專(zhuān)利名稱(chēng)：：一種銅綠假單胞菌d10及其制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及植物保護(hù)領(lǐng)域，具體涉及一種銅綠假單胞菌D10及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：玉米大斑病是由子囊菌門(mén)球腔菌屬大斑剛毛球腔菌[Setosphaeriaturcica(Luttrell)Leonard"Suggs]所引起的以葉部產(chǎn)生大型病斑癥狀為主的玉米病害，其分布較廣，危害較重，在世界各地主要玉米產(chǎn)區(qū)該病害都有不同程度的發(fā)生和危害。據(jù)報(bào)道，在玉米大斑病嚴(yán)重流行的年份和地區(qū)，可以導(dǎo)致玉米減產(chǎn)50%，甚至更多。玉米小斑病是由子囊菌門(mén)旋孢腔菌屬異旋孢腔菌[CochliobolusheterostrophusDrechsler]所引起的溫暖潮濕玉米產(chǎn)區(qū)的重要葉部病害，主要危害葉片，也可危害葉鞘、苞葉、果穗和籽粒，是國(guó)內(nèi)外玉米上普遍發(fā)生的病害之一。據(jù)估計(jì)一般中等發(fā)病年份感病品種損失約10%20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)30%80%，甚至毀種絕收。目前，對(duì)玉米大、小斑病的防治主要是農(nóng)業(yè)防治和化學(xué)防治。農(nóng)業(yè)防治主要是通過(guò)栽培抗病品種，但一些品種很容易失去抗病性，所以完全通過(guò)抗病品種來(lái)實(shí)現(xiàn)防治病害有一定的難度?；瘜W(xué)藥劑防治雖然能有效的控制病害的發(fā)生和流行，但是長(zhǎng)期的使用會(huì)對(duì)非靶標(biāo)生物產(chǎn)生直接毒害，造成對(duì)環(huán)境污染，嚴(yán)重影響了人類(lèi)的健康和環(huán)境。因此，尋找新的無(wú)公害方法已成為當(dāng)務(wù)之急，生物防治方法將越來(lái)越受到重視。拮抗內(nèi)生細(xì)菌作為一種重要的生防菌，在植物病害生物防治中起著很重要的作用。其主要優(yōu)勢(shì)在于(l)細(xì)菌的種類(lèi)和數(shù)量眾多，在植物根際和地上部大量存在；(2)細(xì)菌對(duì)病原菌的作用方式較廣，可以通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)，拮抗和寄生，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等方式對(duì)病原菌產(chǎn)生影響；(3)具有驚人的繁殖速度；(4)許多細(xì)菌存在于植物根際和地上部，對(duì)植物的生態(tài)環(huán)境較適宜；(5)細(xì)菌大多可以通過(guò)人工培養(yǎng)，便于控制，在實(shí)踐中易操作；(6)有些細(xì)菌不僅能防治病害而且還可以產(chǎn)生增收效應(yīng)。因此，從甜玉米健康植株內(nèi)篩選獲得對(duì)玉米大、小斑病有拮抗作用的內(nèi)生生防細(xì)菌菌株，對(duì)于玉米大、小斑病的防治具有重要意義。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對(duì)玉米大、小斑病菌具有拮抗作用的銅綠假單胞菌D10，該菌株可以有效抑制玉米大、小斑病，對(duì)玉米大、小斑病的防治具有重要意義。本發(fā)明的另一目的在于提供上述銅綠假單胞菌D10的制備方法。本發(fā)明還有一個(gè)目的是提供上述銅綠假單胞菌D10在植物疾病防治中的應(yīng)用。本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明銅綠假單胞菌D10，PseudomonasaeruginosaD10，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNO:M209104。所述銅綠假單胞菌D10在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈棕色，圓形，有光澤，濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落直徑O.20.5cm，菌體成短桿狀，大小約為1.lOumXO.57um，無(wú)芽孢。所述銅綠假單胞菌D10具有以下生化特性對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用；其中，枯草芽孢桿菌A16還對(duì)玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。所述銅綠假單胞菌D10還具有固氮、促進(jìn)植物生長(zhǎng)、增強(qiáng)宿主抗逆性等生物學(xué)作用。本發(fā)明銅綠假單胞菌D10的制備包括如下步驟(1)剪取待分離的玉米組織，消毒后用1%NaClO處理，再用無(wú)菌水沖洗；(2)將經(jīng)過(guò)表面消毒的玉米組織加無(wú)菌水研磨，按照梯度濃度依次稀釋1X102、1X103、1X104倍，分別涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待平板長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、純化后得到銅綠假單胞菌DIO，4t:冰箱保存在NA斜面上。上述制備方法優(yōu)選為如下步驟(1)剪取待分離的玉米組織2g，75X酒精消毒3min后，用1%NaClO處理10min，再用無(wú)菌水沖洗4次，取最后一次沖洗液留做對(duì)照；(2)將經(jīng)過(guò)表面消毒的玉米組織加10mL無(wú)菌水置于滅菌的研缽中研磨至組織粉碎，靜置310min，按照梯度濃度依次稀釋1X102、1X103、1X104倍，分別吸取100yL涂布于NA平板上，置于28。