專利名稱：：一種肝保存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種器官保存液，特別涉及一種肝保存液，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：隨著肝移植普遍丌展，供體來源短缺與等待肝移植患者數(shù)量激增的矛盾R益明顯。供體的缺乏需要移植器官的合理分配，為了充分利用每一例供體的器官，經(jīng)常需要長途運送，這樣移植器官冷保存時間逐漸延長，冷保存再灌注損傷閂益嚴重。盡管器官保存技術(shù)已經(jīng)很好的發(fā)展，但據(jù)國外權(quán)威機構(gòu)統(tǒng)計，仍有4%供肝、供腎由于種種因素而廢棄，肝移植后早期無功能(PNF)，大約占5—10%，肝移植后早期功能差(IPF)大約占15—25X，延遲的肝功能恢復(IGF)大約占670X，因而目前仍有許多學者致力于器官保存的研究。20世紀50年代，兩大成就掀起了器官移植的序幕。其一是Murray等用同卵雙生的供腎進行腎移植獲得成功；其二是Medawar等闡明了移植物排斥反應(yīng)的免疫基礎(chǔ)。隨后器官移植普遍開展，自二十世紀八十年代以來，肝移植是目前治療終末期肝病的唯一有效手段。隨著手術(shù)技巧的不斷提高、新型免疫制劑和，保存液的相繼問世，臨床肝移植進入了快速發(fā)展時期。2000年，僅美國就完成了肝移植5000余例。但隨著肝移植普遍丌展，供體來源短缺與等待肝移植患者數(shù)量激增的矛盾R益明顯。供體的缺乏需要移植器官的合理分配，為了充分利用每一例供體的器官，經(jīng)常需要長途運送，這樣移植器官冷保存時間逐漸延長，冷保存再灌注損傷日益嚴重。根據(jù)UNOS最新發(fā)布的，近萬例肝移植回顧性調(diào)査資料表明，影響肝移植存活率(graftsurvival)最重要的因素是供體年齡、熱缺血時間和冷保存時間。研究還表明，移植肝冷保存再灌注損傷與移植術(shù)后原發(fā)性移植肝臟無功能及晚期慢性移植物功能喪失密切相關(guān)。因此，如何防治移植肝冷保存再灌注損傷正成為研究的熱點。可供移植的人體器官不足，一直是困擾移植界的難題，于是在肝臟臨床解剖學和手術(shù)技術(shù)發(fā)展的基礎(chǔ)上，出現(xiàn)了利用供肝的各種手術(shù)方式。減體積肝移植、劈離式肝移植和活體肝移植手術(shù)方式的開展，雖解決了一部分供肝短缺的問題，但在技術(shù)上不斷加大難度的同時，也提出了一些新的問題。如冷保存時間延長供肝、脂肪變性供肝、小體積供肝與老年性供肝等，開展移植肝功能保護和提升試驗研究，拓展邊緣性供肝的臨床應(yīng)用，提高移植療效，具有重要的現(xiàn)實意義。針對冷保存與缺血再灌注損傷開展供肝的保護性研究是肝臟移植領(lǐng)域的一個重要課題。供肝在切除、保存、植入等過程中，不可避免地要經(jīng)歷缺血再灌注過程，冷、熱缺血/再灌注勢必引起供肝細胞ATP儲備耗竭，并產(chǎn)生大量的氧自由基和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，造成肝細胞損傷甚至肝功能障礙。由于我國區(qū)域器官分配網(wǎng)絡(luò)尚不健全，供肝延遲獲得性比例較高，冷缺血時間較長，供肝質(zhì)量受到嚴重影響，增加了移植后肝功能恢復不良和原發(fā)性移植肝無功能發(fā)生的危險性。為使供肝得到合理分配及利用，防護肝臟缺血再灌注損傷，延長供肝保存時間顯得十分重要。迄今，人們對肝缺血再灌注損傷的確切機制尚缺乏完整認識。N0與肝臟缺血/再灌注損傷的關(guān)系是研究的焦點問題?；蛑委煹拈_展和中草藥的不斷挖掘為供肝保護性研究提供了豐富多彩的手段。長期以來，人們研究發(fā)現(xiàn)肝臟缺血再灌注損傷機制主要包括肝細胞內(nèi)Ca2+超載和大量氧自由基的生成，因此臨床防治肝臟缺血再灌注損傷的研究多側(cè)重于抗氧化治療。最近，炎癥損傷因子網(wǎng)絡(luò)在肝臟缺血再灌注損傷中的作用已受到充分的肯定，其中枯否氏細胞即或及釋放TNF-a等損傷因子、中性粒細胞的聚集和粘附、肝竇內(nèi)皮細胞的損傷及肝竇微循環(huán)的改變等更是研究的熱點。因此針對上述再灌注損傷機制的防治措施正得到廣泛的關(guān)注。肝移植過程中肝臟冷保存再灌注損傷不可避免，該過程以缺血、缺氧、能量供應(yīng)中斷為始動因素，經(jīng)細胞內(nèi)鈣超載、氧自由基形成及白細胞浸潤三個重要環(huán)節(jié)，通過細胞因子炎性損傷介質(zhì)的釋放，不但對移植肝臟造成損傷，而且對全身其他器官也可造成一定的傷害。缺血再灌注時鈣超載途徑主要有以下幾個方面NaVCa2+交換增加缺血時細胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少，化+-1(+^1酶活性降低，導致細胞內(nèi)Na+濃度增高，從而激活細胞膜上的1^7(^2+交換蛋白，Na7C,交換增加，引起細胞內(nèi)鈣超載;Ca"被動擴散增加缺血缺氧可引起細胞膜通透性增加，再灌注時Ca2+通過被動擴散進入細胞增多。電鏡下，Cr3+、La3+等細胞膜通透性標志物在轉(zhuǎn)超負荷時均不能自由地進入細胞，說明被動滲透不是鈣內(nèi)流的主要途徑；質(zhì)膜Ca"泵排Ca2+能力減弱鈣泵(即Ca2+-ATP酶)是鈣外流的主要機制，而鈣過程是耗能的主動轉(zhuǎn)運過程，在缺血缺氧時線粒體ATP生成減少，Ca2+泵排Ca2+能力減弱，至胞漿內(nèi)鈣超載。