專利名稱：一種抑制桃褐腐病菌的緩釋微囊及復(fù)合膜的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于殺菌劑生產(chǎn)領(lǐng)域，涉及一種中藥提取物小檗堿(又名黃連素)
對桃褐腐病菌(Afom7z'm'a/mcricoto)的緩釋微囊及復(fù)合膜的制備方法。
背景技術(shù)：
從藥用植物中篩選抗真菌活性物質(zhì)是當(dāng)前殺菌劑研發(fā)的重要方向。我國 擁有豐富的藥用植物資源，借鑒中醫(yī)藥研究成果，可望從藥用植物中篩選出 抗植物病原真菌的天然活性物質(zhì)。這些活性物質(zhì)可直接作為天然殺菌劑，或 以此為先導(dǎo)化合物，通過結(jié)構(gòu)修飾而開發(fā)為高活性殺菌劑。
桃褐腐病是一種真菌病害，為害桃樹的花葉、枝梢及果實，尤以果實受 害最重，引起大量落果和爛果，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥因污染 環(huán)境以及病菌耐藥性而逐漸被禁用。目前國內(nèi)外尚無高效防治桃褐腐病且對 環(huán)境友好的天然農(nóng)藥。此外，傳統(tǒng)劑型因短暫藥效不能滿足現(xiàn)代農(nóng)藥的要求， 所以亟待篩選高效抑制桃褐腐病菌且對環(huán)境友好的天然活性物質(zhì)，并開發(fā)為 新劑型以延長藥效時間。
經(jīng)過大量篩選，發(fā)現(xiàn)中藥黃連提取物中的小檗堿對桃褐腐病菌具有強(qiáng)烈 抑制作用。在此基礎(chǔ)上，以殼聚糖為囊壁材料，以小檗堿為囊心，制備了小 檗堿-殼聚糖微囊，體外釋放試驗表明其緩釋效果。此外，以小檗堿、殼聚糖 為主料制備了復(fù)合膜，該膜因具有緩釋效果而持久抑制桃褐腐病菌，并且該 膜還具有保鮮效果。

發(fā)明內(nèi)容
鑒于現(xiàn)有化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境污染和人的毒性以及短暫藥效，本發(fā)明旨在克 服這些缺陷，尋求一種可以有效抑制桃褐腐病菌的天然藥物，并將其制成緩 釋劑型。涉及長效殺菌的小檗堿-殼聚糖微囊以及具有抗菌和保鮮雙重功能的 復(fù)合膜。
本發(fā)明提供了一種抑制桃褐腐病菌的微囊的制備方法，其特征在于，該 方法包括如下步驟
1) 稱取殼聚糖和小檗堿，殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-ll: 0.22-0.28， 加入醋酸溶液，待殼聚糖和小檗堿充分溶脹后，攪拌溶解，靜置，去氣泡， 得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用；
2) 將小檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含司盤80的大豆油中，在40 5(TC恒 溫下，進(jìn)行攪拌，乳化28-32min后形成W/0體系；3) 逐滴加入戊二醛溶液，攪拌2.5-3.5個小時，離心，使微囊完全沉降；
4) 傾取上層制備液，所得微囊用石油醚洗滌3-5次，所得微囊在48-52"C 下真空干燥23-25小時，即得。
本發(fā)明還提供了一種抑制桃褐腐病菌的緩釋復(fù)合膜的制備方法，其特征 在于，該方法包括如下步驟
1) 稱取殼聚糖，加入到含2%醋酸和5-10%甘油的水溶液中，同時加 入小檗堿，溫度低于4(TC，攪拌，使小檗堿及殼聚糖完全溶解配置成膜液， 殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-11: 0.22-0.28。
2) 靜置，使膜液中的氣泡完全消失，將膜液傾倒于平板上，自然風(fēng)干 后揭膜。
通過大量篩選，發(fā)現(xiàn)黃連這一傳統(tǒng)中藥的提取物對桃褐腐病菌具有強(qiáng)烈 抑制效果。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，黃連提取物中的小檗堿發(fā)揮著關(guān)鍵作用，小檗 堿即能強(qiáng)烈抑制菌絲生長和孢子萌發(fā)。為避免傳統(tǒng)農(nóng)藥的短暫藥效，制備了 具有緩釋效果的微囊和復(fù)合膜，兩者均具緩釋效果。此外，小檗堿-殼聚糖復(fù) 合膜對桃具有保鮮功能。由于小檗堿為天然化合物，對環(huán)境和植物無毒副作 用，且已能人工合成，適合工業(yè)放大，所以具有廣闊市場前景。
