專利名稱：肺癌的治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺癌的治療領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
肺癌為肺組織的惡性轉(zhuǎn)化和擴張，并且其每年導(dǎo)致130萬的死亡。其在男性中是 癌癥相關(guān)死亡的最常見原因，在女性中是第二常見原因。目前的研究表明對肺癌具有最大影響的因素為長期曝露于吸入性致癌物，特別是 煙草煙霧。在其它方面肺癌的出現(xiàn)(低于十分之一)似乎是因為各遺傳因素的組合。氡氣 和空氣污染也可以促成肺癌的形成。治療和預(yù)后取決于癌癥的組織學類型、階段(擴散的程度)和患者的體力狀態(tài)。目 前的治療包括外科手術(shù)、化療和放療。總體而言，5年生存率約為14%。通過在顯微鏡下通過組織病理學觀察惡性細胞的大小和形態(tài)，將肺癌分為兩個主 要類型非小細胞(80% )和小細胞(約20% )肺癌。盡管這種分類基于簡單的組織學標 準，但是其對于所述疾病的臨床管理和預(yù)后具有非常重要的意義。非小細胞癌癥(NSCLC)被歸類在一起是因為它們的預(yù)后和管理大致相同。其具有 三種主要的亞型鱗狀細胞肺癌、腺癌和大細胞肺癌。鱗狀細胞肺癌，占肺癌的29%，也始于大支氣管，但是生長較慢。在診斷中這些腫 瘤的大小是不同的。腺癌是最常見的NSCLC亞型，占肺癌的32%。其是始于肺的氣體交換表面附近的 形式。腺癌的大多數(shù)病例與吸煙有關(guān)。然而，在從來沒有吸煙的人(“非吸煙者”)中，腺癌 是肺癌的最常見形式。腺癌的亞型，細支氣管肺泡癌，在女性非吸煙者中更為常見，并且對 治療可能具有不同的應(yīng)答。大細胞癌為快速增長的形式，占肺癌的9%，其在接近肺的表面生長。小細胞肺癌(SCLC，又稱“燕麥細胞癌”)為肺癌的少見的形式。其傾向始于大呼 吸管，并迅速生長變得十分巨大。涉及的最常見的致癌基因為L-myc。所述“燕麥”細胞含 有致密神經(jīng)分泌顆粒，其導(dǎo)致這種內(nèi)分泌/副腫瘤綜合征聯(lián)合癥。其最初對化療更為敏感， 但是最后導(dǎo)致差的預(yù)后，并在表現(xiàn)時經(jīng)常是轉(zhuǎn)移的。這種肺癌類型與吸煙強烈相關(guān)。其它肺癌類型包括類癌、腺樣囊性癌(圓柱瘤)和粘液表皮樣癌。轉(zhuǎn)移癌肺為來自身體其它部分的腫瘤的轉(zhuǎn)移的常見部位。腎上腺、肝、腦和骨為原發(fā)性肺 癌本身最常見的轉(zhuǎn)移部位。本領(lǐng)域內(nèi)需要用于治療、預(yù)防、抑制或減少肺癌的治療方法。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明，在受試者中用于治療、抑制、減少或至少部分預(yù)防肺癌，其轉(zhuǎn)移或來 自肺外部的癌的肺中轉(zhuǎn)移，或者用于治療、抑制、減少或至少部分預(yù)防肺癌細胞、其轉(zhuǎn)移、或 來自肺外部的癌細胞的肺中癌細胞轉(zhuǎn)移的生長的方法，包括給受試者施用治療有效量的式 A的免疫調(diào)節(jié)化合物 其中，n為1或2，R為氫、?；?、烷基或肽片段，以及X為芳族或雜環(huán)氨基酸或者其 衍生物，如此在受試者中治療、抑制、減少或至少部分預(yù)防所述肺癌、其轉(zhuǎn)移或來自肺外部 的癌的肺中轉(zhuǎn)移，或者如此治療、抑制、減少或至少部分預(yù)防所述肺癌細胞、其轉(zhuǎn)移、或來自 肺外部的癌細胞的肺中癌細胞轉(zhuǎn)移的生長。


圖1以圖表描述在一個實施方案的一個研究中不同劑量下的腫瘤生長。圖2以圖表描述在一個實施方案的一個研究中不同的劑量下的腫瘤重量。發(fā)明詳述根據(jù)一個實施方案，本發(fā)明涉及通過向哺乳動物受試者(優(yōu)選人類患者)施用免 疫調(diào)節(jié)化合物用于治療、至少部分預(yù)防、抑制或減少肺癌的治療方法。在某些實施方案中，所述疾病為肺癌、其轉(zhuǎn)移、或來自肺外部的癌的肺中轉(zhuǎn)移?？?以使用本發(fā)明在受試者中治療、至少部分預(yù)防、抑制或減少肺癌細胞、其轉(zhuǎn)移、或來自肺外 部的癌細胞的肺中癌細胞轉(zhuǎn)移的生長。在一些實施方案中，在用本發(fā)明的化合物治療之前、 期間或之后通過外科手術(shù)去除原發(fā)性肺癌腫瘤、或其主要部分。根據(jù)本發(fā)明的免疫調(diào)節(jié)化合物包含通式A的免疫調(diào)節(jié)劑 在通式A中，n為1或2，R為氫、?；⑼榛螂钠危约癤為芳族或雜環(huán)氨基酸 或其衍生物。優(yōu)選地，X為L-色氨酸或D-色氨酸，最優(yōu)選為L-色氨酸。對于“X”合適的芳族或雜環(huán)氨基酸的衍生物為酰胺、單或二 -沁-②烷基取代 的酰胺、芳基酰胺和沁_(6)烷基或芳基酯。對于“R”合適的酰基或烷基部分為分支或 不分支的1至約6個碳的烷基、2至約10個碳原子的?；⒁约胺忾]基團如芐氧甲?；?(carbobenzyloxy)和叔丁氧羰基。優(yōu)選地，示于式A中的CH基團的碳當n為2時具有與X的立體構(gòu)型不同的立體構(gòu)型。優(yōu)選的實施方案使用的化合物例如Y-D-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-L-色 氨酸、Y-L-谷氨酰-Nin-甲酰-L-色氨酸、N-甲基-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、N-乙 酰-Y-L-谷氨酰-L-色氨酸、Y-L-谷氨酰-D-色氨酸、0-L-天冬氨酰-L-色氨酸、和 3-D-天冬氨酰-L-色氨酸。特別優(yōu)選的實施方案使用Y-D-谷氨酰-L-色氨酸，有時稱作 SCV-07。美國專利第5，916，878號(通過述及并入本文)公開了這些化合物、制備這些化 合物的方法、這些化合物藥學上可接受的鹽及其藥物制劑。SCV-07,即、-D-谷氨酰-L-色氨酸為具有Y _谷氨酰基或0 -天冬氨?；糠值?免疫調(diào)節(jié)藥類的成員，其是由俄國科學家發(fā)現(xiàn)并且在美國由SciClonePharmaceuticals公 司檢測了在多種適應(yīng)癥中的有效性。SCV-07在體內(nèi)和體外具有多種免疫調(diào)節(jié)活性。SCV-07 增加Con-A誘導(dǎo)的胸腺細胞和淋巴細胞增殖、增加Con-A誘導(dǎo)的白介素_2(IL_2)生成和 脾淋巴細胞的IL-2受體表達，并刺激骨髓細胞上的Thy-1.2的表達。在體內(nèi)，SCV-07對 5-FU-免疫-抑制的動物和在用綿羊紅細胞免疫的模型中具有強烈的免疫刺激作用?？梢砸匀魏斡行У膭┝渴┯檬紸化合物，例如，以范圍在約0. 001-1000mg，優(yōu)選約 0. l-100mg，并且最優(yōu)選約10mg的劑量?？梢悦恐芤淮位蚨啻问┯脛┝浚?，以天計，每天 施用劑量一次或多次劑量?？梢酝ㄟ^任何合適的方法施用，包括口服、經(jīng)鼻、經(jīng)皮、舌下、注 射、定期輸注(periodic infusion)、連續(xù)輸注等。可以通過肌肉注射施用劑量，盡管可以使 用其它形式的注射或輸注，也可以采用例如口服或鼻吸入或口服攝入等其它形式?？梢允?用氣溶膠、溶液、懸浮劑、分散劑、片劑、膠囊、糖漿劑等。也可以使用mg/kg (毫克每千克)來度量劑量，并且劑量在約0. 00001-1000mg/kg 的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在約0.01-100mg/kg的范圍內(nèi)，還更優(yōu)選約0. l_50mg/kg，并且還更優(yōu)選 約 l-20mg/kg。包括具有取代、缺失、延長、替換或以其它方式修飾的部分的生物學活性類似物， 其具有與SCV-07基本上類似的生物活性，例如，與SCV-07具有充分同源性的SCV-07衍生 肽，使得其與SCV-07具有基本上相同的活性以基本上相同的方式起作用。