專利名稱：：用于反芻動物的酶產(chǎn)品的制作方法用于反芻動物的酶產(chǎn)品本申請要求于2007年6月29日提交的美國專利申請序列號60/937，840的優(yōu)先權(quán)，其通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
：本發(fā)明概括地涉及反芻動物營養(yǎng)物，更具體地涉及在反芻動物營養(yǎng)物中使用酶混合物以改善反芻動物飼料的營養(yǎng)價(jià)值。反芻動物的胃由四個隔室組成瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃。在這四個隔室中，瘤胃最重要，因?yàn)榇蟛糠譅I養(yǎng)素在該隔室中被消化。瘤胃形成的囊為背囊、腹囊、后背(caudodosal)囊和后腹(caudoventral)囊。囊的形成增加有效吸收的表面積。瘤胃中的消化是在無氧環(huán)境、恒定的溫度和pH以及充分混合的條件下的發(fā)酵過程。通過細(xì)菌的完全培養(yǎng)實(shí)現(xiàn)該發(fā)酵過程，細(xì)菌各自在消化如纖維素水解、半纖維素水解、蛋白質(zhì)水解、酸生成、甲烷生成、維生素合成等中發(fā)揮不同的作用。發(fā)酵的產(chǎn)物或者在瘤胃本身中被吸收，或者流出以進(jìn)行進(jìn)一步消化和下游吸收。除了瘤胃之外，皺胃是另一個重要的隔室。皺胃是"真正的胃"，其與單胃動物的胃非常相似。它分泌酸以維持酸性環(huán)境。不同于單胃動物的胃，皺胃分泌溶菌酶并因此能夠消化細(xì)菌。反芻動物的飼料通常由精飼料和粗飼料組成。粗飼料通常是指草料和青貯飼料。草料是指牧草、豆類、可啃牧的喬木和纖維作物副產(chǎn)品。該飼料中的主要營養(yǎng)素包括淀粉、纖維、蛋白質(zhì)、脂肪和油。淀粉通常在瘤胃或者皺胃中被降解，而纖維、蛋白質(zhì)和脂肪/油一般在瘤胃中被瘤胃細(xì)菌降解。纖維被纖維素分解細(xì)菌和半纖維素分解細(xì)菌消化并轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性脂肪酸(VFA)。蛋白質(zhì)或者避開瘤胃，或者被蛋白質(zhì)分解細(xì)菌降解并轉(zhuǎn)化為最終被皺胃利用的微生物蛋白質(zhì)。脂肪/油被脂酶轉(zhuǎn)化為脂肪酸，其被瘤胃壁吸收。作為典型的反芻動物飼料的主要成分，草料通常是指牧草、豆類和纖維作物副產(chǎn)品例如稻草和玉米秸桿。將草料轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的效率受限于草料細(xì)胞壁的消化率。植物細(xì)胞壁通常占典型草料的干物質(zhì)的40-70%，甚至在理想條件下，總消化道內(nèi)的細(xì)胞壁消化率一般仍然低于65%。因此，草料消化率成為能量利用率的瓶頸，并且使動物不能達(dá)到最佳生產(chǎn)力。更糟糕的是，由于缺乏高質(zhì)量的草料，經(jīng)常用低質(zhì)量的草料喂養(yǎng)反芻動物。因?yàn)榈唾|(zhì)量的草料具有非常低的營養(yǎng)價(jià)值，進(jìn)一步限制了反芻動物家畜的生產(chǎn)力。近年來，已有一些嘗試以改進(jìn)草料的消化率。數(shù)量有限的反芻動物酶產(chǎn)品投放市場。這些酶產(chǎn)品中許多僅僅是單胃對應(yīng)物的衍生品，而其它的顯示出無法預(yù)測的有效性。然而，部分是由于認(rèn)為添加的酶不能提高瘤胃的水解能力的看法，以及對這樣的酶會因瘤胃蛋白質(zhì)水解而無效的擔(dān)心，研究者尚未成功地使用酶來提高反芻動物飼料的利用。一些近期的研究已反駁了這些誤解。一些研究已表明在某些實(shí)例中，向反芻動物飼料中添加外源性纖維水解酶(fibrolyticenzymes)提高了產(chǎn)乳量(Schingoethe等，1999;Kung等，2000)和平均日增重(ADG)(McAllister等，1999)。這些改善動物性能的實(shí)例是因?yàn)樵鰪?qiáng)了飼料消化。許多研究已報(bào)道了通過原位和體外方法測定的干物質(zhì)(DM)和纖維的消化的增強(qiáng)(Beauchemin等，2000;Kung等，2000)。但是，只有纖維素酶和木聚糖酶不足以對反芻動物發(fā)揮出最佳潛力。一些其它因素，包括P-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶，可能是限制因素。因此，把這些酶包括在內(nèi)以釋放植物細(xì)胞壁中的能量是非常重要的。—些公司宣傳他們的產(chǎn)品是乳品特異性的或者反芻動物特異性的。但是，這些產(chǎn)品具有兩個缺陷。首先，幾乎所有他們的產(chǎn)品均包含淀粉酶。和其它動物一樣，反芻動物需要葡萄糖來進(jìn)行正常的生理功能。淀粉通常在瘤胃中被代謝成揮發(fā)性脂肪酸，或者在皺胃(abmason)中被代謝成葡萄糖。如果淀粉在瘤胃中消化太快并留給皺胃極少量的淀粉來產(chǎn)生葡萄糖，則反芻動物可能沒有充足的葡萄糖來滿足正常的生物需要。因此，優(yōu)選淀粉避開瘤胃并在皺胃中被消化。因此，淀粉酶不應(yīng)被包含在反芻動物的飼料添加劑中。實(shí)際上，一些農(nóng)民甚至使用淀粉酶抑制劑以幫助淀粉避開瘤胃。而且，在瘤胃添加劑中把淀粉酶包含在內(nèi)可能引起酸中毒。其次，這些產(chǎn)品不具有完整的酶分布。需要除了包含作為反芻動物的酶添加劑所公知的木聚糖酶和纖維素酶之外，還包含P-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的產(chǎn)品。