專利名稱：一種乳源抗菌肽的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)屬于添加劑領(lǐng)域，具體涉及一種在動物技術(shù)領(lǐng)域中作營養(yǎng)食物的乳源抗菌肽
的制備方法。
背景技術(shù)：
乳源抗菌肽(Casein Glyco Macro P印t ide， CGMP)是乳中k 一酪蛋白的一個(gè) 多肽片段，通常作為酪蛋白膠束的一部分，通常此可溶性的多肽含有較多的糖鏈，于是被稱 為"糖巨肽"，而酪蛋白來源的此類肽都統(tǒng)統(tǒng)稱為"乳源抗菌肽"(CGMP)。 k 一酪蛋白來源 的CGMP的氨基酸序列已清楚，它是由從k 一酪蛋白的N末端106位氨基酸(Met)開始至 169位C末端(Val)結(jié)束的64個(gè)殘基構(gòu)成的。牛的CGMP有A和B2種遺傳變異型，其不同 在于該多肽鏈的136位和148位的氨基酸不同，A型的136位和148位殘基氨基酸分別為 Thr和Asp，而B型為Ile和Ala。此外該墮胎的131、 133、 135、 136和142位的蘇氨酸殘基 為配糖體化的部位，149位餓絲氨酸為磷酸化的部位。 —般來說，CGMP多肽鏈的分子質(zhì)量約為9ku，但隨pH變化而變化，在酸性范圍內(nèi)如 pH3. 5，大約為10 30ku，中性條件如pH7. 0，為20 50ku左右。許多CGMP的生產(chǎn)制備方 法就基于CGMP的此特性，利用超濾進(jìn)行分離純化。
經(jīng)胃蛋白酶處理k -酪蛋白產(chǎn)生的CGMP中含有大〗 (1)單糖GalNAc-O-R ;
:的活性多糖，包括





(2) 雙糖Gal P 1 — 3GalNAc-0-R
(3) 三糖NeuAc a 2 — 3Gal P 1 —
(4) 三糖Gal P 1 — 3 (NeuAc a 2 -
(5) 四糖NeuAc a 2 — 3Gal P 1 —
6)GalNAc-O-R
3Ga皿c-0-R ; 6)GalNAc-O-R 3(NeuAc a 2 _
其中Gal是半乳糖；GalNAc是N_乙酰半乳糖胺；NeuAc是唾液酸。 涎酸是乳源抗菌肽中含量較高的活性單糖。它是神經(jīng)氨酸的涎基誘導(dǎo)體的總稱， 涎酸的pH值約為2. 6，在自然界中主要以N-乙酰神經(jīng)氨酸(Neu5Ac)形式廣泛存在于植物 之外的生物體中。研究表明涎酸具有許多的生理功能，最主要的生理功能是在生物體內(nèi)防 御機(jī)制中起較重要作用。人的母乳中含有高濃度的涎酸，經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn)其與乳嬰兒的發(fā) 育以及感染防御機(jī)制具有較大的關(guān)系；此外，最新研究顯示涎酸還具有抑制引起下痢原因 的病毒感染作用和提高學(xué)習(xí)能力的效果，同時(shí)，一部分的涎酸可移至腦內(nèi)，從而與腦的發(fā)育 具有較大的關(guān)系(WARREN， 1959)。而乳中約75%以上的涎酸存在于CGMP中，因此其生理功 能不言而喻。 與CGMP有關(guān)的大量體外及體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，該多肽具有多種生理活性功能。乳源抗 菌肽的生理功能主要有 它能結(jié)合霍亂和埃希氏大腸桿菌的腸毒素。研究已表明(KAWASAKI, 1992)霍亂毒 素業(yè)單位A和B的受器是一種神經(jīng)節(jié)苷脂，這種神經(jīng)節(jié)苷脂與乳源抗菌肽的寡糖結(jié)構(gòu)類似， 因此，CGMP有結(jié)合霍亂毒素和埃希氏大腸桿菌毒素的特性。
乳源抗菌肽能抑制病原體包括病毒和細(xì)菌等黏附至細(xì)胞，保護(hù)機(jī)體免受病原體的 感染。研究表明，CGMP能減弱齲齒發(fā)生的機(jī)制是CGMP能使產(chǎn)生牙齒噬菌斑的微生物組成 發(fā)生改變，使其微生物群由葡萄球菌變?yōu)橛珊苋踔掳┬缘姆谰€菌組成，研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)乳源 抗菌肽不僅抑制齲齒而且可使牙齒重新無機(jī)化。 乳源抗菌肽能抑制胃分泌物。有關(guān)乳源抗菌肽與胃腸道收縮關(guān)系的材料弓|起了人 們的廣泛興趣。Stan (Stan Eya. ， 1983)等人認(rèn)為減弱胃分泌物將會降低動物胃蛋白水解作 用，這樣會保護(hù)乳中來源的免疫球蛋白、乳鐵蛋白及溶菌酶等蛋白質(zhì)原封不動的穿過胃，這 會有益于嬰兒以及免疫力低下的人增強(qiáng)免疫力。 能促進(jìn)雙歧桿菌的生長。在鑒別雙歧桿菌的一項(xiàng)研究中，Gyorzy等人發(fā)現(xiàn)以N-乙 酰神經(jīng)胺酸結(jié)尾的寡糖能促進(jìn)雙歧桿菌的生長，并且他們提出這是由于末端的N-乙酰神 經(jīng)胺酸脫落，暴露了一個(gè)GalNAc的緣故。 