具體實施例方式
下面的具體方法可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任 何方式限制本發(fā)明。
小檗堿在0.001 100mg/mL范圍內(nèi)，隨著濃度的升高，其抑制作用逐漸 增強(qiáng)，小檗堿對桃褐腐病菌的有效中濃度EC5。為4.55ug/mL，即導(dǎo)致50%菌體 死亡的濃度。
小檗堿水溶液按7.5mg/mL， 3.75 mg/mL， 1.875mg/mL， 0.937 mg/mL， 0.468 mg/mL， 0.234 mg/mL， 0.117mg/mL， 0.058 mg/mL濃度配制，各取6 mL 分別加入54mL融化的培養(yǎng)基(約6(TC)，攪拌混勻，116"C高壓滅菌25min測得 小檗堿的最小抑菌濃度(MIC)為46.9ug/mL，即在此濃度下菌絲完全停止生 長。
抑制桃褐腐病菌的緩釋微囊的制備
l)稱取殼聚糖和小檗堿，殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-11: 0.22-0.28， 加入醋酸溶液，待殼聚糖和小檗堿充分溶脹后，攪拌溶解，靜置，去氣泡， 得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用；
42) 將小檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含司盤80的大豆油中，在40 50"C恒 溫下，進(jìn)行攪拌，乳化28-32min后形成W/0體系；
3) 逐滴加入戊二酸溶液，攪拌2.5-3.5個小時，離心，使微囊完全沉降；
4) 傾取上層制備液，所得微囊用石油醚洗滌3-5次，所得微囊在48-52 'C下真空干燥23-25小時，即得。
微囊緩釋及抑菌功能以pH6.8的磷酸鹽緩沖液(取0.2mol/L磷酸二氫 鉀溶液250mL，加0.2mol/L氫氧化鈉溶液118mL，用水稀釋至1000mL)為 遞質(zhì)測定微囊小檗堿的釋放度。將準(zhǔn)確定量的微囊密封于透析袋內(nèi)，置于遞 質(zhì)中，轉(zhuǎn)速100r/min，溫度為30'C，于設(shè)定時間取樣，同時補(bǔ)加同量的新鮮 稀釋液。用紫外分光法在345nm下測定釋放液中小檗堿的吸光度，換算成濃 度，計算小檗堿的累計釋放百分?jǐn)?shù)。
微囊釋放率的計算公式為Release^) = X 100%
附x載藥里
式中C為釋放各時刻溶液中的小檗堿濃度，V為釋放介質(zhì)體積(mL)， m為載藥微囊質(zhì)量(mg)。繪制釋放率一時間曲線，考察微囊的釋藥性能。結(jié)果 表明，初期藥物釋放速度較快，在第一天內(nèi)釋放率最快，隨后釋放速度變慢， 累計一個月小檗堿釋放方達(dá)到72-80%，表明微囊的緩釋效果明顯。
取微囊1.5g與滅菌的300mL液態(tài)培養(yǎng)基混勻，倒皿(9cm)，冷卻。無菌 條件下，用孔徑為0.6厘米打孔器取菌落邊緣旺盛生長的桃褐腐菌餅，移入PDA 平板中。每次處理重復(fù)5次，以無藥培養(yǎng)基所制平板為空白對照，測定藥物對 病原菌的抑制率。
實施例1
稱取殼聚糖9§和小檗堿0.228，加入0.i8wtQ/。的醋酸溶液9mL待其充分溶 脹后，攪拌使其溶解，靜置，去氣泡，得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用；將小 檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含0.18wtQ/。Span80的68mL大豆油中，在4(TC恒溫下 進(jìn)行攪拌，乳化28min后形成W/0體系；逐滴加入48 wt 。/。戊二醛溶液l.lmL， 攪拌2.5個小時，離心，使微囊完全沉降；傾取上層制備液，所得微囊用石油 醚洗滌3次，所得微囊在48'C下真空干燥23小時，即得。
