專利名稱：一種墨蘭種苗繁殖方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種蘭花育苗繁殖技術(shù)，尤其是一種組織培養(yǎng)與菌根真菌共生培養(yǎng)育 苗的繁殖技術(shù)。
背景技術(shù)：
蘭花是指整個蘭科植物(Orchidaceae)的總稱。在我國，傳統(tǒng)的“蘭花”概念僅指 產(chǎn)于我國的蘭科、蘭屬(Cymbidium)植物，稱國蘭，地生，故又稱地生蘭。蘭科植物是一類觀 賞價值和經(jīng)濟價值極高的珍貴植物。其中，云南蘭科植物就有100屬，530多種，為全國之冠。但是到目前為止，我國蘭花開發(fā)與利用仍處于初級階段，未能解決大量繁殖 的問題，因此供需矛盾突出。一方面是由于經(jīng)濟利益的驅(qū)動，農(nóng)民上山大量采挖野生 蘭花，野生蘭花資源受到嚴重破壞，尤其是較名貴的墨蘭(Cymbidium sinense)、春蘭 (Cymbidiumgoeringii)、寒蘭(Cymbidium kanran)、春劍(Cymbidium longibracteatun)禾口 連瓣蘭(Cymbidiumlianpan)破壞最為嚴重。其次是森林面積大幅度減少，蘭花生存環(huán)境的 改變，不僅對野生蘭花種群延續(xù)形成威脅，也使得許多種類蘭花在一些地區(qū)消失。近年來， 我國加強了野生植物資源的保護工作，我國第一部專門保護野生植物的行政法規(guī)《中華人 民共和國野生植物保護條例》自1997年1月1日實施，根據(jù)該條例的規(guī)定，擬定并經(jīng)審議通 過了《國家重點保護野生植物名錄》，蘭科所有種均列在名錄中。但是僅采用法律形式保護 蘭花資源還是遠遠不夠的，在加強管理的同時，也應(yīng)重視發(fā)展蘭花的繁殖技術(shù)，才能根本解 決保護蘭花物種的目的。蘭花的繁殖技術(shù)目前主要有兩種，分株和組織培養(yǎng)。傳統(tǒng)的分株繁殖速度慢，繁殖 率低，周期長，且易傷母株，種子在自然條件下發(fā)芽率極低，很難滿足規(guī)?；a(chǎn)的需要。而 組織培養(yǎng)，移栽無菌苗成活率低，生長發(fā)育緩慢，開花遲，甚至不開花，原因主要是缺少與之 共生的菌根真菌。真菌為蘭花提供生長繁殖所必需的營養(yǎng)物質(zhì)。蘭科植物與菌根真菌形成 菌根是自然界的一種普遍現(xiàn)象，所以菌根真菌為蘭科植物提供營養(yǎng)進行生長發(fā)育是解決人 工栽培蘭科植物的關(guān)鍵，也是我國蘭花資源與利用保護所面臨的主要問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的就是僅靠分株和組織培養(yǎng)繁殖墨蘭不能夠滿足我國蘭花植物 資源保護的問題。本發(fā)明從野生墨蘭根中分離內(nèi)生真菌，使其與墨蘭組培苗共生培養(yǎng)，篩選 出能與墨蘭組培苗有效共生并能明顯促進其生長發(fā)育的有效菌根真菌，對墨蘭組培苗進行 菌根化培育，從根本上克服了試管苗繁殖，缺乏菌根真菌，移栽無菌苗成活率低，生長緩慢， 開花遲緩，花小甚至不開花的缺點。本發(fā)明的一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增 殖和生根培養(yǎng)過程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進行生根苗的煉苗及與菌根真 菌的菌根化過程，具體為
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煉苗將生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開瓶蓋過渡1 1. 5周后取出，洗凈沾附在 小苗根部的培養(yǎng)基備用；苗木菌根化將取出的小苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤中，在適度溫 度下，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間向葉部噴灑水，促進新根生長，3周后移入溫室中進行正常 水、肥、藥管理，9. 5月后即可得菌根化種苗；所述的基質(zhì)是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4 份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp. MLX102)的櫟樹 葉三級菌種少許而得。