專利名稱：一種抗菌多肽及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，涉及一種抗菌多肽以及該抗菌多肽的制備方法和用途。
背景技術(shù)：
抗生素對(duì)于控制、預(yù)防和治療各種感染性疾病發(fā)揮了重要作用。由于抗生素的使用，到20世紀(jì)80年代，人類幾乎可以征服所有的感染類疾病，然而，隨著時(shí)間的推移以及抗生素的濫用，耐藥菌株愈來(lái)愈多。有監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn)，最具代表性的耐藥菌株當(dāng)中，耐藥的葡萄球菌已上升到40% ；耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌則超過(guò)77%。現(xiàn)在，已經(jīng)出現(xiàn)了能對(duì)抗所有抗生素的耐藥菌，很明顯，抗生素耐藥問(wèn)題已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類的健康。解除耐藥菌對(duì)人類日益嚴(yán)重的威脅已經(jīng)是一個(gè)相當(dāng)迫切的問(wèn)題，因此新一類抗微生物物質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和研制已經(jīng)成為國(guó)際上研究的熱點(diǎn)。多肽類抗菌物質(zhì)與目前廣泛使用的傳統(tǒng)類抗生素相比，具有很多優(yōu)點(diǎn)如在最小作用濃度時(shí)，快速而廣譜的殺滅微生物(包括目前臨床抗藥菌)，對(duì)真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，對(duì)局部感染和全身感染都有效。 目前，已從不同生物中提取出多種抗菌肽。人防御素屬于抗菌肽家族，是存在于人多形核中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、小腸Paneth 細(xì)胞中的一組同源肽類，是富含精氨酸殘基的陽(yáng)離子多肽，分子量為4 6kDa，分子中含有 6-8個(gè)Cys殘基，并形成3 4對(duì)分子內(nèi)二硫鍵，具有穩(wěn)定的分子結(jié)構(gòu)和廣譜抗菌活性。在體內(nèi)外對(duì)多種細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞、癌實(shí)體瘤、真菌和原蟲(chóng)均有抑殺作用，且微生物不易對(duì)其產(chǎn)生抗性。因此人防御素有望成為理想的抗生素替代品，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值。但由于抗菌肽在生物體中含量不高，且提取困難，成本高，故尋找來(lái)源易，成本低、效價(jià)高的抗菌肽正受到廣泛的重視。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種抗菌多肽；本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供編碼該抗菌多肽的基因；本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供該抗菌多肽的制備方法；本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供該抗菌多肽的用途。本發(fā)明在對(duì)人防御素4的序列、結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)行改進(jìn)優(yōu)化，與人防御素4 相比，除了具有抗菌作用外，還有抗病毒作用，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開(kāi)的氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列，例如，將第6 位的Leu替換為lie，或者在其末端缺失Thr Arg Val三個(gè)氨基酸。因此，本發(fā)明抗菌多肽還包括SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等功能的由SEQ ID No. 2衍生得到的多肽。為方便表述，將該多肽命名為ABP-jl。本發(fā)明基因包括編碼所述多肽的核酸序列，優(yōu)選其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。此外，應(yīng)理解，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性以及不同物種密碼子的偏愛(ài)性，本領(lǐng)域技術(shù)
3人員可以根據(jù)需要使用適合特定物種表達(dá)的密碼子?？蓪⒈景l(fā)明基因與表達(dá)載體可操作地連接，得到能夠表達(dá)本發(fā)明多肽的重組表達(dá)載體，進(jìn)而可以通過(guò)諸如電轉(zhuǎn)化法等轉(zhuǎn)基因方法，將所述表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，得到轉(zhuǎn) ABP-jl基因的轉(zhuǎn)化體，例如基因工程菌。因此，本發(fā)明還包括含有編碼上述抗菌多肽的表達(dá)載體，以及轉(zhuǎn)化了該表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。本發(fā)明還提供了一種制備上述多肽的方法，其是將上述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽(yáng)性克隆，誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求1所述抗菌多肽，并分離純化。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，將編碼上述多肽的基因(其核苷酸序列如SEQ ID No. 1 所示)克隆至表達(dá)載體PPIC9K，得到重組表達(dá)載體pPIC9K-ABP-j 1，進(jìn)而通過(guò)電擊法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母(Pichia past0ris)GS115中；通過(guò)同源重組整合到酵母染色體上；用G418篩選高表達(dá)菌株；甲醇誘導(dǎo)表達(dá)。具體地，本發(fā)明制備上述多肽的方法包括如下步驟1、該抗菌多肽的重組畢赤酵母表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)ABP-jl核酸序列和畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)特性，在ABP-j 1核酸序列上下游分別增加EcoRI 和NotI位點(diǎn)，用EcoRI和NotI雙酶切，再與EcoRI和NotI雙酶切過(guò)的pPIC9K相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，構(gòu)建該抗菌多肽的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-ABP_jl。