根據(jù)一個實施方案，可以將式A化合物施用給受試者以在治療或預(yù)防期間在受試 者循環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的式A化合物。盡管根據(jù)本發(fā)明預(yù)見了長得多的治療 期，但是本發(fā)明的實施方案包括在至少約6個、10個、12個小時或更長的治療期期間在患者 循環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的式A化合物。在其它實施方案中，治療期為持續(xù)至少 約1天，并且甚至持續(xù)多天，例如，一周或更久。然而，如上所限定，認為其中在受試者的循 環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的式A化合物的治療可以被持續(xù)時間相似或不同的非治 療期分開。根據(jù)一個實施方案，在治療期期間將式A的化合物連續(xù)地輸注入受試者中，例如， 通過靜脈輸注，從而在受試者循環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的式A化合物?？梢酝ㄟ^ 任何合適的方法進行輸注，例如通過微型泵?；蛘?，可以保持式A化合物的注射方案從而在 受試者循環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的式A化合物。合適的注射方案可以包括每1、2、 4、6等小時注射，從而在治療期間在受試者的循環(huán)系統(tǒng)中基本上連續(xù)保持有效量的免疫調(diào) 節(jié)化合物肽。雖然認為在連續(xù)輸注式A化合物期間的施用會持續(xù)實際上更長的時間，但是根據(jù)一個實施方案，式A化合物的連續(xù)輸注持續(xù)至少約1小時的治療期。更優(yōu)選地，進行更長時 間的連續(xù)輸注，例如持續(xù)至少約6、8、10、12小時或更長的時期。在其它實施方案中，連續(xù)輸 注持續(xù)至少約1天，并且甚至持續(xù)多天，例如一周或更久。在一些實施方案中，式A化合物以約0.001-1000 iig/ml，更優(yōu)選約0. 1-100 u g/ml 范圍內(nèi)的濃度存在于藥學上可接受的液體載體中，例如注射用水、生理鹽水或類似物?？梢酝ㄟ^常規(guī)的劑量滴定實驗測定式A化合物的有效量。式A化合物也可以與其它藥劑一起施用。例如，對于癌癥治療，這些藥劑包括化療 藥物和/或放射?？梢酝ㄟ^任何合適的方法并以任何合適的劑量以及在本領(lǐng)域內(nèi)施用的給藥方案 施用放射。例如，放射可以以約lGy/分鐘的劑量率進行，并且放射可以例如如下進行，每天 兩劑，例如，約4Gy/劑，隔天施用，用一天不施用放射隔開。在治療方案中可以與式A化合物一起施用的化療劑包括任何合適的化療劑，例 如，但不限于順鉬、5-氟尿嘧啶(5-Fu)、DTIC和/或其它?？梢砸匀魏魏线m的劑量和/或 給藥方案施用這些化療劑，包括在本文的實施例中所提出的那些。實施例1縮寫CTX環(huán)磷酰胺F 雌性g 克IR 抑制率IP 腹膜內(nèi)Kg 千克L 長度M 雄性mL 毫升SC 皮下SD 標準偏差W 寬度彳既要在本研究中，測試SCV-07在C57/BL6小鼠中對鼠肺腫瘤生長的抑制性作用。為總 共70只小鼠中皮下植入鼠路易斯肺癌(Lewis lung cancer ;LLC)細胞，接著單獨用SCV-07 或環(huán)磷酰胺(CTX)或者其組合連續(xù)處理14天。通過皮下注射每天施用SCV-07，而隔天通 過腹膜內(nèi)注射施用CTX。總共使用了 7組第1組運載體；第2組CTX 20mg/kg ；第3組 CTX 40mg/kg ；第 4 組:SCV-075mg/kg ；第 5 組:SCV_0710mg/kg ；第 6 組SCV_075mg/kg 加上 CTX 20mg/kg ；第7組SCV_0710mg/kg加CTX 20mg/kg。每三天測量腫瘤體積和體重，并在 研究結(jié)束時即第16天(尸體剖檢日)測量腫瘤重量。在整個研究期間，在各組中均沒有發(fā)現(xiàn)動物死亡。此外，體重的統(tǒng)計結(jié)果顯示僅 SCV-07組與運載體對照組之間沒有顯著差異，表明SCV-07對動物的生長沒有影響。相比之 下，從第6天起，CTX處理組顯示了體重的顯著下降，特別是在施用高劑量CTX的組中。
對于腫瘤生長，在第3天，與第1組相比(運載體對照)，除第4組外的所有組顯示 了統(tǒng)計學上顯著的對腫瘤體積的抑制。在第6天，僅第2組和第3組顯示了抑制。在第9 天，第2組、第3組和第7組顯示了抑制。在第12天，除第4組外的所有組顯示了抑制。在 第15天，所有組的平均腫瘤大小在統(tǒng)計學上顯著小于第1組。在第16天，所有處理組的平 均腫瘤重量低于運載體對照組。第2組、第3組、第4組、第5組、第6組和第7組的腫瘤重 量抑制率分別為 45. 54% (ρ < 0. 01) ,90. 25% (ρ < 0. 01) ,18. 08% (ρ = 0. 07) ,30. 60% (ρ < 0. 01)、48· 57% (ρ < 0. 01)和 62. 63% (ρ < 0. 01)。總而言之，在本研究中使用的腫瘤模型是有效的，因為運載體組顯示了顯著的腫 瘤生長，而陽性對照藥物CTX有效地減少了腫瘤的生長。14天每天施用SCV-07 (10mg/kg) 顯著抑制了腫瘤生長。與運載體對照組相比，受處理動物中的腫瘤重量顯著降低。此外，次 優(yōu)劑量(suboptimal dose)的CTX (20mg/kg)與高劑量的SCV-07 (10mg/kg)的組合處理顯 示了提高的抗腫瘤效力。介紹 本研究用鼠肺癌模型測試SCV-07的抗腫瘤效果以探索其在肺癌中作為抗腫瘤藥 的潛力。將CTX用作陽性對照(positive control) 0也測試SCV-07和CTX的組合效果以 測定是否存在累加效果或協(xié)同效果。材料和方法測試和對照品將PBS用作陰性對照品(運載體)，而CTX作為陽性對照。CTX購自Sigma-Aldrich， 并分為IOmg/小瓶。加入PBS以達到在研究設(shè)計表中指明的適當劑量水平。將該制劑在冰 上保存、避光并立即使用。將測試品(SCV-07)溶解在PBS中以達到在研究設(shè)計表中指明的 適當劑量水平；在冰上保存、避光并在一周內(nèi)使用。測試系統(tǒng)和動物管理鼠肺癌細胞(LLC)鼠路易斯肺癌細胞獲得自中國醫(yī)學科學院細胞培養(yǎng)中心(Cell CultureCenter of Chinese Academy of Medical Sciences ;CAMS ；中華人民共和國，北京)。在用于實驗 前，將所述癌細胞在C57BL/6小鼠中進行適應(yīng)。細胞適應(yīng)(adaptation)的詳情請參見4. 3. 1 部分。測試系統(tǒng)35只雄性和35只雌性健康的首次用于實驗(naive)的C57BL/6小鼠是從中華人 民共和國北京CAMS的實驗動物科學研究院(Institute of LaboratoryAnimal Science) 收到的。這些動物為6周齡，并且在研究開始時重量為18至22克。動物管理動物被分組關(guān)在具有經(jīng)高壓滅菌的木屑作為鋪墊材料的經(jīng)高壓滅菌的鞋盒籠 (shoe box cage)里。動物房的溫度保持在22 25°C，并且相對濕度保持在40 60%。除 被研究相關(guān)的事件打斷外，保持12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。用無菌水和北京KeAoXieLi 嚙齒動物飼料(合格)自由(ad libitum)進行喂養(yǎng)。在腫瘤接種前使所有動物適應(yīng)環(huán)境 3天。實驗規(guī)程
