PDA培養(yǎng)基相同，)，將試管菌種接種在茄瓶液體培養(yǎng)基中，置于搖床上振蕩培養(yǎng)3 4天。③液體菌種培養(yǎng)物采用種子培養(yǎng)基玉米粉2%，葡萄糖0. 5%，豆餅粉1 %，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，碳酸鈣1%，pH 6.0 ；在121°C滅菌40min，將1 2個茄瓶的種子用無菌水洗下，接種于150立升的種子罐內(nèi)，30°C培養(yǎng)，通氣量1 :0. 6 0.8，攪拌速度為200r/min，培養(yǎng)時間為36 48h。④固體菌種培養(yǎng)物采用固體培養(yǎng)基麩皮稻殼玉米粉=7 1 2，含水量為70% (其中包括接種的液體菌種的水分)，pH6.0 ;121°C滅菌40min后，以循環(huán)水冷卻，在接種器內(nèi)將液體菌種與固體培養(yǎng)基混合均勻，接種量為5 10%，接種完畢轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5 7天，最終產(chǎn)品菌體密度為IO8 IO9個/g。3.復合生防制劑的配制將上述制備的臭椿提取液、夾竹桃提取液和哈茨木霉MDCGTH 18發(fā)酵培養(yǎng)物(包括液體或固體培養(yǎng)物)，按(1 2) (1 2) (1 2)的重量比例，進行混合復配，作為主要殺菌抗菌活性組分；依據(jù)現(xiàn)有生物殺菌劑技術，添加適宜輔料、助劑、溶劑或/和，加工為不同劑型的復合生防制劑。本發(fā)明所涉及用量比例或百分比，除特別標明外，均為重量比或重量百分比。經(jīng)室內(nèi)和大田試驗確認，本發(fā)明復合生防制劑，可應用于防治水稻根線蟲、紋枯病、晚疫病、蔬菜灰霉病、蕃茄病毒病、黃瓜白粉病、靶斑病、大姜姜瘟病、西瓜枯萎病、煙草青枯病、小麥赤霉病、全蝕病、根腐病、棉花枯萎病、蘋果輪紋病、苦痘病、桃樹根癌病、柑橘黃龍病、石榴枯萎病、山楊根腐病等多種植物病害。本發(fā)明復合生防制劑主要活性組分既含有具有抗菌活性的組織提取液，又含有抗菌微生物，兩者具有增效作用，對病原微生物有較強的抑制作用，抑菌同時又能誘導植物自身產(chǎn)生抗性來控制病害。本發(fā)明復合生防制劑的自篩菌種MDCGTH 18具有生長速度快，菌絲粗大，子囊殼黑色，育菌周期短等特點，使其產(chǎn)業(yè)化更加方便、容易。實驗證明，本發(fā)明復合生防制劑在非選擇壓力下連續(xù)培養(yǎng)十代，抗藥穩(wěn)定性不變， 該性狀說明其目的基因表達非常穩(wěn)定，有利于這一菌劑應用于植物病害的綜合防治的實踐中；大田實驗表明，采用本發(fā)明復合生防制劑能持續(xù)控制晚疫病，提高生防效果，保護環(huán)境。將優(yōu)良菌株的定殖能力、代謝產(chǎn)物、誘導杭病作用以及對植物促生作用有機地接合起來。本發(fā)明復合生防制劑在植物病害的生物防治中具有持續(xù)有效、防治效果好、無污染、對人畜安全、無殘留、特異性強等優(yōu)點，且有利于保護環(huán)境、保持生態(tài)平衡。
具體實施例方式
實施例1.臭椿、夾竹桃不同部位組織提取液殺線蟲活性試驗對比分別對臭椿皮、葉以及夾竹桃的花、葉、皮部位組織液進行提取，分別向不同提取液中，接入線蟲，24h后統(tǒng)計線蟲的存活情況，統(tǒng)計線蟲的存活數(shù)、死亡數(shù)，計算死亡率，線蟲在植物提取液中24h平均死亡率0 10.0%者，測定結(jié)果用“一”表示；死亡率在10. 30.0%者，測定結(jié)果用“ + ”表示；死亡率在30. 50.0%者，測定結(jié)果用“++”表示；死亡率在50. 1<% 80.0%者，測定結(jié)果用“+++”表示；死亡率在80. 100%者，測定結(jié)果用 “++++” 表示。結(jié)果如表1所示表1不同部位提取液的殺線蟲效果
權利要求
1.一種復合生防制劑，其特征在于主要活性組分包括臭椿植物組織提取液、夾竹桃植物組織提取液以及哈茨木霉(Trichodermaharzianum)復合菌種MDCGTH 18的發(fā)酵培養(yǎng)物。
2.如權利要求1所述的復合生防制劑，其特征在于所述哈茨木霉(Trichoderma harzianum)復合菌種MDCGTH 18已在中國微生物保藏管理委員會普通微生物中心進行保藏，保藏日期為2009年3月19號，保藏編號為CGMCCN0.四65。
3.如權利要求1所述的復合生防制劑，其特征在于所述主要活性組分的重量用量比例為臭椿提取液夾竹桃提取液哈茨木霉MDCGTH 18發(fā)酵培養(yǎng)物=(1 2) (1 2) (1 2)。