嚴重的細胞內(nèi)超載可以激活Ca2+依賴蛋白酶，促使細胞內(nèi)許多重要的酶(如腺氨酸環(huán)化酶等)降解，導致細胞損傷；同時Ca2+激活Ca2+依賴磷脂酶，促進脂質(zhì)分解，破壞細胞膜結(jié)構(gòu)，促進胞膜泡形成，而胞膜泡形成和破裂是肝細胞致死性損傷的普遍特征。缺血再灌注均可產(chǎn)生較多的超氧化物，引起組織損傷；線粒體是肝臟缺血再灌注期間活性氧產(chǎn)生的重要器官。肝臟在缺血再灌注過程中，可通過黃嘌呤氧化酶途徑和中性粒細胞呼吸爆發(fā)產(chǎn)生大量氧自由基。由于在灌注過程中，抗氧化酶活性受到抑制，造成大量氧自由基在肝組織中聚集。肝組織中聚集的氧自由基可以通過與細胞膜表明多不飽和脂肪酸結(jié)合，產(chǎn)生多脂肪酸過氧基。這些過氧基可以通過電子傳遞的級聯(lián)放大效應(yīng)與蛋白質(zhì)、脂肪和核酸等物質(zhì)反應(yīng)，導致這些結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)過氧化物化(LipidPeroxides,LPO)而氧化失活，引起細胞膜通透性增加直至細胞溶解死亡。LPO的代謝終產(chǎn)物為丙二醛MDA，MDA的含量能較好地反映體內(nèi)氧自由基水平及脂質(zhì)過氧化物損傷的程度，而超氧化物歧化酶(SOD)含量的高低能反映機體抗氧化的能力。細胞凋亡是一種由特定基因控制，以細胞DNA降解為特征，無明顯細胞溶解的程序性細胞死亡過程。細胞凋亡則不同于壞死，壞死是以細胞膜的損害為起點，常伴有死亡細胞內(nèi)容物釋放而產(chǎn)生炎癥，其性質(zhì)為病理性細胞死亡。而凋亡細胞的細胞膜則功能完整并包裹細胞內(nèi)容物形成凋亡小體，可被體內(nèi)其它細胞吞噬，通常無細胞內(nèi)容物的泄漏因而不伴有炎癥，其性質(zhì)為生理性細胞死亡。在形態(tài)上，凋亡細胞呈胞核皺縮，核染色質(zhì)廣泛濃縮、邊集，胞質(zhì)濃縮但細胞器仍保持結(jié)構(gòu)完整，細胞膜形成多個芽突，隨后分裂為一個或多個有生物膜包被的特征性凋亡小體。各種損傷因素可以通過鈣離子大量內(nèi)流，引發(fā)線粒體膜通透性增加和功能喪失，使其釋放細胞色素C而最終導致細胞凋亡。細胞凋亡是肝細胞的死亡方式之一，過度凋亡可引起肝功能損害。多年來，用于檢測凋亡細胞的主要手段有DNA電泳法、流式細胞儀法以及光鏡與電鏡方法等。但這些方法或不能定位或觀察范圍大小，而難以準確地反映細胞凋亡的現(xiàn)象。針對于此，1992年，Gavrieli等建立了TUNEL方法檢測凋亡細胞的新途徑。此種方法能結(jié)構(gòu)完好地原位顯示凋亡細胞，并能進行陽性細胞計數(shù)。盡管目前已有一些研究發(fā)現(xiàn)，少數(shù)壞死細胞晚期DNA也會發(fā)生非特異性分解而產(chǎn)生一定量的DNA片段，并可在TUNEL染色中著色，但壞死細胞DNA裂解發(fā)生在晚期，分解的DNA片段可進入胞漿，胞核及胞漿均可顯色，據(jù)此可與凋亡細胞鑒別。細胞凋亡受基因調(diào)控，目前作用較明確的基因有Bc1-2、Fas/FasL等。Bcl-2是一種膜整合蛋白，存在于線粒體、核膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，能防止多種原因引起的凋亡。其抗凋亡的作用途徑包括減少磷脂酰絲氨酸生成、減輕脂質(zhì)過氧化、抑制過氧化物生成、增加過氧化氫酶和SOD活性、抑制半胱氨酸蛋白酶(Caspase)酶3和6、阻止鈣離子內(nèi)流、抑制線粒體跨膜電位破壞和阻止細胞色素C外流等。Bilbao等研究發(fā)現(xiàn)在缺血期通過腺病毒載體將Bcl-2基因轉(zhuǎn)染給供肝可明顯減輕再灌注后肝細胞的凋亡和壞死，并可減少移植術(shù)后原發(fā)性移植肝無功能的發(fā)生率。Fas/FasL是介導凋亡的細胞表面分子，其機制可能是Fas與其配體FasL結(jié)合從而轉(zhuǎn)導凋亡信號進入靶細胞并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘導細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿治療組并不能顯著降低FasL蛋白的表達，這就提示苦參堿抑制肝細胞凋亡與FasL蛋白表達無明顯關(guān)系。Yamaraoto等認為Fas/FasL基因主要參與免疫排斥反應(yīng)中的肝細胞凋亡?？莘袷霞毎几闻K非實質(zhì)細胞數(shù)量的35%，其主要作用包括吞噬(如細菌、內(nèi)毒素、病毒和免疫復合物等)，誘導非特異性免疫反應(yīng)，抗原呈遞和釋放多種細胞毒性產(chǎn)物如細胞因子(TNF-ci，干擾素等)、一氧化氮、白三烯和蛋白酶類。在供肝冷保存期，由于肝臟處于低溫、低氧狀態(tài)，導致線粒體受損，能量代謝降低，ATP合成減少、分解增加，導致Ca2+內(nèi)流增加，致細胞內(nèi)鈣超載；枯否氏細胞處于"預(yù)"激活狀態(tài)。同時受體肝移植手術(shù)時，須行門靜脈阻斷，導致腸淤血，腸粘膜屏障受損，腸壁通透性增加，從而促使腸管內(nèi)細菌內(nèi)毒素進入門靜脈系統(tǒng)。