腫瘤細胞適應(yīng)按照無菌組織培養(yǎng)規(guī)程，將一小瓶鼠肺癌細胞解凍并在20 25°C以IOOOrpm離心5分鐘。將細胞沉淀(cell pellet)懸浮在0. 5ml的生理鹽水(NS)中，并皮下注射入各小鼠 的右腋(約IX IO6細胞/小鼠)。當腫瘤直徑達到約Icm時，用CO2窒息處死(euthanize) 動物并切除腫瘤。將腫瘤細胞懸浮在前面所述的生理鹽水中，并再重復(fù)一次細胞適應(yīng)循環(huán)。腫瘤細胞接種將在體積為0. ImL的生理鹽水中的IX IO6LLC細胞皮下注射到小鼠的右腋區(qū)域 中。接種日定義為第0天。研究設(shè)計和處理方案在第1天，基于動物的體重將它們隨機分為7個不同的組，使得各組間的平均體 重在統(tǒng)計學上沒有顯著差異。在第1天開始給藥。以0. lmL/20g體重的劑量體積(dose volume)通過皮下(sc)施用連續(xù)14天每天一次施用SCV-07，并且以相同的劑量體積每隔 一天通過腹膜內(nèi)注射施用CTX。所述運載體也是每天一次連續(xù)14天通過皮下施用相同劑量 體積的PBS。所有組的處理方案概括于表1中。表1 處理方案和研究設(shè)計 抗腫瘤效果的評價在整個研究的過程中，每3天測量所有動物的腫瘤大小和體重，由測徑器測量腫 瘤大小，并用實驗室天平測量體重。每天監(jiān)測并記錄動物的死亡率和發(fā)病率。在第16天， 通過CO2窒息處死動物，并切除、分離和稱量腫瘤。使用如下公式計算腫瘤體積腫瘤體積=長度X寬度X寬度/2根據(jù)如下公式計算腫瘤體積抑制率(IR)IR(TV) = (TV運載體-TV藥物處理)/TV運載體X 100%其中，TV為測量日的腫瘤體積，“運載體”表示接受PBS的組，以及“藥物處理”表 示接受SCV-07和/或CTX的組。也通過腫瘤重量評估單獨使用SCV-07或與CTX —起組合使用的抗腫瘤效果。在處死后記錄各小鼠的腫瘤重量，并根據(jù)下面的公式計算腫瘤重量的抑制率IR(Tff)=(腫瘤重量運載體-腫瘤重量藥物處理)/腫瘤重量運載體X 100%使用Excel計算平均值和標準偏差。統(tǒng)計學分析使用斯氏t檢驗(student’ s ttest)在腫瘤體積、腫瘤重量和體重方面進行組內(nèi) 比較。P值小于0.05被認為是統(tǒng)計學上顯著的。結(jié)果與討論死亡率在本研究中沒有觀察到動物死亡。腫瘤大小腫瘤大小的原始測量數(shù)據(jù)列在附錄1-10中。計算的腫瘤抑制率和各處理組與運 載體組的統(tǒng)計比較列在表2-6中。腫瘤生長曲線示于圖1中。基于腫瘤體積數(shù)據(jù)，除第4組 外所有組在第3天顯示了對腫瘤生長的顯著抑制。第2組和第3組在第6天顯示了抑制。 在第9天，第2組、第3組和第7組的平均腫瘤大小在統(tǒng)計學上顯著小于第1組(運載體)。 在第12天，除第4組外，所有處理組的平均腫瘤大小在統(tǒng)計學上顯著小于第1組。在第15 天，所有組的平均腫瘤大小在統(tǒng)計學上顯著小于第1組。在組合處理組中，高劑量的SCV-07 與CTX顯示了累加效果。腫瘤重量腫瘤重量的原始數(shù)據(jù)示于附錄11中，而各處理組與運載體對照組之間的統(tǒng)計 比較結(jié)果列表于表7中。如表7中所示，所有處理組在第16天測量的平均腫瘤重量低 于運載體對照組。第2組、第3組、第4組、第5組、第6組和第7組的腫瘤抑制率分別 為 45. 54% (ρ < 0. 01)、90· 25% (ρ < 0. 01)、18. 08% (ρ = 0. 07)、30· 60% (ρ < 0. 01)、 48. 57% (ρ < 0. 01)和 62. 63% (ρ < 0. 01)。在第 2 組(CTX20mg/kg)與第 6 組(CTX 20mg/ kg+SCV-075mg/kg)之間在腫瘤抑制上沒有統(tǒng)計學上的顯著差異。相比之下，第7組(CTX 20mg/kg+SCV-0710mg/kg)中的抑制率在統(tǒng)計學上顯著大于第2組(CTX 20mg/kg)，表明當 組合使用CTX和SCV-07時的累加效果。圖2示例了在研究結(jié)束時(第16天)所有組的腫瘤重量。體重體重測量的原始數(shù)據(jù)列于附錄12-17中。各處理組與運載體組的統(tǒng)計比較結(jié)果列 于表8-13中。如所述表中所示，在第3天各處理組與運載體對照組之間無顯著差異。在第6天，第3組(CTX 40mg/kg)顯示體重抑制率為10. 82% (P < 0. 05)。其它組體重沒有顯 著差異。在第 9 天，第 2 組(CTX 20mg/kg)、第 3 組(CTX 40mg/kg)和第 6 組(CTX 20mg/ kg+SCV-075mg/kg)的抑制率分別為 12. 35% (ρ < 0.01)、16. 12% (ρ < 0.01)和 7. 22 % (ρ <0.01)。隨著在第6組中加入SCV-07，體重增加的抑制率降低。其它組的體重沒有顯 著差異，表明SCV-07對動物的體重增加沒有影響。在第12天，第2組(CTX 20mg/kg)、第 3 組(CTX 40mg/kg)和第 6 組(CTX 20mg/kg+SCV_075mg/kg)的抑制率分別為 14. 83% (ρ < 0. 01)、21· 97% (ρ < 0. 01)和 10. 28% (ρ < 0. 01)。在第 15 天，第 3 組(CTX 40mg/kg) 中的抑制率為25% (ρ <0.01)。其它組的體重沒有顯著差異。該結(jié)果表明CTX抑制體重增加可能是由于其毒性，而SCV-07可以部分保持抑制，可能是由于其減輕CTX毒性。結(jié)論和討論 總之，在本研究中使用的腫瘤模型是有效的，因為腫瘤生長可以被陽性對照藥物 CTX抑制。以10mg/kg每天施用測試品(test article) SCV-07持續(xù)14天針對腫瘤生長也 是有效的。從第12天起，與用運載體處理的對照組相比，所有SCV-07處理組的動物中的腫 瘤大小顯著減小。在接受單獨的10mg/kgSCV-07的組中和在接受組合療法的組中，在第16 天測量的腫瘤重量也顯著減少，而在接受單獨的5mg/kg SCV-07的組中卻不是這樣。此外， 與使用單獨的10mg/kg SCV-07或20mg/kg CTX時得到的30. 6%和45. 54%抑制相比，組合 使用10mg/kg SCV-07和20mg/kg CTX共同產(chǎn)生了 62. 63%對腫瘤生長的抑制。這些結(jié)果提 示組合使用SCV-07和CTX對腫瘤生長抑制產(chǎn)生累加效果。CTX處理組中平均動物體重顯著下降，表明其毒性作用。然而，隨著在組合療法 組中SCV-07的加入，顯示CTX的毒性作用至少部分地被SCV-07削弱。這種現(xiàn)象在第9天 顯現(xiàn)，當單獨的CTX 20mg/kg對體重增加產(chǎn)生統(tǒng)計學上顯著的抑制時，但是在組合處理組 (CTX 20mg/kg+SCV-0710mg/kg)中所述抑制被消除。我們沒有測試與對體重產(chǎn)生更顯著影 響的更高劑量的CTX(即，40mg/kg)組合的SCV-07的保護效果。SCV-07的保護效果，如果 在未來的研究中被證實，在考慮SCV-07和CTX的組合療法時會非常有用。總之，次優(yōu)劑量 的CTX(20mg/kg)與高劑量的SCV-07 (10mg/kg)的組合顯示了增加的抗腫瘤效力和較小的 毒性。表表2 在第3天腫瘤大小的統(tǒng)計結(jié)果 表3 在第6天腫瘤大小的統(tǒng)計結(jié)果 表4 在第9天腫瘤大小的統(tǒng)計結(jié)果 表5 在第12天腫瘤大小的統(tǒng)計結(jié)果 表6 在第15天腫瘤大小的統(tǒng)計結(jié)果 表7 在第16天腫瘤重量的統(tǒng)計結(jié)果 表9 在第3天體重的統(tǒng)計結(jié)果 表10 在第6天體重的統(tǒng)計結(jié)果 表11 在第9天體重的統(tǒng)計結(jié)果 表12 在第12天體重的統(tǒng)計結(jié)果
組號 組名 Γ^ΕΙ存活動 平均重量IR(Bff) % P值~ 表13 在第15天體重的統(tǒng)計結(jié)果 實施例2
評估SCV—07與放射組合在減少腫瘤生長中的功效
概要
