專利名稱：一種用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑和抗凍稀釋液及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及哺乳動物精液的超低溫冷凍保存，特別涉及一種用于家畜精液冷凍保 存的抗凍劑和抗凍稀釋液及其制備方法，屬于生物技術領域。
背景技術：
哺乳動物精液冷凍保存技術為高度集約化的現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展提供了重要的技術 支持。當甘油作為一種冷凍保護劑被用于精液冷凍保存以來，世界各國就開始了大規(guī)模的 研究與應用。精液冷凍保存時間可以長達數(shù)十年之久，解決了哺乳動物雄性種質(zhì)資源保護 問題，使雄性優(yōu)良種質(zhì)資源的使用不受時間、地域的限制，便于開展省際、國際之間的協(xié)作， 提高優(yōu)良種畜的利用率；在建立全球優(yōu)良物種基因庫，延長優(yōu)良種畜的使用壽命；在及早 進行后裔測定，縮短世代間隔和加快動物育種進程方面以及在保留和恢復精液供應、血統(tǒng) 更新、引種、降低生產(chǎn)成本等方面均有重要意義。精液冷凍是保存遺傳資源，建立精子基因庫的重要措施。而冷凍精子質(zhì)量好壞與 家畜的妊娠率、分娩率等密切相關。從目前的情況來看，盡管冷凍精液已經(jīng)應用于養(yǎng)牛生 產(chǎn)，但需要進一步提高精子活率和受精能力；而豬精子在冷凍解凍以后的精子活率、頂體完 整率、質(zhì)膜完整率等要遠低于新鮮精液，精子DNA、線粒體等的損傷要高于新鮮精液，導致在 商品化養(yǎng)豬生產(chǎn)中，利用冷凍精液進行人工授精時母豬的受胎率和產(chǎn)仔率都較低而不能廣 泛應用。為了解決這一問題，科研工作者進行了大量的研究，但是冷凍_解凍后精子活率仍 不十分理想。盡管甘油可以作為一種較好的冷凍保護劑已經(jīng)可以用于養(yǎng)牛生產(chǎn)，但是以此為基 礎的冷凍稀釋液對精子的保護性能較差，冷凍解凍后精子活率較低，與生產(chǎn)需求還存在較 大差距，需要尋找新的冷凍保護劑；而以甘油為基礎的冷凍保護劑還不能用于養(yǎng)豬生產(chǎn)。隨 著全國性、區(qū)域性種牛、豬聯(lián)合育種工作的深入開展，對精液冷凍保護劑研究越來越顯得迫 切。有關褐藻膠作為冷凍保護劑用于牛、豬等家畜精液冷凍保存的研究國內(nèi)外尚未見 相關報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于針對目前家畜精液冷凍的不足之處，提供一種用于家畜精液冷凍 保存的抗凍劑和抗凍稀釋液及其制備方法，能有效提高牛、豬精液冷凍_解凍后的精子活 率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率和DNA完整性。實現(xiàn)上述目的的技術方案是一種用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，所述抗凍劑為褐藻膠。所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，所述抗凍劑在每IOOml常規(guī)稀釋液中的 添加量為100 IlOmgo
所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，所述抗凍劑在每IOOml常規(guī)稀釋液中的 添加量為60 80mg上述任一所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，所述常規(guī)稀釋液按照如下比例 制作葡萄糖1. lg、檸檬酸1.48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋黃10%、青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉 素0. Ig溶于IOOml蒸餾水。上述任一所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，所述的褐藻膠為海帶中提取的
褐藻膠。一種家畜精液冷凍保存稀釋液，所述家畜精液冷凍保存稀釋液包括抗凍劑，所述 抗凍劑為褐藻膠。制備上述的家畜精液冷凍保存稀釋液的方法，包括下列步驟1)在常規(guī)稀釋液中 加入抗凍劑混勻，所述抗凍劑為褐藻膠；2)在步驟1)所配制的液中添加甘油配制?；蜇i精 液冷凍稀釋液；3)調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 7. 5，過濾滅菌，放入4°C冰箱中備用。所述的方法，步驟1)中在常規(guī)稀釋液中加入100 IlOmg抗凍劑，步驟2)中添加 4%的甘油。所述的方法，步驟1)中在常規(guī)稀釋液中加入60 80mg抗凍劑，步驟2)中添加 的甘油。本發(fā)明首次將從海帶中提取的褐藻膠作為冷凍抗凍劑用于牛、豬精液冷凍保存， 制備方法簡單，取材容易，效果可靠，易于推廣，適用于牛、豬細管冷凍精液人工授精及精液 超低溫冷凍后的長期保存和長途運輸后輸精，可顯著提高冷凍-解凍后精子活率、頂體完 整率和質(zhì)膜完整率，保持精子的受精活力。