因此在門靜脈血流重新開放，進入再灌注期，門靜脈血中的內(nèi)毒素迅速與脂多糖蛋白結(jié)合后，被枯否氏細胞俘獲?？墒挂烟幱?預(yù)"激活專題的枯否氏細胞完全激活。激活的枯否氏細胞表現(xiàn)為胞體增大，細胞表面皺縮，突起增多、變圓，胞漿空泡化和脫顆粒，胞內(nèi)出現(xiàn)大量的吞噬溶酶體和空泡。枯否氏細胞激活后吞噬功能增強，并且產(chǎn)生許多生物活性物質(zhì)，如氧自由基、蛋白水解酶和多種促炎性損傷因子(如TNF-ci、PAF、LT等)。這些活性物質(zhì)協(xié)同作用，損傷肝竇內(nèi)皮細胞和肝細胞，引起移植肝再灌注損傷，最終可導致原發(fā)性移植肝無功能?？莘袷霞毎せ詈螅尫糯罅縏NF-a，其在肝臟損傷過程中起著重要介導作用。TNF-a對肝細胞有直接毒性作用，可導致肝細胞壞死和細胞內(nèi)酶的釋放。TNF-a作用于肝竇內(nèi)皮細胞，使其上調(diào)粘附分子ICAM-1和VCAM-1，同時刺激白細胞表達CR1和CR2類趨化因子，增加白細胞與肝竇內(nèi)皮細胞的粘附，導致肝竇微循環(huán)的障礙。此外，TNF-a可以直接刺激白細胞釋放氧自由基，并進一步促進枯否氏細胞產(chǎn)生過氧化物，及釋放IL-1、IL-6、IL-8等炎性損傷因子，同時激活磷脂酶A2，通過加速花生四烯酸的代謝，釋放TXA2等途徑加重缺血再灌注局部和全身的組織損傷。Arrii等的臨床研究發(fā)現(xiàn)，在人類肝移植過程中，應(yīng)用抗TNF-a單克隆抗體可顯著減輕肝竇內(nèi)皮細胞的損傷，改善肝功能，提高移植肝的存活率有關(guān)肝移植冷保存再灌注損傷機理的研究很多，其中微循環(huán)再灌注障礙日益受到重視。其發(fā)生的主要原因有(1)肝血竇內(nèi)皮細胞對冷、熱缺血均比肝細胞敏感，早期即可能出現(xiàn)不可逆損傷，同樣，在再灌注期內(nèi)皮細胞比肝細胞早發(fā)生致死性損傷，再灌注后內(nèi)皮細胞出現(xiàn)腫脹、死亡及脫落，阻塞血竇；(2)再灌注后粒細胞粘附、聚積及毒性作用；(3)血小板激活因子大量生成，內(nèi)皮細胞脫落后其下組織暴露引起血小板粘附，血管內(nèi)凝血，產(chǎn)生血栓；(4)內(nèi)皮素大量生成，而N0產(chǎn)生減少，使SEC收縮，循環(huán)阻力增加。肝血竇內(nèi)皮細胞損傷及順應(yīng)性改變可致肝血竇阻塞，再灌注障礙，從而使肝組織細胞仍處于缺血狀態(tài)，損傷進一步加重發(fā)展。因此，在肝移植缺血再灌注損傷過程中，保護內(nèi)皮細胞和保護肝細胞同樣重要，這對于移植肝臟微循環(huán)障礙，術(shù)后發(fā)生"無復流"等現(xiàn)象，繼而導致原發(fā)性移植肝無功能的預(yù)防具有重要臨床意義。HA是一類氨基葡聚糖，它由體內(nèi)的間質(zhì)細胞產(chǎn)生后，經(jīng)淋巴途徑到達肝臟。而SEC上有HA特異性的受體，可通過胞吞方式攝取和降解HA。故當SEC損傷時，其對內(nèi)源性HA攝取量降低，血清HA濃度也就相應(yīng)上升。1987年，F(xiàn)olkert0.Belzer博士領(lǐng)導的美國WISCONSIN大學實驗小組成功研制了一種低溫保存液-UW液，極大地延長了肝臟、腎臟、胰腺、心臟、肺和小腸等器官的保存時間，推動了世界器官移植的快速發(fā)展。UW液的成分是經(jīng)乙基淀粉50克/升、乳酸(內(nèi)酯)35.83克/升、KH2P043.4克/升、MgSO,,.7H201.23克/升、棉子糖17.83克/升、腺苷1.34克/升、別嘌呤醇0.136克/升、總谷胱甘肽0.922克/升、K0H5.61克/升、pH為7.4胰島素40單位、青霉素G20萬單位、地塞米松16mg。UW液的特點有(1)不使用代謝活躍的葡萄糖來維持滲透壓，而用乳糖醛酸鹽作為非滲透陰離子，并用棉子糖作為附加的滲透支持，用來預(yù)防因體溫過低而引發(fā)的細胞水腫；(2)用谷胱甘肽、別嘌呤醇對抗氧自由基；(3)含有腺苷，可刺激ATP合成，支持能量代謝；(4)含經(jīng)乙基淀粉(250KU)，用來防止細胞間隙膨脹和維持膠體滲透壓；(5)以磷酸鹽系統(tǒng)防止細胞酵中毒。臨床證實UW液可顯著延長器官體外活性，由此增加了可供移植的器官數(shù)量。目前，UW液及其各種UW型改良液已在國際上日益廣泛應(yīng)用。但是目前此類保存液處方復雜，對保存液的生產(chǎn)和質(zhì)量控制帶來非常繁瑣的工作量。而且成品不利于終端消費者，因為繁瑣的配置過程和質(zhì)量控制，耗費大量資源同時，必定帶來高昂的費用，增加患者負擔。國內(nèi)對肝移植缺血再灌注損傷的保護方面做了大量研究工作，從我國器官保存來說，我們尚缺乏國際上已廣泛應(yīng)用的類似UW、HTK這樣的能保存多臟器的長效器官保存液，這將是限制我國器官移植工作進一步發(fā)展的因素。因此，器官保存工作仍需加倍努力，爭取研制處方盡可能簡單而且有高效、高質(zhì)量的長效器官保存液。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本發(fā)明的目的是提供一種肝保護液，能有效的保護移植肝臟，又處方相對簡單的肝保存液，為臨床肝移植提供又一個良好保證。技術(shù)方案目前，國內(nèi)已有學者參考國外文獻，在HCA保存液中添加鈣離子拮抗劑一異搏定，自由基清除劑一別嘌呤醇、谷胱甘肽等。