專利名稱：用利血平構(gòu)建血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用利血平構(gòu)建血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模 型的方法。
背景技術(shù)：
褪黑素(melatonin,簡(jiǎn)稱MT)是1958年耶魯大學(xué)皮膚病學(xué)專家Lerner首次從牛的松果 體分離出的一種吲哚類激素，通常在凌晨機(jī)體內(nèi)含量最高，有以下三個(gè)顯著特點(diǎn)(1) MT 在血液濃度中呈晝夜節(jié)律、季節(jié)性節(jié)律的變化，并伴隨年齡的增長(zhǎng)，其各種生理功能的晝夜 節(jié)律振幅變小，周期性活動(dòng)的位相偏移和非同步化現(xiàn)象增加；(2)人類嬰幼兒期夜間MT水 平最高，從兒童到青春期平均MT水平下降80X，以后維持在這一水平，到50歲前后MT水平進(jìn) 一步下降；(3)機(jī)體所處的內(nèi)、外環(huán)境變化能明顯地影響機(jī)體本身MT血液濃度，而機(jī)體MT 受體mRNA水平則受光照和機(jī)體MT濃度的影響。人體的MT主要來(lái)源于松果體的分泌，作為一種 調(diào)節(jié)性激素，MT幾乎直接或間接影響其他所有激素的分泌，因而具有廣泛的生理和藥理活性 ，其晝夜、季節(jié)性節(jié)律與機(jī)體免疫、神經(jīng)、內(nèi)分泌和生殖系統(tǒng)等有密切聯(lián)系。
隨著現(xiàn)代分析儀器技術(shù)的提高，尤其是現(xiàn)代生物技術(shù)的運(yùn)用，如利用酶聯(lián)反應(yīng)檢測(cè)MT含 量，使得血清MT的檢測(cè)和動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)成為可能，也使人們對(duì)MT與人類疾病之間的關(guān)系有了更多 的了解。臨床研究顯示機(jī)體褪黑素水平降低不僅與老年病人失眠癥、高的癌癥發(fā)病率相關(guān) ，而且具體涉及諸多人類重大疾病，如惡性腫瘤、早老性癡呆(Alzheimer Disease, AD) 、心血管疾病等。隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和分子生物技術(shù)的發(fā)展，更多有關(guān)MT及其MT受體在疾病或相 關(guān)病理生理?xiàng)l件下的信息為臨床預(yù)防和治療提供了新的契機(jī)，其中最矚目的成果就是MT受體 激動(dòng)劑agomelatine即一個(gè)擁有全新作用機(jī)制的抗抑郁藥的誕生。
目前作為機(jī)體褪黑素水平降低的主要?jiǎng)游锬Ｐ陀?、去松果體動(dòng)物模型，即依據(jù)松果 體是MT主要分泌器官，在動(dòng)物幼年時(shí)期除去松果體即會(huì)影響動(dòng)物機(jī)體體內(nèi)MT的水平。2、 MT 受體基因敲出的動(dòng)物模型；3、持續(xù)光照模型，即依據(jù)哺乳動(dòng)物松果體細(xì)胞合成和分泌MT的 過程具有明顯的晝夜節(jié)律，主要表現(xiàn)為暗相時(shí)MT合成和分泌增加，光照相時(shí)MT的合成和分泌 減少。在上述模型中雖然都是著重于對(duì)機(jī)體內(nèi)MT水平的影響，但是在第一類模型中，鑒于松 果體內(nèi)含有包括MT、五羥色胺(5-HT， MT在體內(nèi)合成的前體物質(zhì))、腎上腺素、去甲腎上腺 素、促生長(zhǎng)激素、促性腺釋放激素等近二十種激素，加上開顱手術(shù)的創(chuàng)傷性，使得該模型實(shí)際操作的可行性受到質(zhì)疑，畢竟該模型并不能僅僅只反映出機(jī)體MT水平降低對(duì)機(jī)體的影響；
盡管近十年來(lái)，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、基因打耙和基因敲除技術(shù)，將研究手段精細(xì)到了具體的激 素或激素受體基因，從而準(zhǔn)確復(fù)制出單個(gè)激素或激素受體基因過表達(dá)(亢進(jìn))或無(wú)表達(dá)(低 下)的動(dòng)物模型，從腺體切除到基因敲除的確是一種質(zhì)的飛躍，但是同樣的問題也出現(xiàn)在第