具體實施例方式以下結合具體實施例，對本發(fā)明進行詳細說明。實施例1褐藻膠的制備取一定量的新鮮海帶，洗凈表面雜質(zhì)，40°C烘干，粉碎成粉末，加入0. lmol/L HCl 溶液在恒溫水浴鍋中浸提4h，過濾、500rpm離心以去掉雜質(zhì)，然后以1 1的比例加入 Na2CO3溶液處理lh，用60%的乙醇沉淀分離褐藻膠，利用DEAE纖維柱洗脫以除去蛋白，透 析袋脫鹽處理3h，將所得液體凍干可獲取純度為98%的褐藻膠。實施例2準確量取常規(guī)稀釋液組分(葡萄糖1. lg、檸檬酸1. 48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋黃 10% (體積)、青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉素0. Ig)溶于IOOml蒸餾水，添加褐藻膠100 105mg，甘油4%配制成牛用精液冷凍保存稀釋液。調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 7. 5，過濾滅菌， 冷卻至室溫，放入4°C冰箱中備用。實施例3準確量取常規(guī)稀釋液組分(葡萄糖1. lg、檸檬酸1. 48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋黃 10% (體積)、青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉素0. Ig)溶于IOOml蒸餾水，添加褐藻膠106 llOmg，甘油4% (體積)配制成牛用精液冷凍保存稀釋液。調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 7. 5， 過濾滅菌，冷卻至室溫，放入4°C冰箱中備用。實施例4
準確量取常規(guī)稀釋液組分(葡萄糖1. lg、檸檬酸1. 48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋 黃10% (體積)、青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉素0. Ig)溶于IOOml蒸餾水，添加褐藻膠60 70mg，甘油(體積)配制成豬用精液冷凍保存稀釋液。調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 7. 5，過 濾滅菌，冷卻至室溫，放入4°C冰箱中備用。實施例5準確量取常規(guī)稀釋液組分(葡萄糖1. lg、檸檬酸1. 48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋 黃10% (體積)、青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉素0. Ig)溶于IOOml蒸餾水，添加褐藻膠71 80mg,l% (體積)配制成豬用精液冷凍保存稀釋液。調(diào)節(jié)溶液PH值為6. 5 7. 5，過濾滅 菌，冷卻至室溫，放入4°C冰箱中備用。試驗例1
下面對牛精液冷凍保存步驟及精子質(zhì)量評定方法對本發(fā)明進行說明。(一)精液采集用假陰道法采精，用顯微鏡在37°C下進行常規(guī)品質(zhì)檢查。選擇無異味、色澤為乳白 色、精子形態(tài)正常、活率在0. 7以上、密度為“密”的精液用于試驗。( 二)精液處理與冷凍將新鮮精液加入等溫的常規(guī)稀釋液(30°C，1 1稀釋)，經(jīng)紗布包裹后，在15°C恒 溫箱中平衡lh。將平衡處理過的精液加入4°C的冷凍稀釋液，用紗布包裹后置于4°C冰箱中 平衡lh。調(diào)整精子密度為1.0X109個/ml，用專用注射器將精液吸入0.25ml細管內(nèi)(法 國進口)，快速封管，置于程序冷凍儀中以1°C /min的速率從4°C緩慢降至_5°C，迅速移至 液氮上方2-3cm熏蒸5-lOmin，將細管投入液氮中保存。(三)細管凍精的解凍和精子質(zhì)量評定1.精子活率將細管凍精取出后迅速放入37°C的水浴中解凍45s，收集于小試管內(nèi)，然后用常 溫稀釋液稀釋，孵育5min，取10 μ L精液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在400 X倒置顯微鏡下評 價精子活率(直線運動精子百分率)。每次至少檢查200個精子，重復5次。2.精子頂體完整率利用FITC-PNA染液染色后，熒光顯微鏡觀察精子頂體形態(tài)。