但有關(guān)花生四烯酸代謝抑制劑的應(yīng)用未見報告。發(fā)明人認為從保存液添加劑來說，祖國的傳統(tǒng)醫(yī)學應(yīng)有一定的優(yōu)勢。本發(fā)明提供了一種肝保存液，每100ml該肝保存液含有1,6-二磷酸果糖78g，谷胱苷肽l2g，別嘌呤醇23g，中藥成分川芎嗪0.30.5g，中藥成分山莨菪堿812mg，林格氏液加至100毫升。該肝保存液還可以含有維生素E;每100ml該肝保存液含有維生素E0.20.4g。該肝保存液還可以含有青霉素；每lOOinl該肝保存液含有青霉素6001000萬單位。該肝保存液還可以根據(jù)需要，加入其他傳統(tǒng)中藥成分，如丹-參提取物等。有益效果本發(fā)明公丌的肝保存液，與空白對照組有統(tǒng)計學意義，兩治療組(本發(fā)明組與美國UW液治療組)沒有統(tǒng)計學意義。為長效器官保存又提供了一個非常好的保證。山莨菪堿(Anisodamine)是我國科研人員從茄科植物唐古特莨菪中提取的生物堿，也稱654，其人工合成品稱654-2。山莨菪堿能對抗乙酰膽堿所致平滑肌痙攣和抑制心血管的作用，同時能解除血管痙攣，改善微循環(huán)，己被廣泛用于防止休克。川芎嗪(LigusticumWallichiiFranch)據(jù)中醫(yī)記載，川芎的基本作用為活血化瘀行氣，藥理學研究則表明，川芎嗪可擴張血管改善微循環(huán)，保護腎功能作用。自1981年起馬永江等對川芎防治急性腎衰進行了一系列實驗研究和初歩臨床應(yīng)用，證明川芎優(yōu)于一般血管擴張劑，并具有鈣離子拮抗劑作用，能保護腎臟的能量供應(yīng)，并有利于清除代謝產(chǎn)物。而且，本發(fā)明肝保存液處方簡單，為生產(chǎn)和臨床節(jié)約了生產(chǎn)和檢驗成本。具體實施例方式以下實施例只是用來說明本發(fā)明的方法，而不限制本發(fā)明的范圍。1、肝保存液的配置每100ml該肝保存液含有1，6-二磷酸果糖78g，谷胱苷肽12g，別嘌呤醇23g，中藥成分川芎嗪0.30.5g，中藥成分山莨菪堿812mg，林格氏液加至100毫升。治療組Zw肝保存液(本發(fā)明肝保存液)成份與含量1，6-二磷酸果糖7.5g、谷胱苷肽1.5g、別嘌呤醇2.5g、川芎嗪0.4g、山莨菪堿10mg。按處方稱量，用林格氏液溶解至100ml過濾即得。治療組Uw液市場購買。實驗對照液林格氏液。2、為探討ZW肝保護液對供肝冷保存再灌注損傷的保護作用，本實驗采用供肝保存12小時后，大鼠原位肝移植冷保存再灌注損傷模型。分為A組(實驗對照組)；B組(UW液治療組)；C組(ZW肝保護液治療組)。每組在術(shù)后規(guī)定時間點(4、7d)斷尾獲取外周血，第14d犧牲動物獲取外周血和肝臟檢測肝功能；TNF-a活性；內(nèi)毒素；血清透明質(zhì)酸；血N02-/N03-;肝臟病理；肝細胞超微結(jié)構(gòu)；肝臟MDA和SOD;肝臟ATP酶；肝臟細胞原位凋亡(TUNEL)的免疫組化檢測；肝組織細胞間粘附分子-1(ICAM-1)表達的免疫組化檢測。三組間的ALT相比較(P<0.05)有統(tǒng)計學意義；三組間的AST相比較(P<0.05)有統(tǒng)計學意義；三組間的LDH相比較(P<0.05)有統(tǒng)計學意義。與實驗對照組各個時間點的血清TNF-a活性相比較，均下降，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清TNF-a活性相比較無有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。兩組治療組移植術(shù)后4d血中內(nèi)毒素達到高峰，與實驗對照組各個時間點的血中內(nèi)毒素相比較，均下降，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血中內(nèi)毒素相比較無統(tǒng)計學意義(p〉0.05)。兩組治療組移植術(shù)后7d血清HA值達到高峰，與實驗對照組各個時間點的血清HA值相比較，均下降，(P〈0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清TNF-a活性相比較無有統(tǒng)計學意義(P〉0.05)。兩組治療組移植術(shù)后4d血清N02-/N03-值均下降，但與實驗對照組各個時間點的血清HA值相比較，均上升，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清N02-/N03-值相比較無有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。UW液和ZW液治療組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞輕度空泡變性，匯管區(qū)炎性細胞浸潤少，肝竇擴張，肝竇內(nèi)皮細胞扁平，基本完整，兩治療組肝臟病理變化程度類似。兩組治療組肝細胞核圓居中，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，肝竇內(nèi)皮細胞基本完整，未見明顯腫脹。與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后MdMDA值增高(p〈0.05)，而兩治療組間比較無顯著差異，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14dS0D值下降(p〈0.05)，而兩治療組間比較無顯著差異。