專(zhuān)利名稱(chēng)：：角膜中期保存液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種角膜中期保存液。
背景技術(shù)：
：現(xiàn)有角膜的活性保存方法，根據(jù)保存時(shí)間的不同，可分為短期保存、中期保存和長(zhǎng)期保存。短期保存是將全眼球消毒殺茵處理后，在濕房4°C條件下保存，此方法的優(yōu)點(diǎn)是方法簡(jiǎn)便，有效可行，尤其適合于基層醫(yī)院開(kāi)展角膜移植。缺點(diǎn)是保存時(shí)間較短，一般都在48小時(shí)內(nèi)有效，有時(shí)因不能及時(shí)找到患者，材料已過(guò)期而棄用。長(zhǎng)期保存是將角膜片經(jīng)特殊處理后在-196°C的液氮中冷凍保存。冷凍保存的最大優(yōu)點(diǎn)是為臨床隨時(shí)提供優(yōu)質(zhì)活性角膜，但是這種方法需特殊設(shè)備，技術(shù)難度高。中期保存一般采用角膜片組織保存液4。C保存，這一方法不僅可以提供較高質(zhì)量的角膜，而且使角膜移植手術(shù)在時(shí)間安排方面得以改善。目前，最常用的幾種角膜中期保存液是K-S0K,CSM，Dexsol和Optisol。這些保存液基本功能相似，但組成的成份及濃度不同。它們存在一個(gè)共同的問(wèn)題是它們都進(jìn)口產(chǎn)品，其價(jià)格昂貴。近年來(lái)，為了向社會(huì)提供物美價(jià)廉的角膜中期保護(hù)液，我國(guó)學(xué)者在這方面作了不少研究，如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN1162389、CN1262866和CN1631138所公開(kāi)的角膜保存液均較好地解決了這個(gè)問(wèn)題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服上述問(wèn)題，向社會(huì)提供一種新的物美價(jià)廉的角膜中期保護(hù)液。本發(fā)明的技術(shù)方案是提供一種角膜中期保存液，其是以1000ml的保存液中含有DMEM培養(yǎng)基O.5-1.5g,羥丙基甲基纖維素1-10g,2-巰基乙醇0.l-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸l-3ml，Hepes緩沖液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol,慶大霉素50-70mg;該保存液的pH值為7.2-8.0,滲透壓為350—400mmol/LH20。所述慶大霉素50-70mg可用50-70mg鏈霉素代替。所述慶大霉素50-70mg可用20-40mg鏈霉素和慶大霉素20-40mg代替。本發(fā)明由DMEM培養(yǎng)基，羥丙基曱基纖維素，2-巰基乙醇，右旋糖苷，非必需氨基酸等成份加蒸鎦水配制而成。它不同于其它角膜中期保存液，其中羥丙基曱基纖維素可以保護(hù)角膜不受外力的傷害，而且羥丙基曱基纖維素本身是一種惰性物質(zhì)，可以降低細(xì)胞代謝速度，對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用，可以提高膠體滲透壓；2-巰基乙醇對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很重要的作用，它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞的增殖作用，2-巰基乙醇的活性部分能使保存液中氧化的谷胱甘肽成為還原型谷胱甘肽，從而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。本發(fā)明由于采用了價(jià)格比較低廉的羥丙基曱基纖維素和2-巰基乙醇，使得本發(fā)明不僅具有好的角膜保存質(zhì)量，同時(shí)還具有優(yōu)良的性?xún)r(jià)比的優(yōu)點(diǎn)，是一種廣泛適用于國(guó)內(nèi)外眼庫(kù)使用的角膜中期保存液。圖1是本發(fā)明角膜中期保存液保存5d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-萏素紅染色xl00。圖2是Optisol-GS液保存5d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-萏素紅染色xioo。圖3是本發(fā)明角膜中期保存液保存8d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色xl00。圖4是0ptiso1-GS液保存8d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色x100。圖5是本發(fā)明角膜中期保存液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色xioo。圖6是Optisol-GS液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞臺(tái)盼藍(lán)-茜素紅染色xioo。圖7是本發(fā)明角膜中期保存液保存8d的人角膜組織切片。圖8是本發(fā)明角膜中期保存液保存14d的人角膜組織切片。圖9-圖IO是本發(fā)明角膜中期保存液保存10d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中央及周邊掃描電鏡^見(jiàn)察x1000。圖11-圖12是Optisol-GS液保存10d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞中央及周邊掃描電鎮(zhèn)7見(jiàn)察xi000。圖13是本發(fā)明角膜中期保存液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡觀察x1000。圖14是Optisol-GS液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞掃描電鏡觀察x1000。圖15是本發(fā)明角膜中期保存液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡觀察x5200。圖16是Optisol-GS液保存14d的人角膜內(nèi)皮細(xì)胞透射電鏡觀察x5200。具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所采用的DMEM培養(yǎng)基(液體)是由美國(guó)GIBCO公司生產(chǎn)的，其含有1000mg/L葡萄糖，584mg/L-谷氨酰胺，110mg/L丙酮酸，3700mg/L碳酸氫鈉，pH值為L(zhǎng)2-7.4,它是一種非常適合于許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基。