凍精細管解凍后，將 精液加到2ml 3% PVP液面上，800 X g，3min離心洗2次，棄上清；用PBS (37°C )重懸調(diào)整密 度至1 2X106個精子/ml ；吸取30 μ 1精子懸液，涂片，空氣干燥，用純甲醇固定IOmin ； 再加入30 μ 1 FITC-PNA染液，37°C黑暗潮濕環(huán)境孵育30min ；PBS沖洗，空氣干燥，滴少量甘 油PBS(9 1)，蓋片，用無色指甲油封片，盡快在400X熒光顯微鏡下觀察。每次至少檢 查200個精子，重復5次。3.精子質(zhì)膜完整率采用果糖_檸檬酸鈉低滲液進行低滲腫脹檢測(HOST)。將解凍的精液用常規(guī)稀 釋液稀釋，調(diào)整精子密度為1 X 106個/ml，37°C孵育30min，取20 μ 1精液于懸液滴于血細 胞計數(shù)板上，400 X顯微鏡下觀察，計算彎尾精子百分率，每次至少檢查200個精子，重復5次。(四)精子質(zhì)量評定結果應用本發(fā)明的牛精液冷凍保存抗凍劑以及精液冷凍-解凍方法，評定結果如下
當褐藻膠添加量為100 105mg，冷凍-解凍后精子活率達71 %，頂體完整率達 68 %，質(zhì)膜完整率達78 % ；當褐藻膠添加量為106 110mg，冷凍-解凍后精子活率達75 %， 頂體完整率達69 %，質(zhì)膜完整率達72 %。試驗例結果如下表所示
權利要求
一種用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述抗凍劑為褐藻膠。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述抗凍劑 在每IOOml常規(guī)稀釋液中的添加量為100 llOmg。
3.根據(jù)權利要求1所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述抗凍劑 在每IOOml常規(guī)稀釋液中的添加量為60 80mg。
4.根據(jù)權利要求1至3任一所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述 常規(guī)稀釋液按照如下比例制作葡萄糖1. lg、檸檬酸1. 48g、Tris 2. 42g、新鮮雞蛋黃10%、 青霉素鈉0. 06g、硫酸鏈霉素0. Ig溶于IOOml蒸餾水。
5.根據(jù)權利要求1至3任一所述的用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑，其特征在于，所述 的褐藻膠為海帶中提取的褐藻膠。
6.一種家畜精液冷凍保存稀釋液，其特征在于，所述家畜精液冷凍保存稀釋液包括抗 凍劑，所述抗凍劑為褐藻膠。
7.權利要求6所述的家畜精液冷凍保存稀釋液的制備方法，其特征在于，包括下列步 驟1)在常規(guī)稀釋液中加入抗凍劑混勻，所述抗凍劑為褐藻膠；2)在步驟1)所配制的液中 添加甘油配制牛或豬精液冷凍稀釋液；3)調(diào)節(jié)溶液pH值為6. 5 7. 5，過濾滅菌，放入4°C 冰箱中備用。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)中在常規(guī)稀釋液中加入100 IlOmg抗凍劑，步驟2)中添加4%的甘油。
9.根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，步驟1)中在常規(guī)稀釋液中加入60 SOmg 抗凍劑，步驟2)中添加的甘油。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于家畜精液冷凍保存的抗凍劑和抗凍稀釋液及其制備方法，本發(fā)明提供的用于牛、豬精液冷凍保存的抗凍劑，為褐藻膠，具體包括如下體積份數(shù)的組分在常規(guī)稀釋液(葡萄糖1.1g、檸檬酸1.48g、Tris 2.42g、新鮮雞蛋黃10％、青霉素鈉0.06g、硫酸鏈霉素0.1g溶于100ml蒸餾水)中添加量為60～110mg。100～110mg(牛用)、60～80mg(豬用)。其制備方法是在常規(guī)稀釋液中添加100～110mg褐藻膠與4％甘油(牛用)、60～80mg褐藻膠與1％甘油(豬用)配制成冷凍稀釋液；調(diào)節(jié)溶液pH值至6.5～7.5，滲透壓286mOsm.L-1，過濾滅菌后放入4℃冰箱中備用。本發(fā)明首次將褐藻膠用于牛、豬精液的冷凍保存中，解凍后精子活率、頂體完整率、質(zhì)膜完整率分別為65％、69％、72％(牛)，58％、62％、63％(豬)。
文檔編號A01N1/02GK101965830SQ201010508619
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月18日 優(yōu)先權日2010年10月18日
發(fā)明者李青旺, 江中良, 潘巧蓮, 胡建宏 申請人:西北農(nóng)林科技大學