UW液和ZW液治療組和對照組移植術(shù)后14dNa+-K+-ATPase和Ca、ATPas值均下降，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14dNa+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值下降(p〈0.05)，而兩治療組間比較無顯著差異。Zw肝保存液、Uw液、對照液進行試驗，實驗數(shù)據(jù)及結(jié)果如下(1).血清ALT、AST、LDH由表1可見，三組間的ALT相比較，F(xiàn)二10.46(P<0.05)有統(tǒng)計學意義；三組間的AST相比較，F(xiàn)=32.73(P〈0.05)有統(tǒng)計學意義；三組間的LDH相比較，F(xiàn)=95.42(P〈0.05)有統(tǒng)計學意義。表1三組大鼠原位肝移植術(shù)后，4、7、14天的ALT的變化氺(n=6,p<0.05，JT士s,U/L)DIGP0D4P0D7POD14A770.17±37.58690±51.00599.83±15.63B736.17±129.09591.17±92.19434.33±53.18C709±85.13583.54±6.57494.17±61.54注*F=10.46(p〈0.01)，A，B，C比較，有統(tǒng)計學意義(p<0.05)①PODn表示術(shù)后天數(shù)②DIG(divideintogroups)表示術(shù)后分組(下同)表2三組大鼠原位肝移植術(shù)后，4、7、14天的AST的變化"『6,p〈0.05,7±s,U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*F=95.42(p〈0.05),A，B，C比較，有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(2).TNF-a活性測定實驗對照組血清TNF-a活性在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(8.14±0.57U/L),移植術(shù)后7d上升達到(9.87±0.47U/L)高峰，移植術(shù)后14d又至(4.11±0,35U/L)水平；UW液治療組血清TNF-a活性在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(3.04±0.37U/L)，移植術(shù)后7d上升達到(1.77±0.27U/L)高峰，移植術(shù)后14d又至(1.02±0.23U/L)水平；ZW肝保存液治療組血清TNF-a活性在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(3.54±0.43U/L)，移植術(shù)后7d上升達到(2.01±0.11U/L)高峰，移植術(shù)后14d又降至(1.32±0.43U/L)水平。兩組治療組移植術(shù)后4d血清TNF-a活性達到高峰，與實驗對照組各個時間點的血清TNF-a活性相比較，均下降，(P〈0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清TNF-a活性相比較無有統(tǒng)計學意義(P〈0.05)'見表4。表4各組大鼠原位肝移植術(shù)后4d、7d、14d的血清TNF-a活性變化*(n=6，p<0.05，X±s，U/L)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注*F=7.86(p〈0.05),A，B，C比較，有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(3).內(nèi)毒素測定實驗對照組血中內(nèi)毒素在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(0.94±0.17EU/ml)高峰，移植術(shù)后7d上升到(0.81±0.21EU/ml)，移植術(shù)后14d又降至(0.41±0.55EU/ml)水平；UW液治療組血中內(nèi)毒素在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(0.64±0.23EU/ml)，移植術(shù)后7d上升達到(0.27±0.17EU/ml)高峰，移植術(shù)后14d又至(0.22±0.43EU/ml)水平；ZW液治療組血中內(nèi)毒素在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(0.54±0.63EU/ml)，移植術(shù)后7d上升達到(0.51±0.51EU/ml)高峰，移植術(shù)后14d又至(0.32±0.23EU/ml)水平。兩組治療組移植術(shù)后4d血中內(nèi)毒素達到高峰，與實驗對照組各個時間點的血中內(nèi)毒素相比較，均下降，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血中內(nèi)毒素相比較無統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表5。