專利名稱：一種巖生報春組織培養(yǎng)與快速繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體地說，涉及一種巖生報春(Primula saxatilis)的組織培養(yǎng)和快速繁殖的方法。
背景技術(shù)：
巖生報春為報春花科報春屬指葉報春組植物，被列入《中國植物紅皮書(第二 版)》以及《河北省重點保護野生植物名錄》。早春開花，花粉紅色具有較好的觀賞性，在北 京露地能順利越夏越冬，是十分重要的觀賞花卉和育種材料。巖生報春是多年生草本花卉， 一般采用播種和分株繁殖，但以播種繁殖為主，一般于9月初播種，經(jīng)過營養(yǎng)生長于次年5 月份進入盛花期，從播種至開花時間為8個月，生長周期長，且繁殖系數(shù)低。同時，這些方法 遠不能滿足生產(chǎn)需求，且成苗不整齊。組織培養(yǎng)是快速繁殖優(yōu)良植物品種的一條重要途徑，報春花屬已有不少種進行了 組織培養(yǎng)的相關(guān)報道，但是巖生報春的組織培養(yǎng)在國內(nèi)外均沒有相關(guān)研究與報道，因此需 要研究巖生報春的組織培養(yǎng)，并形成一套專門的快繁技術(shù)體系。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種巖生報春的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，提高巖生報春的 繁殖系數(shù)、生根率及移栽成活率。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種巖生報春組織培養(yǎng)和快速繁殖方法，包括種 子表面消毒后進行接種，獲得無菌苗后，接種腋芽進行叢生芽的誘導(dǎo)，將獲得的不定芽進行 生根培養(yǎng)和移栽。其中，所述的種子消毒包括用清水浸泡種子24h，在超凈工作臺內(nèi)先用75%乙醇 消毒15 30s，優(yōu)選為15s，無菌水沖洗5 6次，優(yōu)選5次，再用質(zhì)量比為0. 的升汞溶 液消毒6 8min，優(yōu)選為6min，無菌水洗滌5 6次，優(yōu)選為5次，接種至MS或者1/2MS培 養(yǎng)基中，優(yōu)選為1/2MS培養(yǎng)基，pH為5. 9，光照條件為自然散射光2500 3000LuX加人工輔 助光1500 2000LUX。1 1. 5個月后，將種子萌發(fā)獲得的無菌苗移至MS培養(yǎng)基中繼代， PH為5. 9，光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000Lux。其中，所述的叢生芽誘導(dǎo)具體步驟為取無菌苗腋芽接種在叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 MS+2. 5mg/l 6-BA+l. Omg/1 NAA 中，pH 為 5. 9，光照條件為自然散射光 2500 3000Lux 加 人工輔助光1500 2000LUX ；之后移至相同培養(yǎng)基增殖，繼代2 3次。其中，生根培養(yǎng)和試管苗移栽的具體步驟為將不定芽接種至生根培養(yǎng)基進行生 根。生根培養(yǎng)基為 MS 或 MS+0. 1 0. 2mg/l NAA，優(yōu)選為 MS+0. lmg/1 NAA，pH 為 5. 9 6. 0， 光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光2500 3000Lux，光照時間為12h/ d ；溫度保持在23 25°C之間。生根培養(yǎng)2 3周，煉苗4 5天后，移至細草炭土中培養(yǎng)， 保持濕度高于80%，每天噴水2 3次。本發(fā)明提供的巖生報春組織培養(yǎng)和快速繁殖方法，還包括在所述叢生芽的誘導(dǎo)后將叢生芽的葉片或葉柄接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織，并將愈傷組織接種 至愈傷組織增殖培養(yǎng)基中進行增殖培養(yǎng)，將增殖后的愈傷組織接種到愈傷組織分化培養(yǎng)基 中培養(yǎng)，分化出不定芽。其中所述的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1 2. 5mg/l 6-BA+0. 5 1. 5mg/l NAA,優(yōu)選 為MS+1. 5mg/l 6-BA+O. 5mg/l NAA中，pH為5. 8 5. 9，培養(yǎng)的光照條件為先暗培養(yǎng)20d， 之后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000Lux，光照時間 為 12h/d。其中所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基為MS+0. 5mg/l TDZ+0. 5 1. 5mg/l 2，4_D中，優(yōu) 選為MS+0. 5mg/l TDZ+0. 5mg/l 2，4_D，pH為5. 8 5. 9。其中所述的愈傷組織優(yōu)選為誘導(dǎo) 的初始黃綠色的愈傷組織。其中，所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基MS+10mg/l 6_BA+2mg/lNAA上。所述的用于不 定芽的愈傷組織優(yōu)選為黃綠色塊狀、質(zhì)地疏密適中的愈傷組織。