專利名稱：：一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法
技術領域：
：本發(fā)明屬鐵皮石斛胚芽干品的制備領域，特別是涉及一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法。
背景技術：
：石斛作為傳統(tǒng)名貴中藥材歷來受醫(yī)學界的重視，由于它的特殊療效功能，受到醫(yī)學家的推崇。石斛對生產(chǎn)環(huán)境條件較為苛刻，生長緩慢，生物產(chǎn)量極為低下，加上人們長期無節(jié)制采挖，生態(tài)環(huán)境的惡化，使整個藥用石斛類植物面臨瀕滅境地，其中尤以鐵皮石斛，又名霍山石斛(中藥大辭典1985)為優(yōu)。對于鐵皮石斛(Dendrobiumo伍cinaleKimuraetMigo)胚芽干品，迄今為止尚未見無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)的方法。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，該方法步驟簡單，生產(chǎn)周期時間短，成本低，對環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)，解決了鐵皮石斛資源短缺的問題。本發(fā)明的一種無激素規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植體的培養(yǎng)和接種將鐵皮石斛原種植株培養(yǎng)成3-5cm高，帶3-5片葉，具3-4節(jié)間的成年株，釆集外植體用自來水反復沖洗至無泡沫為止，然后將其滅菌，切去全葉和植物基部0.30.6cm，接種到M2固體培養(yǎng)基，于暗培養(yǎng)條件下，24。C士rC，誘導休眠芽的生長3545天；(2)胚狀體的繼代增殖將休眠芽誘導成功后，移到光培條件下2000Lx，1620小時光照，長到0.81.2cm時剝離休眠芽，移入到M2液體培養(yǎng)基(去掉固體中的瓊脂粉)中，每7天繼代一次，24°C±1°C，自然室內光強度，經(jīng)45-50天后，誘導出胚狀體；(3)無激素一級培養(yǎng)及篩選取上述胚狀體接種到M2液體培養(yǎng)基中，進行一級液體擴大培養(yǎng)，每10天繼代一次，每次繼代按l:2擴大群體，經(jīng)3—5個周期后，挑選形態(tài)生長正常、綠色、外形大小相近的培養(yǎng)系，用M0液體培養(yǎng)基，每10天繼代一次，進行5~8次的繼代培養(yǎng)，得成熟細胞系；(4)無激素二級通氣培養(yǎng)將上述成熟細胞系接種到MO液體培養(yǎng)基，并加入一級培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基(原母瓶的老培養(yǎng)基)，進行二級通氣擴大培養(yǎng)，每天提供14-16小時光照或采取太陽自然光，培養(yǎng)15~20天；(5)無激素終極通氣培養(yǎng)選擇20升培養(yǎng)容器，每個容器裝液量為16升，其中14升為新鮮的M0液體培養(yǎng)基，2升為步驟(4)培養(yǎng)時的條件培養(yǎng)基(原母瓶的老培養(yǎng)基)，選擇步驟(4)得到的種子進行接種，保持2000-2500Lx光強度，按38-40度斜面于專制培養(yǎng)架上培養(yǎng)15~20天，收集鮮品；(6)鮮成品的后處理將上述鮮品收集后，用純凈水沖洗一遍后漓干、稱重，然后于506(TC干燥，按250g、500g、1000g或5000g定量包裝，經(jīng)a射線滅菌后，8'C-12。C保存。步驟(1)中所述的M2固體培養(yǎng)基為1/2MS大量元素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+細胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁+瓊脂粉4.8g/L，PH5.8，常規(guī)滅菌；步驟(1)中所述的滅菌為50%乙醇浸潤3-5秒一20%"84"液7-8分鐘一0.1%升汞液中12-15分鐘一滅菌水沖洗幾遍后，吸干水分；步驟(2)和(3)中所述的M2液體培養(yǎng)基為1/2MS大量之素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+細胞分裂素BA0.2mg/L，PH5.8，常規(guī)