提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI 和NotI雙酶切、測(cè)序鑒定。證實(shí)該抗菌多肽畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-ABP-jl構(gòu)建成功。2、畢赤酵母的轉(zhuǎn)化及篩選用限制性內(nèi)切酶如&iCI、BglII將重組質(zhì)粒線性化，取約5 μ 1線性DNA 1 μ g與200 μ 1甲醇酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞混合，然后注入預(yù)冷的0. 2cm 電擊杯中，輕敲電擊杯，使混合物落于電擊杯底部，在電擊儀上設(shè)定電壓為1500V，電容為 50 μ F，電流25mA，電功率25W，電阻200 Ω，進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔后立即加入Iml預(yù)冷的 IM D-山梨醇，混勻后從中吸出200 μ 1立即涂布于含2. Omg/ml G418的MD D-山梨醇平板 (1. 34% YNB，4X 10_5%生物素，2% D-葡萄糖，IM D-山梨醇)，然后倒置平板于28 30°C 培養(yǎng)，2 4天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，篩選出高表達(dá)菌株。隨機(jī)挑取生長(zhǎng)出的酵母菌落于YPD培養(yǎng)，按照Promega公司酵母基因組提取試劑盒所述方法提取酵母基因組，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增ABP-jl基因，瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下可見(jiàn)約IlObp大小的明顯條帶，與ABP-jl核酸序列大小一致，說(shuō)明酵母高效表達(dá)菌株建立成功。3、誘導(dǎo)表達(dá)挑取陽(yáng)性克隆，分別接種于50mlBMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至0D600在4 6之間時(shí)取出，1500g離心5min，收集酵母細(xì)胞，然后重懸于裝有1/5體積的BMMY培養(yǎng)基三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，M小時(shí)以后，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5 1%。持續(xù)培養(yǎng)6 10天，離心取上清。直接取ABP-jl酵母表達(dá)上清作SDS-PAGE，電泳顯示有目的蛋白表達(dá)，經(jīng)測(cè)定蛋白量可達(dá)到500mg/L左右。Western-blotting檢測(cè)可見(jiàn)ABP-jl表達(dá)條帶。用標(biāo)準(zhǔn)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌菌株混菌板鑒定活性，并通過(guò)測(cè)定表明本發(fā)明抗菌多肽對(duì)病毒、常見(jiàn)細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制作用，動(dòng)物急毒性試驗(yàn)、全身過(guò)敏試驗(yàn)和長(zhǎng)期毒性試驗(yàn)表明該抗菌多肽是安全的，可依此方法研制新型高效抗生素替代品。本發(fā)明抗菌多肽可以用于制備抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑。進(jìn)而本發(fā)明還提供一種含有有效劑量的所述抗菌多肽的抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑。本發(fā)明方法可以大量、高效的制備該抗菌多肽，由此方法制得的抗生素替代品具有廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤活性的生物學(xué)特性，且不易產(chǎn)生耐藥性。


圖1 重組表達(dá)載體pPC9K-ABP_j 1的構(gòu)建流程圖。圖2 =ABP-Jl抗菌肽SDS-PAGE電泳圖，其中，1 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)；2 誘導(dǎo)后上清；3 誘導(dǎo)前上清。圖3 :ABP_jl抗菌肽Wfestern blotting檢測(cè)圖，其中1 目的蛋白條帶；M 蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。實(shí)施例1抗菌多肽的制備大腸桿菌DH5a購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，甲醇酵母(Pichia pastoris) GS115，表達(dá)載體pPIC9K購(gòu)自Invitrogen公司。將65115單菌落接種于51111￥ 0(1(%酵母浸膏，2(%胰蛋白胨，2(%0-葡萄糖)液體培養(yǎng)基中，觀 30°C過(guò)夜培養(yǎng)，取100 μ 1轉(zhuǎn)接到50ml YPD培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)其0D600 在1. 1 1. 3之間時(shí)停止培養(yǎng)，離心5000rpm 5min，收集菌體，然后分別用冰冷的去離子水和D-山梨醇洗滌2次，最后加入Iml預(yù)冷的IM D-山梨醇，按每管200 μ 1分裝成備用的甲醇酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，立即使用或保存于-70°C。根據(jù)ABP-jl核酸序列(SEQ ID No. 1)和畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K上的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)特性，通過(guò)人工合成，在ABP-jl核酸序列上下游分別增加EcoRI和NotI位點(diǎn)，用 EcoRI和NotI雙酶切，再與EcoRI和NotI雙酶切過(guò)的pPIC9K相連(見(jiàn)附圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，構(gòu)建該抗菌多肽的畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-ABP-jl。