結(jié)果表明，初期藥物釋放速度較快，在第一天內(nèi)釋放率即達(dá)16%，隨后釋 放速度變慢，累計一個月小檗堿釋放率達(dá)到72%，藥物對病原菌的抑制率達(dá)到 90%。
實施例2稱取殼聚糖10g和小檗堿0.25g，加入0.18wt %的醋酸溶液9mL待其充 分溶脹后，攪拌使其溶解，靜置，去氣泡，得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用； 將小檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含0.18wt °/。Span80的68mL大豆油中，在45°C 恒溫下進(jìn)行攪拌，乳化30min后形成W/0體系；逐滴加入48 wt %戊二醛溶 液l.lmL，攪拌3小時，離心，使微囊完全沉降；傾取上層制備液，所得微囊 用石油醚洗滌3次，所得微囊在5(TC下真空干燥24小時，即得。
結(jié)果表明，初期藥物釋放速度較快，在第一天內(nèi)釋放率即達(dá)17%，隨后釋 放速度變慢，累計一個月小檗堿釋放率達(dá)到76%，藥物對病原菌的抑制率達(dá)到 94%。
實施例3
稱取殼聚糖llg和小檗堿0.28g，加入0.18wt。/。的醋酸溶液9mL待其充 分溶脹后，攪拌使其溶解，靜置，去氣泡，得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用； 將小檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含0.18wt%Span80的68mL大豆油中，在50°C 恒溫下進(jìn)行攪拌，乳化32min后形成W/O體系；逐滴加入48 wt %戊二醛溶 液l.lmL，攪拌3.5小時，離心，使微囊完全沉降；傾取上層制備液，所得微 囊用石油醚洗滌3次，所得微囊在52'C下真空干燥25小時，即得。
結(jié)果表明，初期藥物釋放速度較快，在第一天釋放率即達(dá)20%，隨后釋放 速度變慢，累計一個月小檗堿釋放率達(dá)到80%，藥物對病原菌的抑制率達(dá)到 100%。
小檗堿-殼聚糖復(fù)合膜制備
稱取4-6g殼聚糖，加入到含2°/。醋酸和5-10%甘油的水溶液中，同時加入 小檗堿(100-300pg/mL)，溫度20-4(TC，防止殼聚糖變性，攪拌，使小檗堿及 殼聚糖完全溶解，配制成200mL高粘度膜液。靜置，使膜液中的氣泡完全消 失。把膜液傾倒于鋪膜平板上，自然風(fēng)干后揭膜。
小檗堿-殼聚糖復(fù)合膜緩釋功能測定以pH6.8的磷酸鹽緩沖液為遞質(zhì)， 測定小檗堿-殼聚糖膜中小檗堿的釋放度。準(zhǔn)確稱取小檗堿-殼聚糖復(fù)合膜，密 封于透析袋內(nèi)，置于遞質(zhì)中，在恒溫式振蕩器中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速為100r/min，模擬 菌生長環(huán)境溫度(27士0.1)'C，于設(shè)定時間取樣，同時補(bǔ)加同量新鮮稀釋液。用 紫外分光光度法在345nm下測定釋放液中的小檗堿吸光度換算成濃度，計算
小檗堿的累計釋放百分?jǐn)?shù)。釋放率的計算公式為Release她(％)==旦X
腦載藥里
100%
6公式中C為釋放各時刻溶液中小檗堿的濃度Oig/mL)， V為釋放介質(zhì)體積 (mL) , m為小檗堿-殼聚糖復(fù)合膜的質(zhì)量(mg)。制作釋放率一時間曲線，考 察小檗堿-殼聚糖膜的釋藥性能。桃保鮮實驗1#膜2%殼聚糖+2%醋酸水溶液+10%甘油水溶液； 2#膜2%殼聚糖+2%醋酸水溶液+10%甘油水溶液+小檗堿； 方法將挑選好的鮮桃，按照相同數(shù)量分別用2種保鮮膜包裹。在表面 噴灑低濃度的桃褐腐病菌懸浮液，然后4'C低溫貯藏。發(fā)現(xiàn)含有小檗堿的2# 膜的抗菌保鮮效果最好，到第20天果實失重率只有9.5%，而侵染率僅為8%。 相比之下，不含小檗堿的f膜的抗菌效果較差，到第20天的果實侵染率達(dá)到 21%，而失重率與1#膜相差較小，為9%。 