表5各組大鼠原位肝移植術(shù)后4d、7d、14d的血中內(nèi)毒素變化傘(n=6,p〈0.05,X±s,EU/ml)DIGP0D4P0D7POD14A0.94±0.170.81±0.210.41±0.25B0.64±0.230.27±0.170.22±0.13C0.54±0.330.51±0.210.32±0.13注*F=8.14(p<0.05)，A,B，D比較,有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(4).血清透明質(zhì)酸(HyaluronicAcid，HA)測定實驗對照組血清HA值在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(1518.14±100.57ng/ml)，移植術(shù)后7d上升達到(1819.87±120.47ng/ml)高峰，移植術(shù)后14d又至(1664.11±114.35ng/ml)水平；UW液治療組血清HA值在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(1003.04±111.37ng/ml)，移植術(shù)后7d上升達到(1441.77±113.27ng/ml)高峰，移植術(shù)后14d又至(1121.02±121.23ng/ml)水平；ZW液治療組血清HA值在鼠肝移植術(shù)后4d快速上升到(1073.54±97.43ng/ml)，移植術(shù)后7d上升達到(1312.01±100.11ng/ml)高峰，移植術(shù)后14d又降至(1111.32±120.43ng/ml)水平。兩組治療組移植術(shù)后7d血清HA值達到高峰，與實驗對照組各個時間點的血清HA值相比較，均下降，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清TNF-a活性相比較無有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表6。表6各組大鼠原位肝移植術(shù)后4d、7d、14d的血中HA的變化本(n=6，p<0.05，亍士s,ng/ml)DIGPOD4P0D7P0D14A1518.14±100.571819.87±120.471664.11±114.35B1003.04±111.371441.77±113.271121.02±121.23C1073.54±97.431312.01±100.111111.32±120.43注*F=38.24(p<0.01)，A,B，D比較，有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(5).血N0VN(T測定實驗對照組血清N02—/NCT值在鼠肝移植術(shù)后4d快速下降到(28.0±2.lumol/L)，移植術(shù)后7d下降達到(19.8±4.7uraol/L)高峰，移植術(shù)后14d又升至(34.1±3.5umol/L)水平;UW液治療組血清NO'VN(T值在鼠肝移植術(shù)后4d快速下降到(33.4±3.7umol/L)，移植術(shù)后7d上升達到(41.7±2.7umol/L)，移植術(shù)后14d又升至(61.2±2.3umol/L)水平；ZW液治療組血清N0VN0'-值在鼠肝移植術(shù)后4d快速下降到(35.4±4.3畫1/L)，移植術(shù)后7d上升達到(52.l士l.lumol/L)，移植術(shù)后14d又升降至(63.2±4.3umol/L)水平。兩組治療組移植術(shù)后4d血清N(T/N(T值均下降，但與實驗對照組各個時間點的血清HA值相比較，均上升，(P<0.05)有統(tǒng)計學意義，兩組治療組術(shù)后血清NOVN(T值相比較無有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表7。表7各組大鼠原位肝移植術(shù)后4d、7d、14d的血中N02/N03變化Wr^6,p〈0.05，X±s,umol/L)DIGPOD4P0D7POD14A28.0±2,119.8±4.734.1±3.5B33.4±3.741.7±2.761.2±2.3C35.4±4.352.1±1.163.2±4.3注*f=9.44(p<0.05)，A，B，D比較，有統(tǒng)計學意義(p<0.05)(6).肝臟病理檢測移植術(shù)后14d肝臟病理檢測，與W液和ZW液治療組相比較，實驗對照組肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細胞腫脹，空泡變性，偶見以小葉中央靜脈為中心的灶狀凝固性壞死，匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤，肝竇內(nèi)皮細胞受損腫脹，脫落入肝竇，kupffer細胞肥大，呈三角形或不規(guī)則形。UW液和ZW液治療組肝小葉結(jié)構(gòu)基本正常，肝細胞輕度空泡變性，匯管區(qū)炎性細胞浸潤少，肝竇擴張，肝竇內(nèi)皮細胞扁平，基本完整，兩治療組肝臟病理變化程度類似。(7).