顯然，上述DMEM培養(yǎng)基也可以用具有相同或相近組份的DMEM培養(yǎng)基干粉，通過(guò)計(jì)算其組份的重量后，直接用干粉DMEM培養(yǎng)基代替液體的DMEM培養(yǎng)基。本發(fā)明中的羥丙基曱基纖維素(Hydroxypropyimethyleeilulose，HPMC)是由美國(guó)D0W公司生產(chǎn)的。本發(fā)明中的2-巰基乙醇、右旋糖苷和HEPES緩沖液均由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)。本發(fā)明中的非必需氨基酸是由美國(guó)HyClone公司生產(chǎn)的非必需氨基酸溶液(10mM,IOO倍)，其含有七種非必需氨基酸，每種各10mM(可溶于MEM培養(yǎng)基)。2-8。C保存。慶大霉素、鏈霉素，地塞米松、氫化可的松均為國(guó)產(chǎn)。表1為本發(fā)明角膜中期保存液的配方<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>分別將表l中的各角膜中期保存液及0pUsol-GS液，各用8只人角膜，分別用5天、8天和14天進(jìn)行保存試驗(yàn)，在深圳市眼科醫(yī)院進(jìn)行穿透性角膜移植，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的1-12實(shí)施例中的在保存8天以?xún)?nèi)的各項(xiàng)技術(shù)指示與Optisol-GS液相當(dāng)，完全可以取代進(jìn)口的Optisol-GS液。在保存第14天時(shí)，其中的第4、5、6和12號(hào)實(shí)施例的數(shù)據(jù)還略好于0ptisol-GS液。經(jīng)試驗(yàn)，將表1中的慶大霉素或鏈霉素50-7Omg用20-40mg鏈霉素和慶大霉素20-40mg代替，可以起到同樣的抗菌效果。將表1中的第6號(hào)角膜中期保存液保存的一只人角膜與Optisol-GS液保存的一只人角膜進(jìn)行切片比較的結(jié)果如下。1、保存角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性率見(jiàn)表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在兩種保存液中保存不同時(shí)間內(nèi)皮細(xì)胞活性率比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)(見(jiàn)圖1-6)。表2兩種保存液中保存不同時(shí)間人角膜內(nèi)皮細(xì)胞活性率比較<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2、角膜厚度測(cè)量結(jié)果見(jiàn)表3。在本發(fā)明角膜中期保存液中保存14d的植片平均角膜中央厚度為649.2um，在Optisol-GS液中保存14d的植片平均角膜中央厚度為655.1卩m。兩組比較差異無(wú)顯著性(p>0.05)。表3兩種保存液中保存不同時(shí)間人角膜厚度變化(um，3f士s)<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>3、組織學(xué)觀察:保存5、8、12、14天角膜片組織結(jié)構(gòu)清晰(保存8天，角膜層間結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮層完整、無(wú)水腫。保存12天起，可見(jiàn)角膜基質(zhì)層輕水腫，但上皮、內(nèi)皮層保持完好(見(jiàn)圖7~8)。4、掃描及透射電鏡觀察掃描電鏡4全查兩組保存液保存10天的角膜內(nèi)皮細(xì)胞六角形鑲嵌結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞連接較為緊密，Y型連接無(wú)斷裂，胞體較大，部分細(xì)胞核突起明顯；保存14天的角膜內(nèi)皮細(xì)胞連接仍較緊密，細(xì)胞膜出現(xiàn)散在個(gè)別微小裂孔。透射電鏡觀察兩組保存液保存14天的角膜內(nèi)皮細(xì)胞膜尚完整，部分線粒體胂脹，細(xì)胞內(nèi)有空泡(見(jiàn)圖9-16)。5、微生物培養(yǎng)觀察兩組保存液在保存過(guò)程中，液體澄清，送檢樣本，菌檢均為陰性。權(quán)利要求1、一種角膜中期保存液，其特征在于其是1000ml的保存液中含有DMEM培養(yǎng)基0.5-1.5g，羥丙基甲基纖維素1-10g，2-巰基乙醇0.1-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸1-3ml，Hepes緩沖液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol，慶大霉素50-70mg；該保存液的pH值為7.2-8.0，滲透壓為350-400mmol/LH2O。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜中期保存液，其特征在于所述慶大霉素50-70mg可用50-70mg鏈霉素代替。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的角膜中期保存液，其特征在于所述慶大霉素50-70mg可用20-40mg鏈霉素和慶大霉素20-40mg代替。全文摘要一種角膜中期保存液，其是以1000ml的保存液中含有DMEM培養(yǎng)基0.5-1.5g，羥丙基甲基纖維素1-10g，2-巰基乙醇0.1-10ml，右旋糖苷(分子量40000)10-20g，非必需氨基酸1-3ml，Hepes緩沖液10-32mmol，地塞米松0.01-0.05mmol，慶大霉素50-70mg；該保存液的pH值為7.2-8.0，滲透壓為350-400mmol/LH₂O。本發(fā)明不僅具有好的角膜保存質(zhì)量，同時(shí)還具有優(yōu)良的性?xún)r(jià)比的優(yōu)點(diǎn)，是一種廣泛適用于國(guó)內(nèi)外眼庫(kù)使用的角膜中期保存液。文檔編號(hào)A01N1/02GK101524063SQ20091013400公開(kāi)日2009年9月9日申請(qǐng)日期2009年3月23日優(yōu)先權(quán)日2009年3月23日發(fā)明者莉于,亮吳,周艷麗,姚曉明,林寶濤,肖愛(ài)明,袁鳳波,謝柏林,阿衣努爾·吐?tīng)柕厣暾?qǐng)人:姚曉明