本發(fā)明的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法繁育巖生報春，2個月內(nèi)增殖系數(shù)達到3 4， 生根率達95%以上，移栽成活率為100%，極大地提高了巖生報春的繁殖系數(shù)，縮短成苗周 期，又可降低成本，為今后大面積園林應(yīng)用和工廠化育苗提供了非常有效的方法；同時，以 腋芽為材料進行增殖和快繁，能夠保持巖生報春的種性不變，為新品種培育中出現(xiàn)的較為 珍貴稀有變種的保存提供了保障。對巖生報春無菌苗葉片和葉柄進行培養(yǎng)及再生，使外植 體能夠高頻率地誘導(dǎo)出愈傷組織，建立高效的體細胞再生體系，為巖生報春遺傳轉(zhuǎn)化和細 胞工程研究創(chuàng)造有利條件，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)育種奠定了良好的基礎(chǔ)。為今后大面積園林 應(yīng)用和工廠化育苗提供了非常有效的方法；同時，為新品種培育中出現(xiàn)的較為珍貴稀有變 種的保存提供了保障。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明巖生報春的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法的優(yōu)點在于1.建立了一種巖生報春的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，相比傳統(tǒng)的報春花屬植物育 苗繁殖方法，如播種繁殖和分株繁殖，極大地提高了巖生報春的繁殖系數(shù)，為科研研究和生 產(chǎn)栽培提供了技術(shù)支持；2.通過組織培養(yǎng)與快速繁殖得到的幼苗，生長強健，葉色濃綠，一致性強，成苗容 易，適應(yīng)性較強，病蟲害少，易于管理；3.利用組織培養(yǎng)與快速繁殖方法繁育巖生報春，擺脫了季節(jié)與氣候的限制因素， 從而縮短了育苗周期，增加了繁殖量；4.利用組織培養(yǎng)與快速繁殖方法繁育巖生報春，可以保持優(yōu)良種或品種的特性不 變，從而為新品種選育研究中變異保存提供了有效的方法；5.通過組培再生體系的方法建立高效的體細胞再生體系，為巖生報春遺傳轉(zhuǎn)化和 細胞工程研究創(chuàng)造有利條件；6.利用組培再生體系繁育巖生報春，為通過遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)培育新品種奠定了基 石出。


圖1所示為接種種子2個月后長成的無菌苗。圖2所示為腋芽接種2周后開始有叢生芽的分化。
圖3所示為在腋芽接種40天后分化出的大量叢生芽。圖4所示為葉片接種40d左右開始有形成愈傷組織。圖5所示為將形成的小愈傷組織進行切除，放入增殖培養(yǎng)基中進行增殖。圖6所示為將已增殖的愈傷組織進行分化培養(yǎng)。圖7所示為愈傷組織在分化培養(yǎng)基中分化出的再生植株。圖8所示為不定芽在生根培養(yǎng)基中的生根情況。圖9所示為再生植株在溫室中培養(yǎng)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1選取巖生報春種子，在無菌條件下先用75%酒精消毒15s，無菌水沖洗5 6次， 再用質(zhì)量比0. 1 %的升汞溶液消毒6min，無菌水沖洗5 6次，接種至1/2MS中，pH為5. 9， 一個月后移至MS，pH為5. 9中繼代，在MS中生長一個月(圖1)后形成巖生報春無菌壯苗，， 光照條件均為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000Lux。實施例2選取巖生報春種子，在無菌條件下先用75 %酒精消毒30s，無菌水沖洗6次，再用 質(zhì)量比為0. 1 %的升汞溶液消毒8min，無菌水沖洗6次，接種至MS中，pH為5. 9，一個月后 移至MS中繼代，在MS中生長一個月后形成巖生報春無菌壯苗，光照條件均為自然散射光 2500 3000Lux加人工輔助光1500 2000Lux。實施例3以巖生報春無菌苗的腋芽為外植體進行初培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)選取生長健壯的無 菌苗植株上的腋芽，無菌條件下接種在MS+6-BA 2. 5mg/l+NAA 1. Omg/1叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基 上，每瓶接種3個；光照條件為自然散射光3000LUX加上人工輔助光源1800士200LUX，光照 時間14h。當腋芽接種在分化培養(yǎng)基上，不斷抽出新葉，10天開始，抽出新葉的葉柄粗壯，基 部變紅，2周后(圖2)開始有叢生芽的分化；接種40天(圖3)后，在腋芽新抽出的葉柄上， 分化出大量的叢生芽。統(tǒng)計結(jié)果顯示在MS+6-BA 2. 5mg/l+NAA 1. Omg/1的培養(yǎng)基上接種2個月后，平均 每個腋芽能分化出叢生芽的數(shù)目是40 50個。同時，溫度對于叢生芽的誘導(dǎo)和組培苗的 生長起到非常關(guān)鍵的作用，在20 23°C之間，組培苗葉色濃綠，生長健壯；超過25°C，組培 苗變黃并逐漸死亡。在這樣的培養(yǎng)條件下，試管苗2個月的增值系數(shù)達到3 4，極大地提 高了巖生報春的繁殖系數(shù)。