在本研究中，使用小鼠中的H146肺癌模型測試在進行放射或不進行放射處理的情況下SCV—07對腫瘤生長的影響。用鹽水或SCV—07在進行或不進行放療的條件下每天一次處理帶有腫瘤的小鼠20天?；诖婊盥屎椭亓孔兓挠^察結(jié)果，在本研究中沒有證據(jù)顯 示SCV-07毒性，并且其不會改變H146腫瘤對放射的應(yīng)答。當單獨提供時，SCV-07以劑量依 賴的方式有效減少腫瘤生長，以lmg/kg每日兩次持續(xù)20天接受SCV-07的動物顯示9. 1% 的腫瘤生長抑制，以及以10mg/kg每日兩次持續(xù)20天接受SCV-07的動物顯示35. 9%的腫 瘤生長抑制。當與單劑的放療組合時，以10mg/kg每日兩次持續(xù)20天用SCV-07處理導(dǎo)致 78. 3%腫瘤生長抑制，或相對于單獨用放射處理的動物40. 5%的TGI?；谶@些觀察結(jié)果， 當單獨使用或者與放療組合使用時，SCV-07似乎都對減少肺癌模型中的腫瘤生長有效。目標使用小鼠中的NCI H146小細胞肺癌模型，評估SCV-07在作為單一療法和與放療 組合兩種情況下在抑制腫瘤生長方面的功效。研究設(shè)計將96只雌性裸小鼠(nu/nu)隨機指定為8個處理組。每只鼠在其左下脅用 Matrigel接種0. Iml體積的1 X IO5的NCI-H146 (H146)肺癌細胞。在腫瘤體積達到 75-125mm3時開始處理。按照表2. 1中所詳述的用運載體、放射、SCV-07或放射和SCV-07 處理各組。將藥物處理的開始指定為第1天。第1組和第4組中的小鼠通過皮下(sc)注 射接受運載體20天。第2-4和6-8組中的小鼠在第1至20天每天1次通過sc注射運載 體中的SCV-07，并且第6-8組中的小鼠接受放射(在第0和2天4Gy/劑，2劑)。使用氯胺 酮(120mg/kg)和甲苯噻嗪(6mg/kg)麻醉這些組的小鼠，并將它們置于鉛屏中使得有腫瘤 的脅區(qū)域暴露在放射中來進行放射。采用Philips 160kV源以約40cm的焦距給予放射，且 劑量率約為l.OGy/min。在整個研究期間隔日(on alternating days)測量腫瘤。第1-8 組中的小鼠在第21天被處死，并將剩余腫瘤切除、測量、稱重、拍照，并固定在福爾馬林中 用于后續(xù)分析。表2. 1SCI-05 研究設(shè)計 重量和存活率為了評定可能的毒性，每天稱量這些動物并記錄它們的存活率。在研究的過程中， 對任何顯示損失> 20%的起始體重的動物進行處死。對任何腫瘤生長超過4000mm3的動物 也進行處死。材料和方法組織培養(yǎng)H146人肺癌細胞獲得自ATCC。將這些細胞在補充有10%胎牛血清(FCS)、1%的 青霉素和鏈霉素、和2mM L-谷氨酰胺的DMEM中培養(yǎng)。通過除去培養(yǎng)基，用無菌的無鈣鎂磷 酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)清洗兩次，并加入1至2ml 0. 25%的胰島素/0. 03% EDTA溶液來 進行傳代培養(yǎng)。將燒瓶在37°C下溫育直至細胞分離(detach)。然后以1 3的比率傳代 培養(yǎng)細胞。研究進行的場所(Location of Study Performance)本研究是在Watertown MA的Biomodels AAALAC鑒定為合格的設(shè)備上進行的。本 研究的使用動物許可獲得自Biomodels IACUC。動物使用nu基因純合的(nu+/nu+) (Charles River Labs)、5至6周齡、平均處理前體 重為24克的雌性裸小鼠。使用耳部打孔對動物進行單獨編號，每只籠舍容納6只動物的組， 并且在研究開始前使其適應(yīng)環(huán)境。在至少2天的適應(yīng)期中，每天觀察動物以淘汰呈現(xiàn)差的 狀況的動物。飼養(yǎng)條件(housing)本研究在溫度為70° F+/-5。F以及相對濕度為50%+/-20%的、提供過濾空氣 的動物房內(nèi)進行的。將動物房設(shè)定保持每小時有至少12至15次換氣。該房間設(shè)有自動定 時器用于12小時開、12小時關(guān)的光照/黑暗循環(huán)，沒有微光。使用滅菌的鋪墊。這些鋪墊每周至少換一次。使用市售洗滌劑洗滌籠舍、臺面、瓶子等，并使其風干。在使用前，包裹這些物品并 進行高壓滅菌。使用市售的消毒劑消毒表面和引入到罩內(nèi)的材料。每天清掃地板，并用市 售洗滌劑拖地每周至少兩次。用稀釋的漂白劑溶液用海綿每月至少一次擦拭壁和籠架。用 具有識別研究、劑量、動物號和處理組的必要適當信息的籠卡或標簽標記所有籠舍。在研究期間記錄溫度和相對濕度，并且保持記錄。飲食用經(jīng)無菌Labdiet 5053 (預(yù)滅菌)的嚙齒動物飼料喂養(yǎng)動物并為動物自由提供 無菌水。動物隨機化和分配在開始處理前，將小鼠隨機且前瞻性地分成8組。各動物通過對應(yīng)于單獨編號的 耳部穿孔進行識別?；\卡用于識別各籠并標記有研究編號(SCI-05)、處理組編號和動物編號。
結(jié)果評定使用斯氏t檢驗、曼_惠特尼U檢驗和卡方分析用0. 05的臨界值測定各處理組之 間的統(tǒng)計差異。實驗規(guī)程使用測微計每兩天一次測量腫瘤，并按照4/3 π r3計算腫瘤體積，其中r等于長度 與寬度之和除以4。使用如下公式計算腫瘤生長指數(shù)100-(Vc*100/Vt)，其中Vc為對照組 中的腫瘤的平均體積，且Vt為測試組中的腫瘤的平均體積。結(jié)論和討論存活率在本研究的過程中沒有出現(xiàn)處理直接導(dǎo)致的動物死亡。動物重量在平均每日重量變化方面，在用運載體處理的組與接受SCV-07單一處理的動物 (P = 0. 7)之間或者在僅接受放射與接受結(jié)合有放射的SCV-07的動物之間(P = 0. 68) 沒有顯著差異。接受單獨的運載體的小鼠到第21天僅僅增加了它們起始重量的13. 2%。 用100口8/1^、1.01^/1^或101^/1^ SCV-07處理的小鼠到第21天增加了它們起始重量 的10. 2% -12. 3%。用運載體處理并暴露于放射的小鼠到第21天增加了它們起始重量的 3.2%。用100口8/1^、1.01^/1^或101^/1^ SCV-07處理并暴露于放射的小鼠到第21天增 加了它們起始重量的2. 8% -3. 6%。通過計算各動物百分比重量變化的曲線下平均面積(AUC)并使用單向ANOVA檢驗 (One-ffay ANOVA test)比較各組來評估這些差異的顯著性。腫瘤體積由隔日測量的長度和寬度大小來計算腫瘤體積，其通過計算平均半徑(r)并使用 計算體積的公式4 π r3/3來進行，所述平均半徑為長度和寬度之和除以4。用100 μ g/ml處理的動物的腫瘤以高于運載體對照動物的速率生長。在沒有受到 照射的動物中，用10mg/kg的SCV-07處理的小鼠顯示了最好的腫瘤生長抑制的改善。在研 究期結(jié)束時，用運載體處理的動物的平均腫瘤體積為4436. 6mm3,用100 μ g/kg SCV-07處理 的動物為4923mm3，用lmg/kg SCV-07處理的動物為4033. 4mm3，而用10mg/kg SCV-07處理 的動物為2842. 4mm3。在受到照射的動物之中，用10mg/kg SCV-07處理的小鼠顯示了最好的腫瘤生長抑 制的改善。在研究期結(jié)束時的平均腫瘤體積，用運載體處理的動物為1618. 5mm3，用100 μ g/ kg SCV-07處理的動物為1322. 3mm3，用lmg/kgSCV-07處理的動物為1923. 9mm3，而用IOmg/kg SCV-07處理的動物為962. 8mm3。