具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的反應(yīng)的功能(AZUMA， 1984)。乳源抗菌肽能抑制由LPS激發(fā) 的B淋巴細(xì)胞增殖和由PHA(植物血凝集素-P)激發(fā)的T淋巴細(xì)胞增殖。其進(jìn)一步影響是 下調(diào)免疫系統(tǒng)和減弱口腔的耐受性，這將會給一個(gè)剛出生的動物一種能夠被保護(hù)的機(jī)制， 使動物能抵抗環(huán)境內(nèi)很寬范圍內(nèi)的抗原。 含有CGMP的部分商品已經(jīng)被應(yīng)用到人們的生活當(dāng)中，例如，在美國，加入CGMP的 牙膏已經(jīng)研制成功，它可以抑制齲齒和口腔潰瘍的發(fā)生(Berrocal. ， 1993);有文章認(rèn)為， 把乳源抗菌肽加入到餅干、果凍等食品中能增進(jìn)人體健康，使機(jī)體增強(qiáng)免疫力；在醫(yī)藥制品 中加入CGMP用于血栓癥的治療；CGMP能結(jié)合腸毒素的特性使它廣泛的應(yīng)用于嬰幼兒食品 當(dāng)中(Marshall S. C. ， 1991)。 此外，CGMP具有獨(dú)特的氨基酸組成，特別是幾乎不含有芳香族氨基酸，可作為苯丙 酮尿癥患者(PKU，一種不能代謝芳香族氨基酸的遺傳病)膳食中首選的成分。CGMP含有較 多的支鏈氨基酸(如Val和lie)，可用于多種肝病的治療，相關(guān)的研究人員認(rèn)為，支鏈氨基 酸與芳香族氨基酸的比率系數(shù)越大，其對肝病的治療效果越好，經(jīng)證實(shí)，此系數(shù)約為20左 右時(shí)，CGMP可作為肝病患者的膳食，效果很好。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種乳源抗菌肽的制備方法。
為實(shí)現(xiàn)該目的，本發(fā)明方法采取如下具體步驟 (1)首先將酪蛋白溶解在去離子水中制成酪蛋白懸濁液，酪蛋白懸濁液中酪蛋白 與去離子水的重量比為l : 5 10;然后用酸調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的pH值為2 4，置于 30 5(TC水浴中保溫10 20分鐘，向懸濁液中加入胃蛋白酶，酶解1 2小時(shí)，得到酶解 液。胃蛋白酶的加入量與酪蛋白底物質(zhì)量比為1 : 25 50;所用的酸為HC1或H^04。
(2)將酶解液水浴溫度升至70 90°C ，保持15 25分鐘，使酶失去活性，迅速降 低溫度至3 5。C，離心得到粗上清液；離心速度為3000 4000r/min。
(3)在粗上清液中加入溫度為4 81\質(zhì)量濃度為50 60% (三氯乙酸)TCA溶 液，靜置5 10分鐘后離心，取上清液；離心速度為4000 4500r/min離心。加入的TCA 溶液與粗上清液的體積比為1 : 8 12。 (4)透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液。所用透析袋的截留分子量為7000 140000。
(5)將得到的乳源抗菌肽溶液經(jīng)冷凍干燥，得到乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物。 本發(fā)明方法工藝簡便、成本低廉、提取率高、安全有效且無毒負(fù)作用，所制得的產(chǎn)
品純度高，適宜于規(guī)模化工業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 (1)首先將100克酪蛋白溶解在1L的去離子水中制成酪蛋白懸濁液，然后用HC1 調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的PH值為4，置于3(TC水浴中保溫20分鐘，再向懸濁液中加入2克胃蛋 白酶，酶解1小時(shí)，得到酶解液。 (2)將酶解液水浴溫度升至70°C ，保持25分鐘，迅速降低溫度至4°C ， 3000r/m的 速度下離心，取上清，得粗上清液。 (3)在粗上清液中加入溫度為fC、質(zhì)量濃度為50%的TCA溶液，靜置5分鐘后離 心，取上清液。所用TCA的體積與粗上清液的體積比為1 : 8，離心轉(zhuǎn)速為4000r/min。
(4)用截留分子量為7000的透析袋透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液。
(5)將得到的乳源抗菌肽溶液經(jīng)冷凍干燥，得到24.3g乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物， 通過凱氏定氮法測定產(chǎn)品中總蛋白含量、唾液酸含量得到產(chǎn)品純度為87.6%，產(chǎn)率為 24. 3%。 實(shí)施例2 (1)首先將150克酪蛋白溶解在1L的去離子水中制成酪蛋白懸濁液，然后用H2S04 調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的PH值為3，置于5(TC水浴中保溫10分鐘，再向懸濁液中加入5克胃蛋 白酶，酶解1. 5小時(shí)，得到酶解液。 (2)將酶解液水浴溫度升至80°C ，保持20分鐘，迅速降低溫度至3°C ， 3500r/m的 速度下離心，取上清，得粗上清液。 (3)在粗上清液中加入溫度為6t:、質(zhì)量濃度為55%的TCA溶液，靜置8分鐘后離 心，取上清液。所用TCA的體積與粗上清液的體積比為1 : 10，離心轉(zhuǎn)速為4200r/min。