滅菌；步驟(4)中所述的MO液體培養(yǎng)基為1/2MS大量之素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機成分+蔗糖30g/L，PH5.8，常規(guī)滅菌；步驟(4)中所述的條件培養(yǎng)基為石斛在步驟(3)中的MO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~15天后的老培養(yǎng)基；步驟(5)中所述的條件培養(yǎng)基為石斛在步驟(4)中的MO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~15天后的老培養(yǎng)基；步驟(5)中所述的專制培養(yǎng)架為每個架子占地1M2，裝三層，一排3個20L容器，每個架子放置18個。本發(fā)明采用MS的大量元素和微量元素作用于培養(yǎng)物的礦物營養(yǎng)；糖作為植物細胞的碳源，提供建成細胞壁一纖維素的來源，同時對培養(yǎng)基形成一定的滲透壓，以便培養(yǎng)物啟動生長；CH(水解酪蛋白)作為有機氮的補充；香蕉汁可以補充維生素類物質，改良生長狀態(tài)。5有益效果本發(fā)明的方法步驟簡單，生產(chǎn)周期時間短，成本低，對環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)，解決了鐵皮石斛資源短缺的問題。圖1為無激素通氣培養(yǎng)鐵皮石斛千品原料生產(chǎn)流程圖。具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。實施例1(一)外植體的準備、培養(yǎng)基制作、接種(1)選取長有3-5片葉，莖粗0.3-0.5成年鐵皮石斛株體；(2)外植體滅菌程序外植體采集后，放在250ml小三角瓶，滴上洗潔精l-2滴，用自來水反復沖洗至無泡沫為止。在超凈臺上按下述步驟進入滅菌程序50%乙醇浸潤3-5秒一20%"84"液7-8分鐘一0.1%升汞液中12-15分鐘一滅菌水沖洗幾遍后，放到滲水無菌紙上吸干附著水；(3)培養(yǎng)基制作、準備選"MS"基本成分，用1/2大量元素+鐵全+微全+全有機常規(guī)+蔗糖30g/L+100g香蕉汁10Q/。/L+瓊脂粉4.8g/LPH5.8，常規(guī)滅菌，然后分裝到150ml三角瓶中(預先滅菌)，每升分裝18-20瓶(簡稱M2固，液體只是去掉瓊脂，簡稱M2);(4)外植體接種將(2)中材料于接種紙上，無菌切去葉片和頂芽及基部0.5cm莖段，每瓶接l-3段，放到24'C士rC暗培養(yǎng)條件下誘導休眠，隔天檢査污染情況，救出未污染的；(5)經(jīng)35-45天培養(yǎng)后，將(4)中的培養(yǎng)物上陸續(xù)誘導出休眠芽，移到光培條件下2000Lx，16小時光照，等長到0.5-lcm長時，切取休眠芽，放到150ml三角瓶中，每瓶5-7個點，加M2至75ml線，放到每分鐘80轉的回轉式搖床，經(jīng)45-50天左右，陸續(xù)長出胚狀體(胚芽)，每10天繼代一次，直至長滿一層，隨著胚狀體"球"增大，不時地用接種器人工切破球體，使其加快增殖；(二)搖床一級液體擴增培養(yǎng)(1)收取上述液體中培養(yǎng)的胚狀體(胚芽)，從150ml小三角瓶轉移到500ml三角瓶中，加M2至200ml線，每10天繼代一次，每次繼代時按1:2擴大群體；(2)胚狀技術參數(shù)的測定在500ml—級培養(yǎng)階段，必須完成以下幾項技術參數(shù)的測定，才能決定產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)用的培養(yǎng)系。a."比生物生長速率"的測定(以下簡稱"生長速率")高等植物培養(yǎng)系(細胞，胚狀體等)要達到產(chǎn)業(yè)化要求，人們認為其生長速率起碼5.7mg/g'd，即每毫升培養(yǎng)，每天增長5.7mg鮮重，對產(chǎn)業(yè)化才有實際意義。這項技術參數(shù)，測定貫穿在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)全過程，不斷測定，不斷篩選。我們目前的培養(yǎng)系穩(wěn)定在7.2-8.5mg/g，d水平。b.測定方法和計算公式每個500ml三角瓶接種15g鮮品(接種大小影響結果)，加液200ml(重量g)繼代后10天(IO天周期的確定是根據(jù)鐵皮石斛多糖含量要求和增殖量決定的)，稱鮮重。