通過計算各動物腫瘤體積的曲線下平均面積(AUC)并使用單向ANOVA檢驗比較各 組來進一步分析數(shù)據(jù)。這些分析沒有顯示任何處理組與鹽水對照組之間的顯著差異(未受 照射的動物為ρ = 0. 13 ；而受到照射的動物為P = O. 14)。然而，使用曼-惠特尼秩和分析 (Mann-Whitney Rank Sum analysis)對用運載體處理與10mg/kg SCV-07的直接比較是差 異顯著的(P = 0. 026)。使用公式100-(Vc*100/Vt)計算腫瘤的生長抑制(TGI)，其中Vc為對照組中的 腫瘤平均體積，而Vt為測試組中的腫瘤的平均體積。表2. 2顯示單獨或者與放射組合用 100 μ g/kgUmg/kgUOmg/kg SCV-07處理的動物的腫瘤生長抑制。當與未受照射的對照相 比時，用單獨的lmg/kg SCV-07處理的動物具有9. 1 %的腫瘤生長抑制，而用單獨的IOmg/ kg SCV-07處理的動物具有35. 9%的腫瘤生長抑制。與未受照射的對照相比，用單獨的 放射處理的動物具有63. 5%的TGI，而用SCV-07加上放射處理的動物的TGI值為70. 2% (100yg/kg),50. 3% (lmg/kg) ^P 78.3% (10mg/kg)。當與接受放射加上運載體的組比較 時，用放射加上SCV-07處理的組在100μ g/kg的TGI為18. 3%，而在10mg/kg的TGI為 40. 5%。表 2. 2 表2. 2.腫瘤生長抑制(TGI)。由最終的腫瘤測量大小使用公式100-(Vc*100/Vt) 計算TGI，其中Vc為對照組中的腫瘤平均體積，以及Vt為測試組中的腫瘤平均體積。**第2和7組中的平均腫瘤體積超過運載體控制動物(分別為9. 8%和15. 87% )結(jié)論在本研究中基于存活率和重量變化的觀察結(jié)果，沒有證據(jù)顯示SCV-07的毒性。與運載體對照動物相比，用單獨的10mg/kg SCV-07處理的動物顯示了顯著減少的 腫瘤生長抑制(TGI = 68% ) (P = 0. 026)。盡管統(tǒng)計學上不顯著，與接受單獨的運載體的動物相比，用單獨的100yg/kg的 SCV-07或用單獨的lmg/kg SCV-07處理的動物顯示了腫瘤生長的減少。盡管統(tǒng)計學上不顯著，相對于受到照射的運載體對照動物，用100μ g/kg或IOmg/ kg SCV-07處理的受到照射的動物顯示了腫瘤生長的減少。附錄2. 3腫瘤重量(克)
CDDP 2mg/kg ；第 3 組:CDDP 6mg/kg ；第 4 組:SCV_0710mg/kg ；第 5 組:SCV_07，20mg/kg ；第 6 組:SCV-0710mg/kg 加上 CDDP 2mg/kg ；第 7 組:SCV_0720mg/kg 加上 CDDP 2mg/kg。每 3 天記錄一次體重，隔天測量一次腫瘤大小，并且在研究結(jié)束時即第16天(尸體剖檢日)測
量腫瘤重量。在整個研究期間，沒有動物死亡。體重的統(tǒng)計學結(jié)果顯示單獨SCV-07處理組(第 4和5組)與運載體對照組(第1組)之間沒有顯著差異，表明SCV-07對動物生長沒有影 響。相比之下，從第三天開始，接受6mg/kg的⑶DP處理的組(第3組)始終一貫地顯示在 體重方面統(tǒng)計學顯著的減少。第2組，即接受2mg/kg⑶DP處理的組，僅在第15天顯示了 統(tǒng)計學上顯著的體重降低，而第7組，其接受2mg/kgCDDP和20mg/kg SCV-07的組合，從第 三天開始相對于第1組始終一貫地顯示了統(tǒng)計學上顯著的體重降低。腫瘤測量數(shù)據(jù)顯示在第6天第2組和第3組的平均腫瘤體積在統(tǒng)計學上顯著小于 第1組。在第8、10、12、14天，所有組的平均腫瘤體積在統(tǒng)計學上顯著小于第1組。在第16 天，所有處理組的平均腫瘤重量均小于第1組。以腫瘤重量為基礎(chǔ)計算第2組、第3組、第4 組、第5組、第6組和第7組的腫瘤抑制分別為58. 90% (p < 0. 01) ,77. 35% (p < 0. 01)、 16. 84% (p < 0. 05)、37. 45% (p < 0. 01)、40. 81% (p < 0. 01)和 56. 13% (p < 0. 01)。綜上，本研究中使用的腫瘤模型是有效的，因為陽性對照藥物CDDP有效降低了腫 瘤生長。用SCV-07(10mg/kg或20mg/kg)的處理抑制了腫瘤生長，如通過這些組相對于運 載體對照組而言更小的腫瘤體積和更低的腫瘤重量所反映的。SCV-07(10或20mg/kg)與 ⑶DP(2mg/kg)組合的處理方案比單獨的SCV-07處理導(dǎo)致了更高的對腫瘤生長的抑制，但 是與單獨的CDDP比較沒有增加抗_腫瘤功效(無累加效果)。介紹將本研究設(shè)計用于評估在鼠路易斯肺癌(LLC)模型中單獨或與CDDP組合使用 SCV-07的抗腫瘤效果，以探索其用于肺癌處理中的處理潛能。⑶DP也用作驗證癌癥模型的 陽性對照藥物。材料和方法測試和對照品PBS被用做陰性對照品(運載體)，而⑶DP作為陽性對照。⑶DP購自PUMC醫(yī)院。 由齊魯制藥有限公司(Qilu Pharmaceuticla Co.，LTD)加工，每瓶藥物包含10mg CDDP粉 劑。在使用前，向一瓶⑶DP中加入PBS以達到如劑量配方表(表3.1)中所指明的適當?shù)?劑量水平。將該制劑在冰上保存、避光并立即使用。將測試品(SCV-07)溶解在PBS中以達 到如表1所指明的適當?shù)膭┝克剑辉诒媳４?，避光，并在一周?nèi)使用。表3. 1 劑量配方 測試系統(tǒng)和動物管理鼠肺癌細胞(LLC)鼠路易斯肺癌細胞獲得自中國醫(yī)學科學院細胞培養(yǎng)中心(CAMS;中華人民共和 國，北京)。在用于實驗前，將所述癌細胞在C57BL/6小鼠中進行適應(yīng)。細胞適應(yīng)的詳情請 參見4. 3. 1部分。測試體系35只雄性和35只雌性健康的首次用于實驗的C57BL/6小鼠是從中華人民共和國 北京CAMS的實驗動物科學研究院收到的。這些動物為6周齡，并且在研究開始時重量為18 至22克。動物管理動物被分組關(guān)在具有經(jīng)高壓滅菌的木屑作為鋪墊材料的經(jīng)高壓滅菌的鞋盒籠里。 動物房的溫度保持在22 25°C，并且相對濕度保持在40 60%。除被研究相關(guān)的事件打 斷外，保持12小時光照/12小時黑暗循環(huán)。用無菌水和北京KeAoXieLi嚙齒動物飼料(合 格)自由進行喂養(yǎng)。在腫瘤接種前使所有動物適應(yīng)環(huán)境3天。實驗規(guī)程腫瘤細胞適應(yīng)從液氮原種(liquid nitrogen stock)中取出一瓶LLC細胞，并放入37°C水浴。 輕微來回震蕩(gentle swriling)直到瓶里的內(nèi)容物解凍。使用無菌組織培養(yǎng)技術(shù)，立即 用TD5A-WS離心機將細胞在20-25°C下以lOOOrpm離心5分鐘。離心之后，將細胞懸浮于 0. 1-0. 5mL生理鹽水(NS)中然后皮下注射至10只小鼠內(nèi)(每只小鼠0. lmL,約1 X 106個 細胞)。1至2周之后，當腫瘤直徑約為1厘米時，用過量0)2處死動物并切除腫瘤。用另 外20只小鼠重復(fù)這些程序直到產(chǎn)生足夠數(shù)量有充分可移植性的LLC細胞。腫瘤細胞接種在腫瘤植入當天，將0. lmL約1. 2X 106個細胞皮下注射到每只小鼠的右腋區(qū)域。 將腫瘤植入日定義為第0天。研究設(shè)計和處理方案在第1天，將動物隨機分成不同的重量匹配組，并且根據(jù)表3. 2的方案開始給藥。 簡而言之，連續(xù)14天在不同于腫瘤細胞植入的部位每天一次經(jīng)皮下注射施用SCV-07，而在 第1、6和12天腹膜內(nèi)施用⑶DP。抗-腫瘤效果的評估從第1天到第14天，每天兩次檢驗死亡率和發(fā)病率，每3天記錄一次體重，且每兩天用測徑器測量一次腫瘤。在研究結(jié)束時(第16天)，通過C02窒息處死動物并切除腫瘤 和秤重。用以下公式計算腫瘤體積腫瘤體積=長度X寬度X寬度/2根據(jù)下面的公式計算腫瘤體積抑制(PI)PI (TV) = (TV運載體-TV藥物處理)/TV運載體X 100%其中，TV是測量日的腫瘤體積，“運載體”表示接受PBS的組，且“藥物處理”表示 接受SCV-07和/或⑶DP的組。也通過腫瘤重量評估了單獨或與⑶DP組合使用的SCV-07的抗腫瘤效果。處死之 后記錄每只小鼠的腫瘤重量，并根據(jù)下面的公式計算腫瘤重量的百分比抑制PI (Tff) = (TW運載體-TW藥物處理)/TW運載體X 100%用Excel計算平均值和標準偏差。表3. 2 處理方案和研究設(shè)計 統(tǒng)計學分析使用斯氏t檢驗在腫瘤體積、腫瘤重量和體重方面進行組內(nèi)比較。P值小于0. 05 被認為是統(tǒng)計學上顯著的。結(jié)果與討論死亡率在整個研究過程中沒有動物死亡。腫瘤大小腫瘤大小的原始測量數(shù)據(jù)列表示于附錄3. 1-3. 14中。計算的平均腫瘤體積和每 個處理組相對于運載體組的統(tǒng)計檢驗結(jié)果列表示于表3-9。在第二天，任何組的腫瘤均無法 測量。