二類動(dòng)物模型中，因?yàn)镸T受體存在著不同亞型，在哺乳動(dòng)物機(jī)體內(nèi)分布十分廣泛，其相應(yīng)的 作用機(jī)能的研究并不完善，而且機(jī)體MT濃度影響MT受體mRNA水平，也因此給實(shí)際運(yùn)用帶來(lái)一 定的困擾；持續(xù)光照模型制備周期很長(zhǎng)，必須考慮季節(jié)性影響和年齡因素，即隨動(dòng)物年齡增 長(zhǎng)其體內(nèi)MT會(huì)逐步降低這一事實(shí)，因而尚須進(jìn)一步完善。所以構(gòu)建一個(gè)血清MT持續(xù)低下的動(dòng) 物模型，尤其是與臨床癥狀相對(duì)應(yīng)的動(dòng)物模型是當(dāng)務(wù)之急，也是研究與之相關(guān)聯(lián)疾病預(yù)防和 治療的重要方法和手段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。 該方法是為在每只動(dòng)物皮下注射利血平O. 08 8mg/Kg d，每天一次，連續(xù)5 15天。
其中，上述方法為在每只動(dòng)物皮下注射利血平O. 08 0. 3mg/Kg d，每天一次，連續(xù)IO 15天。
其中，上述方法在皮下注射利血平的期間還每日口服灌胃動(dòng)物番瀉葉、芒硝、大黃或大 承氣湯中至少一種的生藥浸煎液，每種生藥每lml含l g，劑量每10g體重0.2-2.0ml 。
其中，上述方法還每日口服灌胃動(dòng)物每lml含l g廣豆根、旋覆花、檳榔中至少一種的生 藥浸煎液。
其中，上述浸煎液的pH值為2《pIK7。
其中，上所述浸煎液的溫度調(diào)整至4'C 。
上述方法中所述的動(dòng)物為常見的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如小鼠、大鼠、驢、兔、豬、犬或豚鼠等。 本發(fā)明還提供了利血平在制備導(dǎo)致動(dòng)物血清褪黑素水平低下的藥物中的用途。 有益效果本發(fā)明方法無(wú)創(chuàng)，低成本，周期短，可重復(fù)，不僅具有顯著西醫(yī)臨床生化指 標(biāo)特征，而且還具有中醫(yī)理論基礎(chǔ)特色，能成功且可重復(fù)的建立血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng) 物模型。為臨床研究相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)制、診斷治療相關(guān)疾病以及篩選、研究治療相關(guān)疾病藥 物創(chuàng)造條件。具有好的應(yīng)用前景。


圖l為用本發(fā)明方法建立的第一批褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型小鼠造模后第l天凌晨 1 2點(diǎn)血清MT的含量(n=15)， 實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比，P〈0.05。圖2為本發(fā)明方法建立的褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型小鼠造模后第4天凌晨1 2點(diǎn)血 清MT的含量(n=15)， 實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比，P〈0.05。
圖3為本發(fā)明方法建立的第一批褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型小鼠造模后第7天凌晨1 2點(diǎn)血清MT的含量(n=15)， 實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組相比，P〈0.05。
具體實(shí)施例方式
以下通過對(duì)本發(fā)明具體實(shí)施方式
的描述說明但不限制本發(fā)明。 試驗(yàn)例
1、 造模方法和分組
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，體重20士2g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物室提供。將動(dòng)物隨機(jī)分為3 個(gè)模型組和3個(gè)正常對(duì)照組，每組15只。
每只動(dòng)物皮下注射利血平O. 15mg/Kg d，連續(xù)9天，從第10 12天，每只動(dòng)物皮下注射 0.25mg/Kg*d，第13天每只動(dòng)物皮下注射0. 5mg/Kg，分兩次注射。第14天檢測(cè)第1對(duì)照組和 第1實(shí)驗(yàn)組小鼠凌晨1 2點(diǎn)的時(shí)候的血清MT濃度；第17天檢測(cè)第2對(duì)照組和第2實(shí)驗(yàn)組小鼠凌 晨1 2點(diǎn)的時(shí)候的血清MT濃度；第20天檢測(cè)第3對(duì)照組和第3實(shí)驗(yàn)組凌晨1 2點(diǎn)的時(shí)候的血清 MT濃度。