實施例4以巖生報春腋芽誘導(dǎo)的無菌苗的葉片為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長健 壯的無菌苗植株上的葉片，無菌條件下將葉片(帶葉脈)切成1.5cmX 1.5cm大小，葉片正 面貼近培養(yǎng)基，接種在MS+1. Omg/1 6-BA+O. 5mg/l NAA愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，pH為5. 8 5. 9，每瓶接種5個葉片；先暗培養(yǎng)20d，培養(yǎng)溫度為20 23°C，之后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，自然散 射光3000Lux加上人工輔助光源1800士200Lux，光照時間12h/d，培養(yǎng)溫度為20 23°C。
當葉片接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上20d左右，葉片邊緣卷曲，部分葉柄基部膨大，40d左 右(圖4)葉片卷曲部分形成愈傷。統(tǒng)計結(jié)果顯示在MS+1. Omg/1 6-BA+O. 5mg/l NAA的培養(yǎng)基上接種葉片的愈傷組織 誘導(dǎo)率為21.92%.實施例5以巖生報春腋芽誘導(dǎo)的無菌苗的葉柄為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)選取生長健 壯的無菌苗植株上的葉柄，切成Icm長，接種在MS+1. 5mg/l 6-BA+O. 5mg/l NAA愈傷組織誘 導(dǎo)培養(yǎng)基上，PH為5. 8 5. 9，每瓶接種5個葉柄；先暗培養(yǎng)20d，培養(yǎng)溫度為20 23°C，之 后轉(zhuǎn)為光照培養(yǎng)，自然散射光3000LUX加上人工輔助光源1800士200LUX，光照時間12h/d， 培養(yǎng)溫度為20 23°C。當葉柄接種在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上20d左右，葉柄基部開始形成愈傷。統(tǒng)計結(jié)果顯示在MS+1. 5mg/l 6-BA+O. 5mg/l NAA的培養(yǎng)基上接種葉柄的愈傷組織 誘導(dǎo)率為28. 27%。實施例6對誘導(dǎo)的初始黃綠色愈傷組織進行增殖培養(yǎng)將實施例4誘導(dǎo)的黃綠色小愈傷組 織(圖5)進行切除，接種到MS+0.5mg/l TDZ+0. 5mg/l 2，4-D的培養(yǎng)基上進行增殖。光照 條件為自然散射光3000LUX加上人工輔助光源1800士200LUX，光照時間12h/d，培養(yǎng)溫度為 20 23 。實施例7對誘導(dǎo)的初始黃綠色愈傷組織進行增殖培養(yǎng)將實施例5誘導(dǎo)的黃綠色小愈傷組 織進行切除，接種到MS+0.5mg/l TDZ+1.5mg/12，4-D的培養(yǎng)基上進行增殖。光照條件為自然 散射光3000LUX加上人工輔助光源1800 士 200Lux，光照時間12h/d，培養(yǎng)溫度為20 23°C。實施例8將經(jīng)過增殖之后得到的塊狀、質(zhì)地疏密適中的愈傷組織(圖6)進行分化培養(yǎng)將 愈傷組織接種到MS+10mg/16-BA+2mg/l NAA分化培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，光照條件為自然散射 光3000Lux加上人工輔助光源1800士200Lux，光照時間12h/d，培養(yǎng)溫度為20 23°C。實施例9巖生報春組培苗的生根培養(yǎng)當叢生芽和再生植株在分化培養(yǎng)基上長出2 3片 葉子(圖7)時，將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基，配方:MS、MS+NAA(0. lmg/l、0. 2mg/l、0. 5mg/l)中， pH為5. 9 6. 0 ；光照條件為自然散射光3000LUX加上人工輔助光源2500Lux，光照時間 14h。結(jié)果表明，MS、MS+NAA 0. lmg/1、MS+NAA 0. 2mg/l的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出不定根。從 生根所需要的時間來看，在培養(yǎng)基MS和MS+0. lmg/1 NAA中生根所需時間最短，為8 10 天，但在MS+0. lmg/1 NAA中，組培苗生根量和長勢明顯好于MS基本培養(yǎng)基，組培苗平均高 度可達4. 8cm,生根率為95%以上(圖8)。實施例10巖生報春組培苗的移栽生根培養(yǎng)兩周以后，待組培苗平均每株生根4 5條，根 長達到Icm時，即可開始為移栽作準備。煉苗是試管苗移栽前的過渡，可以幫助試管苗逐 步適應(yīng)外界環(huán)境，使試管苗更健壯，葉色更加深綠，從而提高成活率。巖生報春試管苗煉苗 3 4天后，移栽至溫室細草炭土中，草炭土提前鋪滿穴盤，清水浸透；試管苗移栽后保持濕
6度80%以上，覆薄膜并每天噴水2 3次，2周以后即可逐步進行正常管理，移栽成活率幾 乎為100% (圖9)。 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾 也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。
權(quán)利要求