第4天，除了第4組外的所有組中平均腫瘤體積在統(tǒng)計學上顯著小于第1組(運載 體組)。第6天，僅第2組和第3組顯示了較小的平均腫瘤體積。第8、10、12和14天，所有組的平均腫瘤體積均在統(tǒng)計學上顯著小于第1組。腫瘤重量在第16天測量的腫瘤重量的原始數(shù)據(jù)列表示于附錄3. 15。根據(jù)腫瘤重量計算 的百分比抑制(PI)值和在每個處理組與運載體組之間進行的統(tǒng)計學比較結(jié)果列表示于表 3. 10。如表3. 10中所示，所有組的平均腫瘤重量均低于運載體組。第2組、第3組、第4組、 第 5 組、第 6 組和第 7 組的 PI 值分別為 58. 90% (p < 0. 01) ,77. 35% (p < 0. 01) ,16. 84% (p < 0. 05)、37. 45% (p < 0. 01)、40. 81% (p < 0. 01)和 56. 13% (p < 0. 01)。雖然組合 處理組(如第6組和第7組)比相應(yīng)的僅接受SCV-07處理的組(即，第4組和第5組) 的PI值高，但是這些PI值卻并不比僅接受⑶DP處理的第2組高。任一組合處理組與僅用 ⑶DP處理的組(第2組)的PI值之間在統(tǒng)計學上均沒有顯著差異，表明當組合使用⑶DP 和SCV-07時無累加效果。體重體重測量的原始數(shù)據(jù)示于附錄3. 16-3. 21中。對每個處理組相對于運載體組的統(tǒng) 計比較結(jié)果列表示于表3. 11-3. 16中。如表3. 11-3. 16中所示，第0天在每個處理組和運載體組之間在統(tǒng)計學上無顯著 差異。第 3 天，第 3 組(CDDP 6mg/kg)和第 7 組(CDDP 2mg/kg+SCV-0720mg/kg)相對于運載 體組在體重上分別顯示了 9. 33% (P < 0. 01)和8. 31% (P < 0. 01)的降低。其它組與運 載體組相比在體重上沒有統(tǒng)計學顯著差異。第6天，第3組和第7組的體重比運載體組低 10. 45% (p < 0. 01)和6. 58% (p < 0. 01)。第9天，第3、6和7組的體重比運載體組分別 低 14. 51% (p < 0. 01)、8. 70% (p < 0. 05)和 11. 41% (p < 0. 01)。第 12 天，第 3 組和第 7組的體重比運載體組分別低13. 62% (p < 0. 01)和6. 65% (p < 0. 05)。第15天，第2、 3、6 和 7 組的體重比運載體組分別低 12. 51% (p< 0.01),24. 38% (P < 0. 01) ,10. 42% (P < 0. 05)和14. 56% (P < 0. 01)。在整個研究過程中，僅接受SCV-07處理的第4組和第5 組的體重在統(tǒng)計學上無顯著差異，表明單獨使用SCV-07時，對動物體重無顯著影響。相反， ⑶DP處理與體重損失有關(guān)，并且在接受高劑量(6mg/kg)⑶DP的第3組中觀察的尤為顯著。 組合使用SCV-07和⑶DP并沒有緩解體重損失，但是事實上可能使⑶DP-相關(guān)的體重損失 更顯著。在接受⑶DP與高劑量SCV-07的第7組中記錄了比僅接受⑶DP的第2組中更大 的體重損失。結(jié)論和討論總而言之，本研究中所用的腫瘤模型是有效的，因為陽性對照藥物CDDP抑制了腫 瘤生長。以10mg/kg和20mg/kg每天施用測試品SCV-07針對腫瘤生長是有效的。從第8 天起，與運載體對照組相比，所有SCV-07處理組動物中的平均腫瘤體積顯著減小。在單獨 接受10mg/kg或20mg/kg SCV-07的組中和接受組合療法的組中在第16天測量的腫瘤重 量也顯著減少。組合使用10mg/kg或20mg/kg SCV-07與2mg/kg CDDP產(chǎn)生了 40. 81 %和 56. 13%的腫瘤生長抑制，相比之下單獨使用10mg/kg或20mg/kg SCV-07獲得了 16. 84%和 37. 45%抑制，而單獨使用2mg/kg或6mg/kg CDDP時獲得了 58. 90%和77. 35%抑制。這些 結(jié)果提示組合使用SCV-07和CDDP對于腫瘤生長的抑制沒有產(chǎn)生累加效果。⑶DP處理組中的平均體重顯著降低，表明其毒性作用。單獨使用時，在所有 SCV-07-處理組中SCV-07未引起任何統(tǒng)計學上顯著的體重損失，表明SCV-07對動物體重沒
47有影響。然而，當將SCV-07與⑶DP組合使用時，其可能加重與⑶DP-相關(guān)的體重損失，因 為在第7組中記錄了較大的重量損失，該組在整個研究過程中接受與高劑量SCV-07組合的 CDDP。表表3. 3 第2天平均腫瘤體積(cm3) 表3. 4 第4天平均腫瘤體積(cm3) 表3. 5 第6天平均腫瘤體積(cm3)
表3. 6 第8天平均腫瘤體積(cm3)
表3. 9 第14天平均腫瘤體積(cm3) 表3. 10 第16天平均腫瘤重量(g) 表3· 11 第0天平均體重(g) 表3. 12 第3天平均體重(g) 表3· 13 第6天平均體重(g) 表3· 14 第9天平均體重(g) 表3· 15 第12天平均體重(g) 表3. 16 第15天平均體重(g)實施例4
在體外SCV-07對B16、LLC和RenCa細胞系增值的影響
縮寫5-Fu 5-氟尿嘧啶CV 變異系數(shù)DMEM Dulbecco 氏改良 Eagle 氏培養(yǎng)基DMF N，N-二甲基甲酰胺DTIC 5-(3，3-二甲基-1-三氮烯)咪唑-4-甲酰胺FBS 胎牛血清LLC 路易斯肺癌MTT 甲基噻唑基聯(lián)苯四唑溴化物(MethylthiazoIyldiphenyl-tetrazoIium bromide)NA 不適用OD 吸光度PBS 磷酸緩沖鹽水RPMI Roswell Park Memorial InstituteSD 標準偏差SDS 十二烷基硫酸鈉SOP 標準操作規(guī)程VBI Vital Bridge(China), Inc.Vs 比較概要進行本研究以評估在體外SCV-07對B16、LLC和RenCa細胞的細胞毒性作用。在12種不同濃度(包括空白對照)的SCV-07或陽性對照藥物(即DTIC、5_Fu和 順鉬)存在下在96孔板中培養(yǎng)B16、LLC或RenCa細胞。SCV-07的濃度根據(jù)血漿濃度近似 于之前體內(nèi)研究的有效劑量的來選擇。5-Fu和順鉬的濃度按照文獻報道的各自的IC5tl值 來選擇。SCV-07和陽性對照藥物的溫育時間從24到72小時變化。藥物對細胞增殖的抑制 效果由MTT法來測定。5-Fu和順鉬的處理在相應(yīng)的細胞系中導(dǎo)致了顯著的細胞毒性效果。5-Fu抑制 B 16細胞增殖的IC50值在三次測定中分別估計為0. 26,0. 38和0. 26 μ g/mL。在RenCa細 胞中，5-Fu的IC50值在三次測定中分別估計為0. 03,0. 04和0. 04 μ g/mL。順鉬抑制LLC 細胞增殖的IC5tl值在三次測定中分別估計為3. 26,3. 07和3. 10 μ g/mL。所有測試濃度的 SCV-07 (0. 05-100 μ g/mL)在培養(yǎng)的B16、LLC和RenCa細胞中均不抑制細胞增殖。SCV-07 的IC5tl值由于缺少對其濃度_抑制曲線的擬合而沒有獲得?？偠灾狙芯孔C明了 SCV-07在培養(yǎng)的B16、LLC和RenCa腫瘤細胞中無體外細 胞毒性效果。介紹本研究的目的是評估在體外SCV-07對B16、LLC和RenCa細胞的細胞毒性效果。SCV-07是免疫調(diào)節(jié)劑。其在之前的體內(nèi)研究中已經(jīng)被證實抑制皮下植入小鼠的腫 瘤細胞(B 16、LLC或RenCa)的生長(1_3)。在本研究中，評估了 SCV-07在體外對這些腫瘤 細 胞系的細胞毒效性果。