C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待平板長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、反復(fù)純化后，得到枯草芽孢桿菌A16，4。C冰箱保存在NA斜面上。本發(fā)明銅綠假單胞菌D10用于促進(jìn)植物生長(zhǎng)和防治植物病害時(shí)，將該銅綠假單胞菌D10接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗后，可獲得對(duì)玉米大斑病、玉米小斑病和玉米彎孢葉斑病具有抗病力的玉米植株、對(duì)棉花黃萎病具有抗病力的棉花植株、對(duì)小麥霉菌病具有抗病力的小麥植株或?qū)ο憬短烤也『拖憬犊菸【哂锌共×Φ南憬吨仓?，且植株的生長(zhǎng)狀況得到顯著改善。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明銅綠假單胞菌D10為植物有益內(nèi)生細(xì)菌，對(duì)玉米大、小斑病菌的抑制作用強(qiáng)，對(duì)多種病原菌具有拮抗作用，抑菌譜廣，環(huán)境安全性好，可應(yīng)用于植物病害的生物防治中，尤其是對(duì)玉米大、小斑病的防治具有重要意義；本發(fā)明枯草芽孢桿菌A16的培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易保存，便于工業(yè)化生產(chǎn)，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。圖1為銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米小斑病菌菌絲的抑制作用；圖2為銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米大斑病菌菌絲的抑制作用；圖3為銅綠假單胞菌D10對(duì)棉花黃萎病菌、玉米彎孢葉斑病菌、小麥赤霉病菌和香蕉枯萎病菌的抑制作用，其中A為銅綠假單胞菌DIO對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用；B為銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的抑制作用；C為銅綠假單胞菌D10對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用；D為銅綠假單胞菌D10對(duì)香蕉枯萎病菌(F0C4)的抑制作用。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。實(shí)施例1銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米小斑病菌和玉米大斑病菌的平板拮抗作用銅綠假單胞菌D10經(jīng)平板對(duì)峙篩選獲得。在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA(其中加5g/L蛋白胨，pH值調(diào)節(jié)到6.5)平板中央接入直徑為5mm的玉米大、小斑病菌菌絲塊，隨后在每皿對(duì)稱(chēng)接上三片直徑為5mm的滅菌濾紙片，濾紙片中心距離中央菌絲塊為25mm，最后在每片濾紙片上接入細(xì)菌培養(yǎng)液10iiL，以不接銅綠假單胞菌培養(yǎng)液的平板為空白對(duì)照，三次重復(fù)，置于2『C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d后，測(cè)定抑菌圈半徑，由圖1可見(jiàn)銅綠假單胞菌D10顯著抑制玉米小斑病菌的生長(zhǎng)，由圖2可見(jiàn)銅綠假單胞菌DIO顯著抑制玉米大斑病菌的生長(zhǎng)。實(shí)施例2銅綠假單胞菌D10室內(nèi)防效測(cè)定將經(jīng)0.1%NaClO消毒后的甜玉米種子用拮抗菌株培養(yǎng)液(含菌量為1.2X109cfu/ml)浸種5h后，播于花盆中(泥土消毒)，每盆播種10粒種子，設(shè)無(wú)菌水浸種為對(duì)照。每處理播種10盆，長(zhǎng)至三葉一新時(shí)(21d左右)，噴玉米大、小斑病菌孢子懸浮液，接種后放置在溫室中培養(yǎng)，在接種病原菌后7d調(diào)查發(fā)病情況。結(jié)果顯示經(jīng)銅綠假單胞菌D10菌株處理過(guò)的玉米植株大、小斑病的病情指數(shù)分別比對(duì)照低了35.1、57.4。實(shí)施例3銅綠假單胞菌D10對(duì)多種病原菌的拮抗作用采用平板對(duì)峙法，測(cè)試銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌、香蕉枯萎病菌5種病原菌的拮抗作用。參照平板對(duì)峙法進(jìn)行篩選。在馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基PDA(其中加5g/L蛋白胨，pH值調(diào)節(jié)到6.5)平板中央接入直徑為5mm的病原菌菌絲塊，在距離病原菌兩側(cè)25mm處，用接種環(huán)劃線接種內(nèi)生細(xì)菌，以只接病原菌為對(duì)照，于28t:培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7d，測(cè)量抑菌帶寬度，每處理重復(fù)3次。結(jié)果見(jiàn)表l以及圖3。從圖3圖A中可看到銅綠假單胞菌D10對(duì)棉花黃萎病菌的抑制作用；B中可看到銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的抑制作用；C中可觀察到銅綠假單胞菌D10對(duì)小麥赤霉病菌的抑制作用；D中可觀察到銅綠假單胞菌D10對(duì)香蕉枯萎病菌4號(hào)小種(F0C4)的抑制作用。