專(zhuān)利名稱(chēng)：三七不定根的培養(yǎng)方法
發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種三七不定根的培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
三七是我國(guó)特有的中藥材之一，名列我國(guó)“參、茸、桂、七”傳統(tǒng)四大名貴中藥之列。 三七具有散瘀止血、消腫定痛等功效，既可作為滋補(bǔ)品直接食用，又是許多保健品和藥品的重要 原料，如血塞痛、云南白藥、復(fù)方丹參滴丸和復(fù)方三七通絡(luò)片等。三七藥材中含有約15%總皂苷，約3%黃酮，2%多糖，7%氨基酸及其他成分，包括多個(gè)單體成分，且各單體成分的藥理和藥效作用并不盡然相同。三七總皂苷分為人參二醇皂苷和人參三醇皂苷兩大組分，還有一些獨(dú)立于醇類(lèi)皂苷之外的單體皂苷。其中，人參二醇皂苷中的Rgl具有鎮(zhèn)靜神經(jīng)的作用，其功能與人參中的主要皂苷成分相同，此外還有一些單體皂苷起消炎、定痛作用。人參三醇皂苷中，Rbl起活血化瘀作用，而其中某些單體皂苷則起去腐生新作用。三七氨基酸中含有至少9個(gè)以上單體氨基酸，其中占三七塊根總量?jī)H 2% -3%的單體物質(zhì)L-二氨基丙酸，是三七止血作用的全部活性成分。其他單體氨基酸，如胱氨酸、谷氨酸等，則起其他補(bǔ)益作用，三七黃酮和多糖及其衍生物，有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力、 抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。以三七總皂苷為處方原料的系列產(chǎn)品，已在臨床廣泛應(yīng)用，年總產(chǎn)值將近30億元。三七具有不可替代的藥用功能和價(jià)值，在醫(yī)藥行業(yè)中占有重要地位。但三七的生長(zhǎng)受地理?xiàng)l件的限制以及載培土地不能重復(fù)利用的影響，栽培面積十分有限，導(dǎo)致藥材供應(yīng)不穩(wěn)定。三七的適種區(qū)域狹小，長(zhǎng)不到300公里，寬不足50公里，資源不可擴(kuò)張。藥用植物資源是中藥產(chǎn)業(yè)得以存在、發(fā)展的根本，只有合理科學(xué)地保護(hù)性開(kāi)發(fā)利用，才能保證中藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。產(chǎn)業(yè)化規(guī)模的非土地植物組織培養(yǎng)可以解決該問(wèn)題。通過(guò)組織培養(yǎng)方法可獲得有效成分含量高、生產(chǎn)周期短的三七組織培養(yǎng)物，從而代替土地栽培的三七，解決土地問(wèn)題和三七藥材供應(yīng)問(wèn)題，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義和社會(huì)意義。不定根培養(yǎng)是80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)，不定根是分化的植物器官，是由植物的愈傷組織誘導(dǎo)出來(lái)的根，和藥用植物的懸浮細(xì)胞相比，其有效成分含量穩(wěn)定，和大田栽培的植物相比，不僅有效成分含量高而穩(wěn)定、 生長(zhǎng)速度快，而且節(jié)省土地資源，因此不定根培養(yǎng)尤其適合于根類(lèi)藥材的組織培養(yǎng)，以組織培養(yǎng)物或其有效成分替代名貴稀有緊缺的三七原料。組織培養(yǎng)具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)使用植物材料資源少，僅利用植物的一小部分營(yíng)養(yǎng)器官作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)；(2)生產(chǎn)周期短，繁殖系數(shù)大，在短期內(nèi)可生產(chǎn)出大量組織，生產(chǎn)速度超過(guò)大田栽培；(3)不受環(huán)境、季節(jié)限制， 可在有限空間內(nèi)進(jìn)行操作；利于工廠化生產(chǎn)。(4)可獲得脫毒的無(wú)菌組織，提高藥用植物的品質(zhì)。生物反應(yīng)器是實(shí)現(xiàn)植物組織大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵因素之一，其具有工作體積大、單位體積生產(chǎn)能力高，物質(zhì)和化學(xué)條件控制方便，不受時(shí)間和地點(diǎn)限制，隨時(shí)隨地規(guī)?；a(chǎn)等許多優(yōu)點(diǎn)，為植物組織培養(yǎng)生產(chǎn)天然產(chǎn)物的商業(yè)化開(kāi)辟了廣闊前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種三七不定根的培養(yǎng)方法。與傳統(tǒng)大田栽培方法比較，本發(fā)明培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、效率高，次生代謝產(chǎn)物含量高、主要皂苷成分均得以表達(dá)且其比例與藥材相近；不定根生長(zhǎng)迅速、無(wú)內(nèi)生真菌污染，本培養(yǎng)工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、規(guī)模生產(chǎn)迅速方便。本發(fā)明三七不定根的培養(yǎng)方法包括以下步驟(7)三七愈傷組織的誘導(dǎo)將三七根消毒，切成小片，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周可見(jiàn)愈傷組織形成；(8)三七愈傷組織的擴(kuò)增與繼代培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的2，4-D、IAA和激動(dòng)素中的任一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周；(9)三七不定根的誘導(dǎo)將擴(kuò)增出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周，可見(jiàn)不定根的形成；(10)三七不定根的擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)將已形成的不定根接種于MS固體培養(yǎng)基上， 加入濃度為lmg/L的IBA、NAA和激動(dòng)素中的任一種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周； (11)三七不定根不同根系的篩選和活性成分的測(cè)定及擴(kuò)繁對(duì)培養(yǎng)出的不同生長(zhǎng)情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)行擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進(jìn)行活性成分的測(cè)定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系， 并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的 IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在IOOrpm速度的搖床上、25度避光條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)周期為3_4 周。(12)三七不定根的反應(yīng)器培養(yǎng)將不定根接種于內(nèi)部裝有含3-5%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的氣升式反應(yīng)器中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在供氣速度為 0. lvvmU8-25度及避光或光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為6_12周，即得三七不定根。本培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、效率高，次生代謝產(chǎn)物含量高、主要皂苷成分均得以表達(dá)且其比例與藥材相近；不定根生長(zhǎng)迅速、無(wú)內(nèi)生真菌污染，本培養(yǎng)工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、規(guī)模生產(chǎn)迅速方便。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 將三七根消毒，切成小片，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3周可見(jiàn)愈傷組織形成；將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的激動(dòng)素，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3周；將擴(kuò)增出的愈傷組織接種于 MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3周，可見(jiàn)不定根的形成；將已形成的不定根接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的IBA、，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3 周；對(duì)培養(yǎng)出的不同生長(zhǎng)情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)行擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進(jìn)行活性成分的測(cè)定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系，并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)周期為3周。