(4)用截留分子量為10000的透析袋透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液。
(5)將得到的乳源抗菌肽溶液經(jīng)冷凍干燥，得到43.8g乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物， 通過凱氏定氮法測定產(chǎn)品中總蛋白含量、唾液酸含量得到產(chǎn)品純度為89. 1%，產(chǎn)率為 29. 2%。 實(shí)施例3 (1)首先將200克酪蛋白溶解在1L的去離子水中制成酪蛋白懸濁液，然后用HC1 調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的pH值為2，置于4(TC水浴中保溫15分鐘，再向懸濁液中加入8克胃蛋 白酶，酶解2小時(shí)，得到酶解液。 (2)將酶解液水浴溫度升至90°C，保持15分鐘，迅速降低溫度至5°C，4000r/m的 速度下離心，取上清，得粗上清液。 (3)在粗上清液中加入溫度為8t:、質(zhì)量濃度為60%的TCA溶液，靜置10分鐘后離 心，取上清液。所用TCA的體積與粗上清液的體積比為1 : 12，離心轉(zhuǎn)速為4500r/min。
(4)用截留分子量為14000的透析袋透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液。
(5)將得到的乳源抗菌肽溶液經(jīng)冷凍干燥，得到61g乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物，通過 凱氏定氮法測定產(chǎn)品中總蛋白含量、唾液酸含量得到產(chǎn)品純度為93. 2%，產(chǎn)率為30. 5%。
權(quán)利要求
一種乳源抗菌肽的制備方法，其特征在于該方法的具體步驟是(1)首先將酪蛋白溶解在去離子水中制成酪蛋白懸濁液，酪蛋白懸濁液中酪蛋白與去離子水的重量比為1∶5～10；然后用酸調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的pH值為2～4，置于30～50℃水浴中保溫10～20分鐘，向懸濁液中加入胃蛋白酶，酶解1～2小時(shí)，得到酶解液；胃蛋白酶的加入量與酪蛋白底物質(zhì)量比為1∶25～50；(2)將酶解液水浴溫度升至70～90℃，保持15～25分鐘，迅速降低溫度至3～5℃，離心得到粗上清液；離心速度為3000～4000r/min；(3)在粗上清液中加入溫度為4～8℃、質(zhì)量濃度為50～60％的三氯乙酸溶液，靜置5～10分鐘后離心，取上清液；離心速度為4000～4500r/min離心；加入的TCA溶液與粗上清液的體積比為1∶8～12；(4)透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液；(5)將得到的乳源抗菌肽溶液經(jīng)冷凍干燥，得到乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物。
2. 如權(quán)利要求1所述的一種乳源抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟(1)中所述的 酸為HC1或H2S04。
3. 如權(quán)利要求1所述的一種乳源抗菌肽的制備方法，其特征在于步驟(4)中透析所 用的透析袋的截留分子量為7000 140000。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種乳源抗菌肽的制備方法。本發(fā)明方法首先將酪蛋白溶解在去離子水中制成酪蛋白懸濁液，用酸調(diào)節(jié)酪蛋白懸濁液的pH值為2～4，向懸濁液中加入胃蛋白酶得到酶解液；將酶解液水浴溫度升溫后迅速降低溫度，離心得到粗上清液；在粗上清液中加入三氯乙酸溶液，靜置后離心，透析上清液，得到純凈的乳源抗菌肽溶液，經(jīng)冷凍干燥，得到乳源抗菌肽的干燥產(chǎn)物。本發(fā)明方法工藝簡便、成本低廉、提取率高、安全有效且無毒負(fù)作用，所制得的產(chǎn)品純度高，適宜于規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)。
文檔編號A23K1/17GK101744124SQ201010104660
公開日2010年6月23日 申請日期2010年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月29日
發(fā)明者馮杰, 周源, 王勇, 馬文強(qiáng) 申請人:浙江大學(xué)