在SCV-07或陽性對照藥物(DTIC、5_Fu或順鉬)存在下在96孔板中培養(yǎng)B16、LLC 和RenCa細胞。在不同細胞系中藥物的溫育時間從24至72小時變化。使用MTT測定法評定對細胞增殖的抑制。材料和方法材料SCV-07SCV-07 (Lot#RR002101)由贊助者提供。通過將 4. 2mg SCV-07 溶解在 8. 4mL 無菌 Dulbecco 氏 PBS (Invitrogen，Cat#14190-144)中制備了濃度為 0. 5mg/mL 的 SCV-07 原液 (stock solution) 0然后將原液無菌過濾，在2至8°C下保存，并用錫紙遮光。使用之前，用 培養(yǎng)基將原液進一步稀釋成不同的濃度。DTICDTIC 購自 Sigma (Cat. #D2390, Lot#026K1363)。通過將 8. 8mg DTIC 溶解在 500 μ L 的0. IN HCI中再加入380 μ L Milli-Q水制備了 10mg/mL的原液。制成后，將原液無菌過 濾，在2至8°C下保存，并用錫紙遮光。使用之前，用培養(yǎng)基將原液進一步稀釋成不同的濃度。5-FU5-Fu 購自 Sigma (Cat. #F6627, Lot#125K1499)。通過將 4. 8mg 5_Fu 溶解在 9. 6mL 無菌 Dulbecco 氏 PBS (Invitrogen，Cat. #14190-144)中制備了 0. 5mg/mL 的原液。制成后， 將原液無菌過濾，在2至8°C下保存，并用錫紙遮光。使用之前，用培養(yǎng)基將原液進一步稀釋 成不同的濃度。順鉬順鉬購自齊魯制藥有限公司。通過將IOmg順鉬溶解在IOmL無菌Dulbecco氏 PBS(Invitrogen，Cat. #14190-144)中制備了 lmg/mL的原液。制成后，將原液無菌濾過并 在2至8°C下保存。使用之前，用培養(yǎng)基將原液進一步稀釋成不同濃度。其它材料MTT 購自 Sigma (Cat. #M2128)。FBS、青霉素-鏈霉素、DMEM 和 RPMI-1640 培養(yǎng)基 購自 Invitrogen。Falcon 96孔平底板(BD，Cat. #353072)購自 Fisher Scientific。測試體系B16細胞的培養(yǎng)B16黑素瘤細胞系從中國科學院上海細胞庫獲得。將細胞在補充有10% FBSU00 單位/mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。LCC細胞的培養(yǎng)LCC細胞系從中國科學院上海細胞庫獲得。將細胞在補充有10% FBSU00單位/ mL青霉素和100 μ g/mL鏈霉素的DMEM中培養(yǎng)。RenCa細胞的培養(yǎng)RenCa細胞系從中國軍事科學院獲得。將細胞在補充有10% FBS、100單位/mL青 霉素和100 μ g/mL鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。MTT測定法根據(jù)VBI SOP 65. 026實施MTT測定法。簡言之，用上述相應(yīng)的培養(yǎng)基制備了 B16、LLC或RenCa細胞的懸液。向Falecm 96孔平底板的每個孔中接種100 μ L細胞懸液。接種 密度是每孔10000個細胞(Β16和LLC細胞系)或每孔7000個細胞(RenCa細胞系)。通 過向平板加入25 μ L藥物進行藥物處理，然后將平板在37°C、5% CO2條件下溫育一段預(yù)先 確定的時間(藥物處理詳情參見表4.1)。藥物處理為12種不同濃度包括空白對照，每個 濃度測試一式四份。SCV-07的濃度根據(jù)血漿濃度近似于之前體內(nèi)研究的有效劑量來選擇。 5-Fu和順鉬的濃度按照文獻中報道的它們各自用于相應(yīng)細胞系的IC5tl值來選擇。藥物處 理以后，以終濃度lmg/mL向每個孔中加入MTT，并繼續(xù)細胞溫育4小時。在MTT溫育結(jié)束 時，向平板中加入由SDS和DMF組成的提取緩沖液以通過活細胞溶解從MTT中轉(zhuǎn)化的甲臘 (formazan) 然后用Tecan Inf initeM200平板閱讀器在570nm測量每個孔的0D。表4. 1藥物處理設(shè)計 抑制細胞增殖的IC5tl 是用 Prism 5. 01 (GraphPad Software, Inc.)計算的。將導(dǎo)
致殺死細胞的藥物濃度排除在IC5tl的測定之外。用下面的公式估計IC5tl
Y _ I極俏. 最高值-最低值
γ -珉低值 + J + 10 tK-ToglCbU)-其中，X表示藥物的濃度，且Y表示相應(yīng)的0D。最低值表示OD理論上的最低值(對 應(yīng)于細胞生長的最大抑制)，而最高值表示OD理論上的最高值。IC50表示產(chǎn)生50%應(yīng)答 的藥物濃度。在輸入所有X和Y值后，最低值、最高值和IC5tl的值通過擬合到內(nèi)置抑制模式 (即，Log[抑制劑]vs相應(yīng)模型)由程序自動測定。結(jié)果SCV-07對B16細胞的影響測量了 SCV-07和陽性對照藥物對B16細胞增殖的效果。計算的IC5tl值列于表4. 2 中。原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD列表示于附錄4. 1-4. 4中。SCV-07的濃度-抑制曲線 基本是平坦的，表示SCV-07對B16細胞無細胞毒性作用(即，抑制細胞增殖)。DTIC最初被用作陽性對照。然而，僅在高濃度(即，250和500yg/mL)注意到了細胞毒性效果，并且 由于曲線不能收斂而無法確定IC5tl值。這可能是由于DTIC缺乏肝細胞依賴性的活化。觀 察從0. 2至20 μ g/mL濃度范圍內(nèi)的5-Fu對細胞生長的抑制。50和100 μ g/mL導(dǎo)致殺死細 胞。因此這兩個濃度排除在IC5tl分析之外。5-Fu在三次測定中測定的IC5tl值為0.26、0.38 和0. 26 μ g/mL。相反，由于缺乏擬合的濃度-抑制曲線而未獲得SCV-07的IC5tl值。
表4. 2B16細胞的生長抑制的IC5tl “_”表示因沒有擬合而沒有得到的IC5tl值。NT 未測試。SCV-07對LLC細胞的影響測量了 SCV-07和順鉬(陽性對照藥物)對LLC細胞增殖的影響。計算的IC5tl值列 于表4. 3中。原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD列表示于附錄4. 5-4. 7中。SCV-07的濃度-抑 制曲線是基本上平坦的，表明在LCC細胞中無細胞毒性。相反，對于濃度為1.0yg/mL及以 上的順鉬觀察到了細胞毒性效果。順鉬在三次測定中的IC50值為3. 26,3. 07和3. 10 μ g/ mL，而由于缺乏擬合的濃度-抑制曲線而無法確定SCV-07I的IC5tl值。表4. 3LLC細胞的生長抑制的IC5tl “_”表示因缺乏擬合而沒有得到的IC5tl值。SCV-07對RenCa細胞的影響 測量了 SCV-07和5-Fu (陽性對照藥物)對RenCa細胞增殖的影響。計算的IC50列 于表4. 4中。原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD列表示于附錄4. 8-4. 10中。SCV-07的濃度-抑 制曲線是基本上平坦的，表示在RenCa細胞中無細胞毒性。相反，對于濃度為0. 05-10 μ g/ mL范圍的5-Fu觀察到了細胞毒性效果。20、50和100 μ g/mL導(dǎo)致殺死細胞。因此這三個 濃度排除在IC50分析之外。5-Fu在三次測定中的IC50值為0. 03,0. 04和0. 04 μ g/mL。相 比之下，由于缺乏擬合的濃度_抑制曲線而沒有獲得SCV-07的IC5tl值。表4. 4RenCa細胞的生長抑制的IC5tl “_”表示因缺乏擬合而沒有得到的IC5tl值。結(jié)論和討論在相應(yīng)的細胞系中5-Fu和順鉬的處理導(dǎo)致了對細胞增殖的顯著抑制，驗證了這 種測定法用于測定測試化合物的潛在細胞毒性的有效性。5-Fu在三次測定中抑制B16細胞 增殖的IC5tl值估計為0. 26,0. 38和0. 26 μ g/mL。在RenCa細胞中，5_Fu在三次測定中估計 的IC5tl值為0. 03,0. 04和0. 04 μ g/mL。順鉬在三次測定中估計的抑制LLC細胞增殖的IC5tl 值為3. 26,3. 07和3. 10 μ g/mL。在較高濃度(即，250和500 μ g/mL)下記錄了 DTIC的細 胞毒性。