上述的種子萌發(fā)過程主要包括以下步驟a)外植體的選擇選擇墨蘭未裂開的蒴果為外植體；b)種子處理將墨蘭蒴果無菌處理后取出粉沫狀種子無菌處理；c)種子萌發(fā)將經(jīng)處理的墨蘭種子均勻播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長為原 球莖；所使用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/L椰 乳+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。上述的原球莖繼代增殖過程是將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增 殖培養(yǎng)50 60天，長成新芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代，即可幾何級數(shù)增長；所使 用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/ L，培養(yǎng)基PH值為5.0 6.0。上述的生根培養(yǎng)過程是將較大的根系不發(fā)達的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使生 根率達95%以上，植株生長旺盛，7周后形成5 7cm的小苗；所使用的培養(yǎng)基配方為 1/2MS+NAA0. 5mg/L+ 活性碳 0. 5g/L+ 蔗糖 25g/L+ 瓊脂 3g/L，培養(yǎng)基 PH 值為 5. 0 6. 0。本發(fā)明通過調(diào)整激素濃度、配比和根菌真菌的共生培養(yǎng)，能有效利用蘭科植物菌 根共生促進生長的特點，縮短蘭科植物組培苗的繁殖周期，成活率達到了 95%以上。本發(fā)明 采用墨蘭種子無菌萌發(fā)與菌根真菌共生的菌根化培育技術(shù)，既可繁殖優(yōu)良品種，從種子實 生苗中選擇優(yōu)良蘭株，又能快速提高墨蘭繁育速度，克服純組培苗生長緩慢，周期長，甚至 不開花的缺點，對墨蘭的大面積產(chǎn)業(yè)化擴繁具有重要的利用價值。
具體實施例方式實施例1 選用2003年在云南省西雙版納野生的優(yōu)良單株上采得的墨蘭種子，于 2004年6月份在西南林學(xué)院的溫室大棚內(nèi)進行煉苗，該繁殖方法墨蘭種苗成活率達到了 95%以上，具體的種苗繁殖過程如下(1)種子萌發(fā)將野外成熟180天的蒴果采回，在4度冰箱種冷藏2周，用流水沖洗 20分鐘取墨蘭未裂開的蒴果為外植體。在70 75%的酒精中表面消毒30 50秒，無菌水 漂洗一次，又用2%的次氯酸鈉消毒20分鐘，用無菌水沖洗4 5次，再以0. 的升汞溶 液消毒10 15分鐘，最后用無菌水沖洗5次。將洗凈的成熟蒴果置于滅菌濾紙上吸干水 分，把消毒的蒴果置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用無菌手術(shù)刀縱向切開墨蘭蒴果；再用鑷子取出 墨蘭粉沫狀種子放入預(yù)先準備好的無菌小濾紙袋內(nèi)，浸入0. 15 0. 2mol/L的NaOH溶液中 處理8 10分鐘取出，在無菌水中沖洗4 5次，每次換水前用滅過菌的干濾紙擠壓濾紙 袋吸干水分；然后把經(jīng)處理的墨蘭種子均勻地播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上，暗培養(yǎng)2周后轉(zhuǎn) 入每天光照12 14小時，光照強度1000 15001UX，溫度25°C。培養(yǎng)160 180天即可
4生長為原球莖。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/ L椰乳+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(2)原球莖繼代增殖將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)， 原球莖增殖速度快，增殖效果好，50 60天長成新芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代， 即可幾何級數(shù)增長。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+ 蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(3)生根培養(yǎng)將較大的根系不發(fā)達的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，植株生長旺盛， 7周后形成5 7cm的小苗，根系發(fā)達。其培養(yǎng)基的配方為1/2MS+NAA0. 5mg/L+活性碳0. 5g/ L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. O 6. O。(4)煉苗將7 8厘米高的生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開瓶蓋過渡1 1. 