表1拮抗菌株對(duì)不同病原菌的抑制作用<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>"++"表示抑菌帶為68mm;"+++"表示抑菌帶為810mm;"++++"表示抑菌帶>10mm。權(quán)利要求一種銅綠假單胞菌D10，其特征在于所述銅綠假單胞菌D10，PseudomonasaeruginosaD10，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM209104。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌D10，其特征在于所述銅綠假單胞菌D10在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈棕色，圓形，有光澤，濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落直徑0.20.5cm，菌體成短桿狀，無(wú)芽孢。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌D10，其特征在于所述銅綠假單胞菌D10具有以下生化特性對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌有拮抗作用。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的銅綠假單胞菌D10，其特征在于所述銅綠假單胞菌D10對(duì)玉米大斑病菌和玉米小斑病菌有平板拮抗作用。5.權(quán)利要求1所述銅綠假單胞菌DIO的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)剪取待分離的玉米組織，消毒后用1%NaC10處理，再用無(wú)菌水沖洗；(2)將經(jīng)過(guò)表面消毒的玉米組織加無(wú)菌水研磨，按照梯度濃度依次稀釋1X102、1X103、1X104倍，分別涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待平板長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、純化后得到銅綠假單胞菌DIO，4t:冰箱保存在NA斜面上。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述銅綠假單胞菌D10的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)剪取待分離的玉米組織2g，75X酒精消毒3min后，用1%NaClO處理10min，再用無(wú)菌水沖洗4次，取最后一次沖洗液留做對(duì)照；(2)將經(jīng)過(guò)表面消毒的玉米組織加lOmL無(wú)菌水置于滅菌的研缽中研磨至組織粉碎，靜置310min，按照梯度濃度依次稀釋1X102、1X103、1X104倍，分別吸取100yL涂布于NA平板上，置于2『C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；(3)待平板長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)菌落的形態(tài)特征，挑取單個(gè)菌落，經(jīng)劃線、反復(fù)純化后，得到枯草芽孢桿菌A16，4。C冰箱保存在NA斜面上。7.權(quán)利要求1所述銅綠假單胞菌D10用于防治玉米大斑病、玉米小斑病、玉米彎孢葉斑病、棉花黃萎病、小麥霉菌病、香蕉炭疽病和香蕉枯萎病的用途。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于利用銅綠假單胞菌D10CCTCCNO.M209104接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗，獲得對(duì)玉米大斑病、玉米小斑病和玉米彎孢葉斑病具有抗病力的玉米植株、對(duì)棉花黃萎病具有抗病力的棉花植株、對(duì)小麥霉菌病具有抗病力的小麥植株或?qū)ο憬短烤也『拖憬犊菸【哂锌共×Φ南憬吨仓辍?.權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌D10用于玉米、棉花、小麥或香蕉促長(zhǎng)的用途。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于利用銅綠假單胞菌D10CCTCCN0.M209104接種于玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗，可以促進(jìn)玉米苗、棉花苗、小麥苗或香蕉苗的生長(zhǎng)。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種銅綠假單胞菌D10，PseudomonasaeruginosaD10，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCCNOM209104。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上菌落呈棕色，圓形，有光澤，濕潤(rùn)，邊緣整齊，菌落直徑0.2～0.5cm，菌體成短桿狀，無(wú)芽孢。本發(fā)明還公開(kāi)了上述銅綠假單胞菌D10的制備方法與用途。本發(fā)明銅綠假單胞菌D10抑菌譜廣，可抑制玉米大、小斑病，對(duì)玉米大斑病菌、玉米小斑病菌、玉米彎孢葉斑病菌、棉花黃萎病菌、小麥赤霉病菌、香蕉炭疽病菌和香蕉枯萎病菌也均有較強(qiáng)的拮抗作用，防治效率高，環(huán)境安全性好，具有良好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。文檔編號(hào)A01P3/00GK101698828SQ20091019292公開(kāi)日2010年4月28日申請(qǐng)日期2009年9月30日優(yōu)先權(quán)日2009年9月30日發(fā)明者徐立新,王振中,董章勇申請(qǐng)人:華南農(nóng)業(yè)大學(xué)