c.然后計算結果收獲鮮重—15g+200+l(^mg/g*d鐵皮石斛多糖測定定期(按不同季節(jié)，按比量)送專業(yè)權威機構檢測，目前該培養(yǎng)多糖含量穩(wěn)定在8-11%，是人工栽培3年生植株含量的85-90%;d.得干率測定每個成熟培養(yǎng)系在每次收獲以后，漓干后，稱鮮重，烘干后得到干重；計算干重+鮮重=%，我們的得干率在9%±1%;(三)無激素培養(yǎng)系的篩選(在500ml—級培養(yǎng)階段進行)(1)選擇上述在M2培養(yǎng)基上，能最佳狀態(tài)滿足上述幾項技術參數(shù)培養(yǎng)系作為篩選的起始材料，每瓶接種15g鮮重，加入MO(M2去掉外源激素，其余不變)；(2)以10天繼代一次，經(jīng)過5-8次繼代培養(yǎng)后，進入(二)(2)同樣檢測各項技術參數(shù)程序，選擇符合各項參數(shù)的培養(yǎng)系作為下一階段培養(yǎng)的起始材料；(四)無激素二級通氣培養(yǎng)(1)收(三)(2)的成熟系，以l對l接種方式，從500ml三角瓶培養(yǎng)10天后的培養(yǎng)物和條件培養(yǎng)基(原母瓶培養(yǎng)基)一起轉接到1000ml三角瓶中，加入新鮮的MO培養(yǎng)基到800ml線；(2)上述1000ml三角瓶，裝上裝有0.45u孔經(jīng)，直徑25mm空氣過濾，按每二個1000ml三角瓶為一組的并聯(lián)式連接，即一個進氣口空氣過濾器負責兩個瓶，一個排氣過濾器負擔兩個瓶的排氣出口，然后接上5瓦通氣泵，進氣口底部接上，魚缸換氣砂頭，每個泵負擔16個1000ml三角瓶；通氣后，每天提供14-16小時光照或采取太陽自然光，每20天一個培養(yǎng)周期，培養(yǎng)1520天；(五)無激素終極培養(yǎng)(成品培養(yǎng)生產(chǎn))為了解決污染及污染造成種子成本，選擇20升，現(xiàn)成桶裝水桶作為終極培養(yǎng)容器；每個容器終極裝液量為16升，其中14升為新鮮的M0液體，2升為(四)2.培養(yǎng)時的條件培養(yǎng)基(原母瓶培養(yǎng)基)，用(四)2.的6個1000ml三角瓶的培養(yǎng)物作種子，接種后，用(四)2.的通氣裝置，每個5瓦通氣泵，負責4個20L容器的通氣量，保持2000-2500Lx光強度，按38-40度斜面在專制培養(yǎng)架上，每個架子占地1M2，裝三層，一排3個20L容器，每個架子放置18個，20天后終止培養(yǎng)，每個容器能收獲3.2-3.7公斤鮮品；(六)干成品的收獲滅菌從20L容器中收獲的鮮品，經(jīng)純凈水沖洗一遍后，漓干或用電扇吹2-3小時，然后，分裝成薄層，放到抽氣烘干箱中55'C-58'C，一次性烘干。干品按250g、500g、1000g、5000g不同定量包裝，分別集裝在紙箱中，經(jīng)Y射線滅菌后，8'C-12'C保存待運。以下是本發(fā)明中所涉及的培養(yǎng)基的具體成分列表.，全量無機鹽類明細<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>權利要求1.一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植體的培養(yǎng)和接種將鐵皮石斛原種植株培養(yǎng)成3-5cm高，帶3-5片葉，具3-4節(jié)間的成年株，采集外植體用自來水反復沖洗至無泡沫為止，然后將其滅菌，切去全葉和植物基部0.3～0.6cm，接種到M2固體培養(yǎng)基，于暗培養(yǎng)條件下，24℃±1℃，誘導休眠芽的生長35～45天；(2)胚狀體的繼代增殖將休眠芽誘導成功后，移到光培條件下2000Lx，16～20小時光照，長到0.8～1.2cm時剝離休眠芽，移入到M2液體培養(yǎng)基，每7天繼代一次，24℃±1℃，自然室內光強度，經(jīng)45-50天后，誘導出胚狀體；(3)無激素一級培養(yǎng)及篩選取上述胚狀體接種到M2液體培養(yǎng)基，進行一級液體擴大培養(yǎng)，每10天繼代一次，每次繼代按1∶2擴大群體，經(jīng)3-5個周期后，挑選形態(tài)生長正常、綠色、外形大小相近的培養(yǎng)系，用M0液體培養(yǎng)基，每10天繼代一次，進行5～8次的繼代培養(yǎng)，得成熟細胞系；(4)無激素二級通氣培養(yǎng)將上述成熟細胞系接種到M0液體培養(yǎng)基進行二級通氣擴大培養(yǎng)，并加入一級培養(yǎng)后的條件培養(yǎng)基，