2、 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法
每次去眼球采血在凌晨1 2點(diǎn)，4"C冰箱靜置，4"C離心10min (2500r/min)，分離血清 于-8(TC保存待測(cè)。此次實(shí)驗(yàn)于2008年11 12月成都溫江進(jìn)行。采用ELISA法檢測(cè)MT，每一份 樣本進(jìn)行雙點(diǎn)測(cè)定，嚴(yán)格按說明書進(jìn)行操作。Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀檢測(cè)MT含量(小鼠褪黑 素ELISA Kit，武漢中美科技有限公司)。
3、 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法
數(shù)據(jù)的處理使用SPSSll. O統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。
4、 結(jié)果
圖l、圖2、圖3為利血平模型小鼠血清MT的含量參照正常對(duì)照組值的百分率，結(jié)果顯示 了在造模結(jié)束后第l天、第4天、第7天的凌晨1 2點(diǎn)，利血平脾虛模型組小鼠血清MT濃度與 正常對(duì)照組相比均顯著下降(P<0.05)，說明持續(xù)性血清MT低下模型造模成功。
權(quán)利要求
1.血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方法，其特征在于所述方法為在每只動(dòng)物皮下注射利血平0.08～8mg/Kg·d，每天一次，連續(xù)5～15天。
2 根據(jù)權(quán)利要求l所述的血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法，其特征在于所述方法為在每只動(dòng)物皮下注射利血平O. 08 0. 3mg/Kg d，每天一次， 連續(xù)10 15天。
3 根據(jù)權(quán)利要求l所述的血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法，其特征在于在皮下注射利血平的期間還每日口服灌胃動(dòng)物番瀉葉、芒硝、大黃或大承 氣湯中至少一種的生藥浸煎液，每lml含每種生藥l g，劑量每10g體重0.2-2.0ml 。
4 根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法，其特征在于還每日口服灌胃動(dòng)物每lml含l g廣豆根、旋覆花、檳榔中至少一種的生藥 浸煎液。
5 根據(jù)權(quán)利要求3所述的血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法，其特征在于所述浸煎液的pH值調(diào)整至2《pIK7。
6 根據(jù)權(quán)利要求4所述的血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方 法，其特征在于所述浸煎液的溫度調(diào)整至4'C。
7 利血平在制備導(dǎo)致動(dòng)物血清褪黑素水平低下的藥物中的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)領(lǐng)域，要解決的技術(shù)問題是提供血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型的構(gòu)建方法。本發(fā)明技術(shù)方案為在每只動(dòng)物皮下注射利血平0.08～8mg/kg·d，每天一次，連續(xù)5～15天。本發(fā)明方法步驟簡(jiǎn)便，能成功且可重復(fù)的建立血清褪黑素水平持續(xù)低下動(dòng)物模型，具有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)A01K67/027GK101574346SQ200910303169
公開日2009年11月11日 申請(qǐng)日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者凌智群 申請(qǐng)人:成都中醫(yī)藥大學(xué)