4.如權利要求1所述的復合生防制劑，其特征在于所述主要活性組分的優(yōu)選重量用量比例為臭椿提取液夾竹桃提取液哈茨木霉MDCGTH 18發(fā)酵培養(yǎng)物=1:2:1。
5.如權利要求1所述的復合生防制劑的制備方法，其特征在于將臭椿提取液、夾竹桃提取液和哈茨木霉MDCGTH 18液體發(fā)酵培養(yǎng)物或固體發(fā)酵培養(yǎng)物，按重量比例(1 2) (1 2) (1 2)，進行混合復配，作為主要殺菌抗菌活性組分；加工為不同劑型的復合生防制劑。
6.如權利要求1或5所述的復合生防制劑的制備方法，其特征在于所說的臭椿提取液的制備方法如下①臭椿采集于四月份分別收集選取無蟲害、無菌感染、無腐爛的臭椿的葉、皮，洗去浮塵，晾干備用。②烘干將采集到的臭椿葉、皮原料分別置于干燥箱，50°C烘干Mh③粉碎將烘干后的臭椿葉、皮按(50 80) (20 50)重量比例混合，用破碎機粉碎，過20目分樣篩，④提取以95%乙醇為提取劑，按每100L乙醇處理6kg干燥臭椿粉的配料比例，將臭椿葉、皮混合粉末投入預熱至50°C的提取劑乙醇中，攪拌均勻并自然冷卻至25°C，然后在 300r/min攪拌下，浸泡提取M小時。⑤過濾過濾除去固體殘渣，所得提取液用于復配。
7.如權利要求1或5所述的復合生防制劑的制備方法，其特征在于所說的夾竹桃提取液制備方法如下①夾竹桃采集分別收集選取無蟲害、無菌感染、無腐爛的夾竹桃的花、葉、皮，洗去浮塵，晾干備用。②烘干將采集到的夾竹桃的花、葉、皮分別置于干燥箱，于50°C烘干Mh。③粉碎將烘干后的夾竹桃的花、葉、皮按(40 50) (30 40) (20 30)重量比例混合，用破碎機粉碎，過20目分樣篩。④提取以95%乙醇為提取劑，按每100L乙醇處理6kg干燥夾竹桃粉的配料比例， 將夾竹桃的花、葉、皮混合粉末投入預熱至50°C的提取劑乙醇中，攪拌均勻并自然冷卻至 25°C，然后在300r/min攪拌下，浸泡提取M小時。⑤過濾過濾除去固體殘渣，所得提取液用于復配。
8.如權利要求1或5所述的復合生防制劑的制備方法，其特征在于所說的哈茨木霉MDCGTH 18發(fā)酵培養(yǎng)物的制備方法如下①斜面培養(yǎng)采用固體PDA培養(yǎng)基，將哈茨木霉MDCGTH18返回菌種接種在試管培養(yǎng)基上，28°C培養(yǎng)2 3天。②茄瓶培養(yǎng)采用液體PD培養(yǎng)基，將試管菌種接種在茄瓶液體培養(yǎng)基中，置于搖床上振蕩培養(yǎng)3 4天。③液體菌種培養(yǎng)物采用種子培養(yǎng)基，玉米粉2%，葡萄糖0. 5 %，豆餅粉1 %，磷酸氫二鉀0.2%，磷酸二氫鉀0.3%，碳酸鈣1%，pH 6.0，在121°C滅菌40min，將1 2個茄瓶的種子用無菌水洗下，接種于150立升的種子罐內(nèi)，30°C培養(yǎng)，通氣量1 0.6 0.8，攪拌速度為200r/min，培養(yǎng)時間為36 48h。④固體菌種培養(yǎng)物采用固體培養(yǎng)基，麩皮稻殼玉米粉=7 1 2，含水量為 70 %，pH6. 0，121°C滅菌40min后，以循環(huán)水冷卻，在接種器內(nèi)將液體菌種與固體培養(yǎng)基混合均勻，接種量為5 10%，接種完畢轉(zhuǎn)移到固體培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，30°C培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為5 7天，最終產(chǎn)品菌體密度為IO8 IO9個/g。
9.如權利要求1所述的復合生防制劑的應用，其特征在可用于防治水稻根線蟲、紋枯病、晚疫病、蔬菜灰霉病、蕃茄病毒病、黃瓜白粉病、靶斑病、大姜姜瘟病、西瓜枯萎病、煙草青枯病、小麥赤霉病、全蝕病、根腐病、棉花枯萎病、蘋果輪紋病、苦痘病、桃樹根癌病、柑橘黃龍病、石榴枯萎病、山楊根腐病。
全文摘要
本發(fā)明為一種復合生防制劑及其應用，涉及植物組織液的提取與自篩菌種的復配技術。本發(fā)明使用的自篩菌種MDCGTH18登記編號為CGMCC NO.2965。臭椿葉、夾竹桃花提取液與該菌株經(jīng)復配后，能有效抑制多種病菌的繁殖，同時能在植物體內(nèi)誘發(fā)防衛(wèi)反應，使植物本身具有抗病能力，對多種植物病原真菌、細菌及線蟲都有很強的抑菌活性，可用于多種植物病害的生物防治，具有抑菌活性強，且抗菌譜廣優(yōu)異效果。
文檔編號A01N65/08GK102177921SQ201010516598
公開日2011年9月14日 申請日期2010年10月22日 優(yōu)先權日2010年10月22日
發(fā)明者于磊娟, 劉冰, 劉和現(xiàn), 劉旭 申請人:劉和現(xiàn)