一種巖生報春的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，包括如下步驟將種子表面消毒后進行接種，獲得無菌苗后，接種腋芽進行叢生芽的誘導(dǎo)，將獲得的不定芽進行生根培養(yǎng)和移栽，其中，所述的種子接種至1/2MS或MS培養(yǎng)基；所述的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.5mg/l6 BA+1.0mg/l NAA，pH為5.9～6.0；所述的不定芽生根培養(yǎng)基為MS或MS+0.1～0.2mg/l NAA，pH 5.9～6.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，還包括在所述叢生 芽誘導(dǎo)后，將叢生芽的葉片或葉柄接種至愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)愈傷組織，并將愈傷 組織接種至愈傷組織增殖培養(yǎng)基上進行增殖培養(yǎng)，將增殖后的愈傷組織接種到愈傷組織分 化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，分化出不定芽，其中，所述的無菌苗葉片和葉柄的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基 為MS+1 2. 5mg/l 6-BA+0. 5 1. 5mg/l NAA, ρΗ5· 8 5. 9 ；所述的愈傷組織增殖培養(yǎng)基 為MS+0. 5mg/l TDZ+0. 5 1. 5mg/l 2，4_D，ρΗ5· 8 5. 9 ；所述的愈傷組織分化培養(yǎng)基為 MS+10mg/16-BA+2mg/l NAA,pH 5.8 5. 9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的種子表面消 毒包括用清水浸泡種子24h，在超凈工作臺內(nèi)先用75%乙醇消毒15 30s，無菌水沖洗 5 6次，再用質(zhì)量比為0. 的升汞溶液消毒6 8min，無菌水洗滌5 6次。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的所述的種子 表面消毒包括用清水浸泡種子24h，在超凈工作臺內(nèi)先用75%乙醇消毒15s，無菌水沖洗5 次，再用質(zhì)量比為0. 的升汞溶液消毒6min，無菌水洗滌5次。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的種子接 種培養(yǎng)、叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)時，光照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000LUX，光照時間為12h/d;所述的愈傷組織誘導(dǎo)時，先暗培養(yǎng)20d，之后光照培養(yǎng)，其中光 照培養(yǎng)的光照條件為，自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光1500 2000Lux，光照時 間為12h/d。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述生根培養(yǎng)時，光 照條件為自然散射光2500 3000LUX加人工輔助光2500 3000Lux。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的用于增殖培 養(yǎng)的愈傷組織為誘導(dǎo)的初始黃綠色的愈傷組織。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的用于不定芽 分化的愈傷組織為塊狀質(zhì)地疏密適中的愈傷組織。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)與快速繁殖方法，其特征在于，所述的移栽是在生 根培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 3周后，煉苗4 5天移栽至溫室細草炭土中培養(yǎng)，移栽溫度為18 25 "C。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種巖生報春(Primula saxatilis)組織培養(yǎng)與快速繁殖方法。本發(fā)明選取北京密云霧靈山采集的巖生報春野生種子為外植體，其中種子經(jīng)過消毒后進行接種培養(yǎng)，萌發(fā)形成巖生報春無菌苗。將無菌苗上的腋芽進行增殖，經(jīng)過叢生芽誘導(dǎo)、繼代培養(yǎng)進行快速繁殖；或誘導(dǎo)叢生芽的葉片或葉柄產(chǎn)生愈傷組織、進行愈傷組織的增殖和不定芽分化進行快速繁殖。本發(fā)明提供的巖生報春組織培養(yǎng)和快速繁殖方法，大大提高了巖生報春的育苗生產(chǎn)能力，縮短了成苗時間又降低了成本，為巖生報春優(yōu)良單株的保存提供了技術(shù)保障。
文檔編號A01H4/00GK101965796SQ201010506859
公開日2011年2月9日 申請日期2010年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月14日
發(fā)明者張啟翔, 潘會堂, 王佳, 程堂仁, 董玲玲, 趙妍 申請人:北京林業(yè)大學