在較低的DTIC濃度缺乏可察的細胞毒性與肝細胞將DTIC代謝轉(zhuǎn)化為毒性更大的 代謝物的需要相一致，這些代謝物沒有包括在本研究中。與陽性對照藥物的顯著細胞毒性形成鮮明的對比，在培養(yǎng)的B16、LLC或RenCa細 胞中SCV-07未導(dǎo)致對細胞增殖的抑制。由于缺乏對其濃度_抑制曲線的擬合而沒有獲得 SCV-07 的 IC5tl 值。SCV-07不存在細胞毒性效果與典型的通過激活免疫系統(tǒng)發(fā)揮其效果的免疫調(diào)節(jié) 劑的作用機理相符。然而，應(yīng)該注意的是由SCV-07衍生的代謝物的細胞毒性效果還有待測 定。與DTIC—樣，肝細胞-介導(dǎo)的SCV-07的代謝活化可能是細胞毒效果的必要前提。利 用SCV-07代謝物或由肝細胞和腫瘤細胞組成的細胞培養(yǎng)物體系的研究可有助于進一步確 定在SCV-07用于腫瘤治療的作用機理中細胞毒性的作用?？偠灾?，本研究證實了在本實驗條件下SCV-07對培養(yǎng)的B16、LLC和RenCa腫瘤 細胞沒有體外細胞毒性作用。附錄4. 1 =MTT測定11280701的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07 對 DTIC)細胞系 B16(10000細胞/孔)藥物處理時間 24小時 附錄4. 2 =MTT測定法12050701的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07 對 5-FU)細胞系 Β16(10000細胞/孔)藥物處理時間 24小時 附錄4. 3 =MTT測定法12050702的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD
藥物處理(SCV-07 對 5-FU) 細胞系 Β16(10000細胞/孔)藥物處理時間 24小時
附錄4. 4 =MTT測定法12050703的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD
藥物處理(SCV-07 對 5-FU)細胞系 B16(10000細胞/孔)藥物處理時間 24小時 附錄4. 5 =MTT測定法12060704的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07對順鉬)細胞系 LLC(10000細胞/孔)藥物處理時間 48小時 附錄4. 6 =MTT測定法12060705的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07對順鉬)細胞系LLC(10000細胞/孔)藥物處理時間 48小時 附錄4. 8 =MTT測定法12070704的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07 對 5-Fu)細胞系 RenCa(7000細胞/孔)藥物處理時間 72小時 附錄4. 9 =MTT測定法12070705的原始數(shù)據(jù)和計算的平均值和SD藥物處理(SCV-07 對 5-Fu)細胞系RenCa(7000細胞/孔) 藥物處理時間 72小時
權(quán)利要求
一種治療方法，其用于在受試者中治療、至少部分預(yù)防、抑制或減少肺癌、其轉(zhuǎn)移或來自肺外部的癌的肺中轉(zhuǎn)移，或者用于治療、至少部分預(yù)防、抑制或減少肺癌細胞、其轉(zhuǎn)移或來自肺外部的癌細胞的肺中癌細胞轉(zhuǎn)移的生長，該方法包括給受試者施用有效量的式A的免疫調(diào)節(jié)化合物其中，n為1或2，R為氫、?；?、烷基或肽片段，以及X為芳族或雜環(huán)氨基酸或其衍生物，如此在所述受試者中治療、至少部分預(yù)防、抑制、或減少所述肺癌、所述其轉(zhuǎn)移或所述來自肺外部的癌的肺中轉(zhuǎn)移，或者如此治療、至少部分預(yù)防、抑制或減少所述肺癌細胞、所述其轉(zhuǎn)移或所述來自肺外部的癌細胞的肺中癌細胞轉(zhuǎn)移的生長。FPA00001113404100011.tif
2.權(quán)利要求1的方法，其中X為L-色氨酸或D-色氨酸。
3.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物為SCV-07。
4.權(quán)利要求1的方法，其中以約0.001-1000mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
5.權(quán)利要求1的方法，其中以約0.01-100mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
6.權(quán)利要求1的方法，其中以約0.00001-1000mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用所 述化合物。
7.權(quán)利要求1的方法，其中以約0.01-100mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物為SCV-07，并且以約0.001-1000mg范圍內(nèi)的劑量施用。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述化合物為SCV-07，并且以約0.00001-1000mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用。
10.權(quán)利要求3的方法，其中所述治療用于原發(fā)性肺癌。
11.權(quán)利要求10的方法，其中以約0.001-1000mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
12.權(quán)利要求10的方法，其中以約0.l-100mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
13.權(quán)利要求10的方法，其中以約0.00001-1000mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用 所述化合物。
14.權(quán)利要求10的方法，其中以約0.01-100mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用所述 化合物。
15.權(quán)利要求3的方法，其中所述治療用于肺癌轉(zhuǎn)移。
16.權(quán)利要求15的方法，其中以約0.001-1000mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
17.權(quán)利要求15的方法，其中以約0.l-100mg范圍內(nèi)的劑量施用所述化合物。
18.權(quán)利要求15的方法，其中以約0.00001-1000mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用 所述化合物。
19.權(quán)利要求15的方法，其中以約0.01-100mg/kg受試者體重范圍內(nèi)的劑量施用所述 化合物。
20.權(quán)利要求12的方法，其中所述劑量為約10mg。
21.權(quán)利要求17的方法，其中所述劑量為約10mg。
22.權(quán)利要求1的方法，其中在治療方案中施用所述式A的化合物，所述治療方案額外 包括施用放射或化療劑中的至少一種。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述化療劑包括順鉬、5-FU或DTIC中的至少一種。
全文摘要
在受試者中施用免疫調(diào)節(jié)化合物以治療、預(yù)防、抑制或減輕肺癌。
文檔編號A01N43/38GK101842009SQ200880112940
公開日2010年9月22日 申請日期2008年8月21日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月23日
發(fā)明者辛西亞·W·塔特希爾 申請人:賽生制藥有限公司