每天提供14-16小時光照或采取太陽自然光，培養(yǎng)15～20天；(5)無激素終極通氣培養(yǎng)選擇培養(yǎng)容器，每個容器裝液量為16升，其中14升為新鮮的M0液體培養(yǎng)基，2升為步驟(4)培養(yǎng)時的條件培養(yǎng)基，選擇步驟(4)得到的種子進行接種，保持2000-2500Lx光強度，按38-40度斜面于專制培養(yǎng)架上培養(yǎng)15～20天，收集鮮品；(6)鮮成品的后處理將上述鮮品收集后，用純凈水沖洗一遍后漓干、稱重，然后于50～60℃干燥，按250g、500g、1000g或5000g定量包裝，經(jīng)γ射線滅菌后，8℃-12℃保存。2.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(1)中所述的M2固體培養(yǎng)基為1/2MS大量元素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機常規(guī)+蔗糖30g/L+水解酪蛋白CH500mg/L+a-萘乙酸NAA2mg/L+細胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L+瓊脂粉4.8g/L，PH5.8，常規(guī)滅菌。3.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(1)中所述的滅菌為50%乙醇浸潤3-5秒一20%"84"液7-8分鐘一0.1%升汞液中12-15分鐘一滅菌水沖洗幾遍后，吸干水分。4.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)模化培養(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(2)和(3)中所述的M2液體培養(yǎng)基為1/2^3大量元素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機常規(guī)+蔗糖30g/L+水解酪蛋白CH500mg/L+a-萘乙酸NAA2mg/L+細胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L，PH5.8，常規(guī)滅菌。5.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(4)中所述的MO液體培養(yǎng)基為1/2MS大量元素+全量鐵鹽+全量微量+全量有機常規(guī)+蔗糖30g/L，PH5.8，常規(guī)滅菌。6.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(4)中所述的條件培養(yǎng)基為石斛在步驟(3)中的MO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~15天后的老培養(yǎng)基。7.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(5)中所述的條件培養(yǎng)基為石斛在步驟(4)中的MO液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)10~15天后的老培養(yǎng)基。8.根據(jù)權利要求1所述的一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步驟(5)中所述的專制培養(yǎng)架為每個架子占地1M2，裝三層，一排3個20L容器，每個架子放置18個。全文摘要本發(fā)明涉及一種無激素規(guī)?；囵B(yǎng)生產(chǎn)鐵皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植體的培養(yǎng)和接種；(2)胚狀體的繼代增殖；(3)無激素一級液體培養(yǎng)及篩選；(4)無激素二級通氣培養(yǎng)；(5)無激素終極20L通氣培養(yǎng)；(6)鮮成品的后處理。該方法步驟簡單，生產(chǎn)周期時間短，成本低，對環(huán)境友好，適合工業(yè)化生產(chǎn)，解決了鐵皮石斛資源短缺的問題。文檔編號A01H4/00GK101558740SQ20091005166公開日2009年10月21日申請日期2009年5月21日優(yōu)先權日2009年5月21日發(fā)明者湯佳靜,郭建榮,艷陶申請人:上海湯振生物技術有限公司