5周 后，取出洗凈沾附在小苗根部的培養(yǎng)基備用。(5)苗木菌根化將取出的苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤中，管護中 保持適度溫度，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間只需葉部噴灑水，有利于新根生長，3周后移入溫 室中，進行正常水、肥、藥管理，成活率可達95%以上，9. 5月后即可得菌根化種苗。其基質(zhì) 是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌 液(Rhizoctonia sp. MLX102)的櫟樹葉三級菌種少許而得。
權(quán)利要求
一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增殖和生根培養(yǎng)過程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進行生根苗的煉苗及與菌根真菌的菌根化過程，具體為煉苗將生根苗在室內(nèi)自然光照條件下開瓶蓋過渡1～1.5周后取出，洗凈沾附在小苗根部的培養(yǎng)基備用；苗木菌根化將取出的小苗用含有菌根真菌的基質(zhì)包裹種植于穴盤中，在適度溫度下，置于陰涼通風(fēng)處栽培，期間向葉部噴灑水，促進新根生長，3周后移入溫室中進行正常水、肥、藥管理，9.5月后即可得菌根化種苗；所述的基質(zhì)是按重量份分別將1/4份泥炭、1/4份珍珠巖、1/4份干腐質(zhì)土和1/4份紅土中加入拌有菌液(Rhizoctonia sp.MLX102)的櫟樹葉三級菌種少許而得。
2.如權(quán)利要求1所述的一種墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的種子萌發(fā)過程主要 包括以下步驟a)外植體的選擇選擇墨蘭未裂開的蒴果為外植體；b)種子處理將墨蘭蒴果無菌處理后取出粉沫狀種子無菌處理；c)種子萌發(fā)將經(jīng)處理的墨蘭種子均勻播種在種子萌發(fā)培養(yǎng)基上培養(yǎng)生長為原球莖； 所使用的培養(yǎng)基配方為1/2MS+NAA0. 5 1. Omg/L+6-BAO. 5 1. 0mg/L+100ml/L椰乳+甘 露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。
3.如權(quán)利要求1所述的一利墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的原球莖繼代增 殖過程是將初代培養(yǎng)的原球莖和芽分別在培養(yǎng)基上繼代增殖培養(yǎng)50 60天，長成新 芽或原球莖，以后不斷切割原球莖繼代，即可幾何級數(shù)增長；所使用的培養(yǎng)基配方為 1/2MS+KT0. 5mg/L+甘露醇lg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為 5. 0 6. O0
4.如權(quán)利要求1所述的一種墨蘭種苗繁殖方法，其特征在于所述的生根培養(yǎng)過程是將 較大的根系不發(fā)達的苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)，使生根率達95 %以上，植株生長旺盛，7周 后形成5 7cm的小苗；所使用的培養(yǎng)基配方為dAMS+NAAO. 5mg/L+活性碳0. 5g/L+蔗糖 25g/L+瓊脂3g/L，培養(yǎng)基PH值為5. 0 6. 0。
全文摘要
一種墨蘭種苗繁殖方法，屬于一種蘭花育苗繁殖技術(shù)，尤其是一種組織培養(yǎng)與菌根真菌共生培養(yǎng)育苗的繁殖技術(shù)。本發(fā)明的一種墨蘭種苗繁殖方法，其種苗獲得主要包括種子萌發(fā)、原球莖繼代增殖和生根培養(yǎng)過程，其特征在于該繁殖方法在種苗獲得后還進行生根苗的煉苗及與菌根真菌的菌根化過程。本發(fā)明采用墨蘭種子無菌萌發(fā)與菌根真菌共生的菌根化培育技術(shù)，既可繁殖優(yōu)良品種，從種子實生苗中選擇優(yōu)良蘭株，又能快速提高墨蘭繁育速度，克服純組培苗生長緩慢，周期長，甚至不開花的缺點，對墨蘭的大面積產(chǎn)業(yè)化擴繁具有重要的利用價值。
文檔編號A01H17/00GK101983554SQ201010127760
公開日2011年3月9日 申請日期2010年3月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月19日
發(fā)明者丁暉, 伍建榕, 劉麗, 張東華, 洪英娣, 王錦, 胡雋, 馬煥成 申請人:西南林學(xué)院