實施例1稱取4g殼聚糖，加入到含2%醋酸和5%甘油的水溶液中，同時加入小檗 堿(100ng/mL)，溫度20'C，防止殼聚糖變性，攪拌，使小檗堿及殼聚糖完全 溶解，配制成200mL高粘度膜液。靜置，使膜液中的氣泡完全消失。把膜液 傾倒于鋪膜平板上，自然風(fēng)干后揭膜。通過測定緩釋功能，發(fā)現(xiàn)20天的累積釋放率達(dá)21%。利用此復(fù)合膜4。C 下包裹桃果實，到第20天果實失重率為9.2%，侵染率為13%。實施例2稱取5g殼聚糖，加入到含2%醋酸和8%甘油的水溶液中，同時加入小檗 堿(200^ig/mL)，溫度33。C，防止殼聚糖變性，攪拌，使小檗堿及殼聚糖完全 溶解，配制成200mL高粘度膜液。靜置，使膜液中的氣泡完全消失。把膜液 傾倒于鋪膜平板上，自然風(fēng)干后揭膜。通過測定緩釋功能，發(fā)現(xiàn)20天的累積釋放率達(dá)24%。利用此復(fù)合膜4'C 下包裹桃果實，到第20天果實失重率只有9.0%，侵染率為10%。實施例3稱取6g殼聚糖，加入到含2°/。醋酸和10%甘油的水溶液中，同時加入小 檗堿(300pg/mL)，溫度4(TC，防止殼聚糖變性，攪拌，使小檗堿及殼聚糖完 全溶解，配制成200mL高粘度膜液。靜置，使膜液中的氣泡完全消失。把膜 液傾倒于鋪膜平板上，自然風(fēng)干后揭膜。通過測定緩釋功能，發(fā)現(xiàn)20天的累積釋放率達(dá)30%。利用此復(fù)合膜4"C 下包裹桃果實，到第20天果實失重率只有9.5%，侵染率為8%。
權(quán)利要求
1.一種抑制桃褐腐病菌的微囊的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1)稱取殼聚糖和小檗堿，殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-11∶0.22-0.28，加入醋酸溶液，待殼聚糖和小檗堿充分溶脹后，攪拌溶解，靜置，去氣泡，得到小檗堿-殼聚糖溶液，備用；2)將小檗堿殼聚糖溶液逐滴加入含司盤80的大豆油中，在40～50℃恒溫下，進(jìn)行攪拌，乳化28-32min后形成W/O體系；3)逐滴加入戊二醛溶液，攪拌2.5-3.5個小時，離心，使微囊完全沉降；4)傾取上層制備液，所得微囊用石油醚洗滌3-5次，所得微囊在48-52℃下真空干燥23-25小時，即得。
2. —種抑制桃褐腐病菌的緩釋復(fù)合膜的制備方法，其特征在于，該方法 包括如下步驟1) 稱取殼聚糖，加入到含2%醋酸和5-10%甘油的水溶液中，同時加 入小檗堿，溫度低于40°C,攪拌，使小檗堿及殼聚糖完全溶解配置成膜液， 殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-11: 0.22-0.28。2) 靜置，使膜液中的氣泡完全消失，將膜液傾倒于平板上，自然風(fēng)干 后揭膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抑制桃褐腐病菌的緩釋微囊及復(fù)合膜的制備方法。緩釋微囊制備方法稱取殼聚糖和小檗堿，殼聚糖和小檗堿的質(zhì)量比為9-110.22-0.28，加入醋酸溶液，待殼聚糖和小檗堿充分溶脹后，攪拌溶解，靜置，去氣泡，得到小檗堿-殼聚糖溶液，加入含司盤80的大豆油中，在40～50℃恒溫下，進(jìn)行攪拌，乳化28-32min后形成W/O體系；戊二醛溶液，攪拌2.5-3.5個小時，離心，使微囊完全沉降；傾取上層制備液，所得微囊用石油醚洗滌3-5次，所得微囊在48-52℃下真空干燥23-25小時。本發(fā)明還提供了抑制桃褐腐病菌的緩釋復(fù)合膜的制備方法。本發(fā)明的微囊和復(fù)合膜，兩者均具緩釋效果，且由于小檗堿為天然化合物，對環(huán)境和植物無毒副作用。
文檔編號A01N43/16GK101574083SQ20091008717
公開日2009年11月11日 申請日期2009年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月19日
發(fā)明者侯東耀, 田平芳, 葛喜珍, 閻春琦 申請人:北京化工大學(xué)