肝細胞超微結(jié)構(gòu)觀察移植術(shù)后14d電鏡觀察與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組肝細胞核皺縮，染色質(zhì)濃集，線粒體腫脹，嵴結(jié)構(gòu)不清，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴大成指狀，kupffer細胞明顯活躍，肝竇內(nèi)皮細胞不連續(xù)，高度腫脹；治療組肝細胞核圓居中，線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)清晰，肝竇內(nèi)皮細胞基本完整，未見明顯腫脹；枯否氏細胞超微結(jié)構(gòu)觀察實驗對照組可見枯否氏細胞高度活躍，細胞突起增多，胞漿增寬，胞漿內(nèi)可見許多吞噬溶酶體、透明的空泡和顆粒，細胞核形態(tài)不規(guī)則。UW液治療組可見枯否氏細胞呈圓形，突起減少，細胞核規(guī)則，胞漿內(nèi)容物減少。ZW液治療組枯否氏細胞超微結(jié)構(gòu)改變與UW液治療組相似；枯否氏細胞超微結(jié)構(gòu)觀察實驗對照組，SEC明顯腫脹，核酸不規(guī)整，可見核固縮、聚集、著邊的凋亡SEC，線粒體水腫、部分空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，可見髓鞘樣結(jié)構(gòu)。包膜部分斷裂，失去胞突，內(nèi)皮細胞向血竇腔內(nèi)突出，并可脫落入肝血竇腔內(nèi)。血竇腔內(nèi)可見大量中性粒細胞、淋巴細胞等浸潤。ZW液治療組，SEC核膜稍顯不規(guī)整，伸展部變薄，但覆蓋完整。內(nèi)皮細胞輕度水腫，溶酶體增多，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)無擴張，吞飲小泡豐富，SEC損傷明顯減輕。血竇腔內(nèi)炎性細胞浸潤的程度和范圍也明顯輕于對照組。UW液治療組，SEC損傷仍存在，其超微結(jié)構(gòu)改變與ZW液治療組類似。(8).肝臟MDA和SOD的檢測肝組織MDA測定實驗對照組肝組織中MDA在鼠肝移植術(shù)后14d上升至(n=6，I±s,3.94±0.17nmol/mgprot);UW液治療組肝組織中MDA在鼠肝移植術(shù)后14d上升至(n=6，X±s，L64±0.23nmol/mgprot);ZW液治療組肝組織中MDA在鼠肝移植術(shù)后14d上升至(n=6，J±s，1.54±0.63nmol/mgprot)，UW液和ZW液治療組和對照組移植術(shù)后14dMDA值均增高，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14dMDA值增高(p<0.01)，而兩治療組間比較無顯著差異，見表8。表8各組大鼠原位肝移植術(shù)后14肝組織中MDA變化(JT±s)DIGnMDA(nmol/mgprot)A63.94±0.17B61,64±0.23C61.54±0.63注A組與B、C組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，B、C之間無顯著差異。肝組織SOD測定實驗對照組肝組織中SOD在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6,±s,14.34±0.21U/mgprot);UW液治療組肝組織中SOD在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6,Z±s,21.17±0.25U/mgprot);ZW液治療組肝組織中SOD在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6，I±s，23.05±0.43U/mgprot)，UW液和ZW液治療組和對照組移植術(shù)后各14dSOD值均下降，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14dSOD值下降(p〈0.05)，而兩治療組間比較無顯著差異，見表9。表9各組大鼠原位肝移植術(shù)后i4肝組織中sod變化(；r±s)DIGnSOD(U/mgprot)A614.34±0.21B621.17±0.25C623.05土0.43注A組與B、C組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)，B、C之間無顯著差異。(9).肝臟ATP酶的測定肝組織ATP酶測定實驗對照組肝組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6,X±s，2.134±0.121umol/mgprot和3.012±0.lllumol/mgprot);UW液治療組肝組織中Na+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6，I±s,3.117±0.151umol/mgprot和4.917±0.171umol/mgprot);ZW液治療組肝組織中Na+-K+-ATPase和Ca2'-ATPas值在鼠肝移植術(shù)后14d下降至(n=6，I±s,3.213±0.145umol/mgprot和4.777±0.151umol/mgprot)，UW液和ZW液治療組和對照組移植術(shù)后14dNa+-K+-ATPase和Ca2+-ATPas值均下降，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14dNa+-K+-ATPase和0&2+4133值下降(p<0.05)，而兩治療組間比較無顯著差異，見表3-10，3-11。