提取質(zhì)粒，經(jīng)EcoRI和 NotI雙酶切、測(cè)序鑒定。證實(shí)該抗菌多肽畢赤酵母重組表達(dá)載體pPIC9K-ABP-jl構(gòu)建成功。分別用限制性內(nèi)切酶BGIII、SacI等將重組質(zhì)粒線性化，取線性DNAl μ g(大約 5 μ 1)(無(wú)菌)與200 μ 1酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞混合，然后注入預(yù)冷的0. 2cm電擊杯中， 輕敲電擊杯，使混合物落于電擊杯底部，在電擊儀上設(shè)定電壓為1500V，電容為50 μ F，電流 25mA,電功率25W，電阻200 Ω，進(jìn)行電穿孔操作。電穿孔后立即加入Iml預(yù)冷的IM D-山梨醇，混勻后從中吸出200 μ 1立即涂布于含2. 0mg/mlG418的MD D-山梨醇平板(1. 34% YNB, 4X 生物素，2% D-葡萄糖，IM D-山梨醇)，然后倒置平板于觀 30°C培養(yǎng)，2 4天后出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，篩選出高表達(dá)菌株。隨機(jī)挑取生長(zhǎng)出的酵母菌落YPD培養(yǎng)，按照Promega公司酵母基因組提取試劑盒所述方法提取酵母基因組，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增ABP-jl基因，上游引物5’-gtc tgc tct tgc aga tta gta_3，；下游引物5，-gac acg cgt gca gca gta tgt_3，，紫外燈下觀察，鑒定轉(zhuǎn)化結(jié)果，顯示有目的條帶存在。挑取不同陽(yáng)性克隆，分別接種于50ml BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)至 0D600在4 6之間時(shí)取出，1500g離心5min，收集酵母細(xì)胞，然后重懸于裝有1/5體積的 BMMY培養(yǎng)基三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，24小時(shí)以后，每天補(bǔ)加甲醇至終濃度為0. 5 1 %。持續(xù)培養(yǎng)6 10天，離心取上清。直接取ABP-jl酵母表達(dá)上清作SDS-PAGE (見(jiàn)附圖2)，電泳顯示有目的蛋白表達(dá)， 經(jīng)測(cè)定蛋白量可達(dá)到500mg/L左右。Western-blotting檢測(cè)可見(jiàn)ABP-jl表達(dá)條帶(見(jiàn)附圖3)。序列測(cè)定表明，該多肽序列與預(yù)測(cè)相一致。實(shí)施例2抗菌多肽的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)取酵母表達(dá)上清各Iml分別置于40、60、80和100°C水浴條件下分別處理10、20、 30min，用未處理的酵母表達(dá)上清作為對(duì)照，以標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌為指示菌，用抑菌圈直徑法測(cè)定處理前后樣品的抑菌效果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取其平均值為測(cè)定結(jié)果。表1加熱處理后酵母表達(dá)上清對(duì)標(biāo)準(zhǔn)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑
權(quán)利要求
1.一種抗菌多肽，其是1)SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列組成的多肽；或，2) SEQ ID No. 2所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸獲得的具有同等功能的由 1)衍生的多肽。
2.編碼權(quán)利要求1所述抗菌多肽的基因。
3.如權(quán)利要求1所述的基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQID No. 1所示。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的表達(dá)載體。
5.由權(quán)利要求4所述表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其為畢赤酵母。
7.一種制備權(quán)利要求1所述抗菌多肽的方法，其包括如下步驟將權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選陽(yáng)性克隆，誘導(dǎo)表達(dá)權(quán)利要求1所述抗菌多肽，并分離純化。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述宿主菌為畢赤酵母GS115。
9.權(quán)利要求1所述抗菌多肽在制備抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑中的應(yīng)用。
10.含有權(quán)利要求1所屬1所屬抗菌多肽的抗菌藥物、抗病毒藥物、飼料添加劑、防腐劑或消殺劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種抗菌多肽及其制備方法和應(yīng)用，屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明抗菌多肽的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。通過(guò)將抗菌多肽的編碼序列經(jīng)限制性內(nèi)切酶線性化后采用電擊法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母(Pichia pastoris)GS115中，通過(guò)同源重組到酵母染色體上，用G418篩選高表達(dá)菌株，甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，可獲得該抗菌多肽。試驗(yàn)證明該抗菌多肽在體內(nèi)外對(duì)多種細(xì)菌、病毒、腫瘤細(xì)胞、癌實(shí)體瘤、真菌和原蟲(chóng)均有抑殺作用，且不易產(chǎn)生抗性，可作為理想的抗生素替代品和人畜生物性藥物、飼料添加劑、防腐劑、消殺劑等。
文檔編號(hào)A23K1/17GK102295694SQ20101021970
公開(kāi)日2011年12月28日 申請(qǐng)日期2010年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月28日
發(fā)明者于保鋒, 余占橋, 向前, 張日俊, 李翔, 王俊麗, 胡曉年, 解軍, 趙龍妹, 馬青山 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)