將不定根接種于內(nèi)部裝有含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的氣升式反應(yīng)器中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在供氣速度為0. lvvm, 18_25°C及避光或光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為6-8周，即得三七不定根。實(shí)施例2 將三七根消毒，切成小片，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)5周可見(jiàn)愈傷組織形成；將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的IAA，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)4周；將擴(kuò)增出的愈傷組織接種于MS 固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3周，可見(jiàn)不定根的形成；將已形成的不定根接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的NAA、，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)5 周；對(duì)培養(yǎng)出的不同生長(zhǎng)情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)行擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進(jìn)行活性成分的測(cè)定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系，并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)周期為5周。將不定根接種于內(nèi)部裝有含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的氣升式反應(yīng)器中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在供氣速度為0. lvvm、18_25°C及避光或光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為8-10周，即得三七不定根。實(shí)施例3 將三七根消毒，切成小片，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)5周可見(jiàn)愈傷組織形成；將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的IAA，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)4周；將擴(kuò)增出的愈傷組織接種于MS 固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3周，可見(jiàn)不定根的形成；將已形成的不定根接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入濃度為lmg/L的IBA、，在無(wú) 菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)5 周；對(duì)培養(yǎng)出的不同生長(zhǎng)情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)行擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進(jìn)行活性成分的測(cè)定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系，并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)周期為5周。將不定根接種于內(nèi)部裝有含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的氣升式反應(yīng)器中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在供氣速度為0. lvvm、18_25°C及避光或光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為10-12周，即得三七不定根。
權(quán)利要求
1.一種三七不定根的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟(1)三七愈傷組織的誘導(dǎo)將三七根消毒，切成小片，接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、 室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周可見(jiàn)愈傷組織形成；(2)三七愈傷組織的擴(kuò)增與繼代培養(yǎng)將誘導(dǎo)出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上， 加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周；(3)三七不定根的誘導(dǎo)將擴(kuò)增出的愈傷組織接種于MS固體培養(yǎng)基上，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周，可見(jiàn)不定根的形成；(4)三七不定根的擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)將已形成的不定根接種于MS固體培養(yǎng)基上，加入植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在無(wú)菌、室溫及避光條件下培養(yǎng)3-5周；(5)三七不定根不同根系的篩選和活性成分的測(cè)定及擴(kuò)繁對(duì)培養(yǎng)出的不同生長(zhǎng)情況、不同顏色及不同粗細(xì)的不定根進(jìn)行分類(lèi)，進(jìn)行擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)，待株系穩(wěn)定后，進(jìn)行活性成分的測(cè)定，并建立相應(yīng)成分的指紋圖譜，然后根據(jù)檢測(cè)結(jié)果篩選出最優(yōu)不定根系，并接種于內(nèi)裝含3%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的不同體積三角瓶中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在IOOrpm速度的搖床上、25°C避光條件下進(jìn)行擴(kuò)繁，培養(yǎng)周期為3_4周。(6)三七不定根的反應(yīng)器培養(yǎng)將不定根接種于內(nèi)部裝有含3-5%蔗糖的MS液體培養(yǎng)基的氣升式反應(yīng)器中，并加入濃度為lmg/L的IBA植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，在供氣速度為0. Ivvm, 18-25°C及避光或光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為6-12周，即得三七不定根。
2.如權(quán)利要求1所述的三七不步根的培養(yǎng)方法，其特征在于，如步驟(2)所述的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，選自濃度為lmg/L的2，4-D、IAA和激動(dòng)素。
3.如權(quán)利要求1所述的三七不步根的培養(yǎng)方法，其特征在于，如步驟(4)所述的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，選自濃度為lmg/L的IBA、NAA和激動(dòng)素。
全文摘要
本發(fā)明提供一種三七不定根的培養(yǎng)方法，包括三七愈傷組織的誘導(dǎo)、三七愈傷組織的擴(kuò)增與繼代培養(yǎng)、三七不定根的誘導(dǎo)、三七不定根的擴(kuò)繁與繼代培養(yǎng)、三七不定根不同根系的篩選和擴(kuò)繁及三七不定根的反應(yīng)器培養(yǎng)本培養(yǎng)方法簡(jiǎn)單、效率高，次生代謝產(chǎn)物含量高、主要皂苷成分均得以表達(dá)且其比例與藥材相近；不定根生長(zhǎng)迅速、無(wú)內(nèi)生真菌污染，本培養(yǎng)工藝操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好、規(guī)模生產(chǎn)迅速方便。
文檔編號(hào)A01H4/00GK102210265SQ20101013928
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2010年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月2日
發(fā)明者宋波 申請(qǐng)人:上海天龍藥業(yè)有限公司