兩治療組凋亡的肝細胞明顯減少，其AI均顯著降低(p〈0.05)，而兩治療組AI相比無顯著差異。表10各組大鼠原位肝移植術(shù)后14肝組織中Na-K'-ATPase變化(f±s)DIGnNa+-K+-ATPase(mol/mgprot)A6B6C62.134±0.1213.117±0.1513.213±0.145::A組與B、C組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，B、C之間無顯著差異。表11各組大鼠原位肝移植術(shù)后14肝組織中Ca2-ATPas變化(了±s)DIGnNa+-K+-ATPase(mol/mgprot)A*6B6C63.012±0.Ill4.917±0.1714.777±0.151注A組與B、C組比較有統(tǒng)計學差異(p〈0.05),B、C之間無顯著差異。(10).肝臟細胞原位凋亡(TUNEL)的免疫組化檢測UW液和ZW液治療組和對照組移植術(shù)后14d均見肝實質(zhì)細胞凋亡，與UW液和ZW液治療組相比較，實驗對照組移植術(shù)后14d可見較多散在的肝實質(zhì)細胞凋亡，亦可見少量染色陽性的肝竇內(nèi)皮細胞。移植術(shù)后14dUW液、ZW液治療組和對照組的AI為(n=6，J±s，19.87±2.45,4.56±0.78,4.75±065)，兩治療組凋亡的肝細胞明顯減少，其AI均顯著降低(p〈0.05)，而兩治療組AI相比無顯著差異，見表12。表12各組大鼠原位肝移植術(shù)后14肝組織中AI變(±s)DIGnAIA619.87±2.45B64.56±0.78C64.75±065注A虹與B、C組比較有統(tǒng)計學差異(p<0.05)，B、C之間無顯著差異。3、又幾種肝保存液的配置(1)成份與含量1，6-二磷酸果糖7g、谷胱苷肽lg、別嘌呤醇2g、川芎嗪0.3g、山莨菪堿8mg、維生素E0.20.4g(—般使用O.3g)。按處方稱量，用林格氏液溶解至100ml過濾即得。維生素E具有抗氧化作用，與多種酶一起構(gòu)成體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)，保護著細胞骨架、蛋白質(zhì)中巰基、細胞內(nèi)核酸等免受自由基的攻擊。因此，維生素E在維護免疫、神經(jīng)、心血管正常運行，抗動脈粥樣硬化、延緩衰老和抗癌上有一定作用。與此同時，維生素E還有一定的免疫功能，可以促進T淋巴細胞增殖和單核細胞分泌細胞因子。在本發(fā)明保存液處方中加入維生素E，使得本發(fā)明效果更好。(2)成份與含量1，6-二磷酸果糖8g、谷胱苷肽2g、別嘌呤醇3g、川芎嗪0.5g、山莨菪堿12mg、青霉素6001000萬單位(一般使用800力'單位)。按處方稱量，用林格氏液溶解至100ml過濾即得。青霉素是抗菌素的一種，是指從青霉菌培養(yǎng)液中提制的分子中含有青霉烷、能破壞細菌的細胞壁并在細菌細胞的繁殖期起殺菌作用的一類抗生素，是第一種能夠治療人類疾病的抗生素。青霉素類抗生素是e-內(nèi)酰胺類中一大類抗生素的總稱。青霉素類抗生素的毒性很小，由于e-內(nèi)酰胺類作用于細菌的細胞壁，而人類只有細胞膜無細胞壁，故對人類的毒性較小，在一般用量下，其毒性不甚明顯.是化療指數(shù)最大的抗生素。所以在本發(fā)明中加入該物質(zhì)，能彌補一些不足。(3)成份與含量1,6-二磷酸果糖7.5g、谷胱苷肽1.5g、別嘌呤醇2.5g、川芎嗪0.4g、山莨菪堿10rag、維生素E0.3g、青霉素800萬。按處方稱量，用林格氏液溶解至100ml過濾即得。同理，在本發(fā)明同時再加入維生素E和青霉素，必使效果更好。權(quán)利要求1、一種肝保存液，其特征是每100ml該肝保存液含有1，6-二磷酸果糖7～8g，谷胱苷肽1～2g，別嘌呤醇2～3g，中藥成分川芎嗪0.3～0.5g，中藥成分山莨菪堿8～12mg，林格氏液加至100毫升。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種肝保存液，其特征在于每100ml該肝保存液含有維生素E0.20.4g。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種肝保存液，其特征在于每100ml該肝保存液含有青霉素6001000萬單位。全文摘要本發(fā)明公開了一種肝保護液，每100ml該肝保存液含有1，6-二磷酸果糖7～8g，谷胱苷肽1～2g，別嘌呤醇2～3g，中藥成分川芎嗪0.3～0.5g，中藥成分山莨菪堿8～12mg，林格氏液加至100毫升。通過大量的實驗證明本發(fā)明公開的肝保存液，與試驗對照組有統(tǒng)計學意義，兩治療組(本發(fā)明組與美國UW液治療組)沒有統(tǒng)計學意義。本發(fā)明為長效肝器官保存又提供了一個非常好的保證，而且處方簡單，為生產(chǎn)和臨床應(yīng)用節(jié)約了生產(chǎn)和檢驗成本。文檔編號A01N1/02GK101627753SQ200910184378公開日2010年1月20日申請日期2009年8月19日優(yōu)先權(quán)日2009年8月19日發(fā)明者張業(yè)偉申請人:江蘇省腫瘤醫(yī)院