反芻動物消耗大量的豆類和牧草，因此這些酶對理想的消化率是重要的。但是，在出售的現(xiàn)有產(chǎn)品中缺乏這些酶。因此，需要基于非常常見的反芻動物飼料的對纖維的消化率進(jìn)行改善的酶產(chǎn)品。發(fā)明概述本發(fā)明由酶產(chǎn)品組成，其消除或者減少纖維中的限制因素以改善草料中纖維的消化率。該酶產(chǎn)品代表若干纖維素分解酶和半纖維素分解酶的獨(dú)特組合。此酶產(chǎn)品顯著地改善在瘤胃環(huán)境中常用的草料飼料的消化。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，1克酶產(chǎn)品包含約200至約800活性單位之間的纖維素酶，約750至約3000活性單位之間的木聚糖酶，約225至約890活性單位之間的13-葡聚糖酶，約1至約100活性單位之間的果膠酶，約50至約800活性單位之間的P-甘露聚糖酶，和約l至約100活性單位之間的a-半乳糖苷酶。本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實(shí)施方案1克產(chǎn)物包含約200至約600活性單位之間的纖維素酶，約750至約2250活性單位之間的木聚糖酶，約225至約625活性單位之間的P-葡聚糖酶，約1至約5活性單位之間的果膠酶，約100至約300活性單位之間的13-甘露聚糖酶，和約1至約5活性單位之間的a-半乳糖苷酶。本發(fā)明的一個目的是減少或者消除在纖維消化中的限制因素并釋放出更多能量。本發(fā)明的另一個目的是將已報(bào)道的改善能量利用的淀粉酶排除，幫助維持正常的葡萄糖水平，并且降低酸中毒的可能性。附圖簡述圖1是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案對苜蓿12h和24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量(Gp)和24h時(shí)的體外有機(jī)物消化率(OMD)的影響的圖表；對照(左側(cè)柱)是未經(jīng)酶處理的空白；處理(右側(cè)柱)的劑量是1000g/T。圖2是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案對羊草(Chinesewildrye)12h和24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量(Gp)和24h時(shí)的體外有機(jī)物消化率(OMD)的影響的圖表；對照(左側(cè)柱)是未經(jīng)酶處理的空白；處理(右側(cè)柱)的劑量是1000g/T。圖3是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案對全株玉米青貯12h和24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量(Gp)和24h時(shí)的體外有機(jī)物消化率(OMD)的影響的圖表；對照(左側(cè)柱)是未經(jīng)酶處理的空白；處理(右側(cè)柱)的劑量是1000g/T。圖4是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案對模擬全混合日糧(TMR)(苜蓿玉米大豆=50:30:20)24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量(Gp)和24h時(shí)的體外有機(jī)物消化率(0MD)的影響圖表；對照(左側(cè)柱)是未經(jīng)酶處理的空白；處理(右側(cè)柱)的劑量，從左側(cè)第二柱起分別是500g/T、1000g/T和2000g/T。圖5是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案對提取自黑麥草的中性洗滌纖維(NDF)24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量(Gp)和24h時(shí)的體外有機(jī)物消化率的影響的圖表；對照(左側(cè)柱)是未經(jīng)酶處理的空白；處理(右側(cè)柱)的劑量是1000g/T。圖6是本發(fā)明的酶產(chǎn)品對模擬TMR飼料24h時(shí)的體外產(chǎn)氣量的影響的圖表。圖7表示圖6的模擬TMR飼料中的有機(jī)物消化率(OMD)。圖8是本發(fā)明的酶產(chǎn)品對黑麥草NDF24h時(shí)的體外纖維消化率的影響的圖表。圖9是在瘤胃液體存在下纖維素酶和木聚糖酶的穩(wěn)定性的圖表。圖10是在測試期間產(chǎn)乳量的趨勢圖。圖11是酶樣品對乳成分的影響的圖表。圖12是酶樣品對SCC的影響的圖表(柱內(nèi)帶有不同字母的平均值存在差異(P<0.05))。圖13是實(shí)施例12中的產(chǎn)乳量的趨勢圖。圖14是酶樣品對產(chǎn)乳量(Kg/d)的影響的圖表(P值如圖所示)。圖15是酶樣品對乳脂肪的影響的圖表(P值如圖所示)。圖16是酶樣品對乳品蛋白質(zhì)的影響的圖表(P值如圖所示)。圖17是酶樣品對SCC的影響的圖表(P值如圖所示)。圖18是在實(shí)施例13中產(chǎn)乳量的趨勢圖。圖19是酶樣品對產(chǎn)乳量的影響的圖表(P值如圖所示)；a，b_柱內(nèi)帶有不同字母的平均值存在顯著性差異(P<0.01)。圖20是酶樣品對乳脂肪的影響的圖表(P值如圖所示)；A，B，C-帶有符號后不同字母的平均值存在差異(P<0.05)。圖21是酶樣品對乳蛋白質(zhì)的影響的圖表(P值如圖所示)。圖22A和22B是酶樣品對乳糖(圖22A)和NFS(圖22B)的影響的圖表(P值如圖所示)；a，b-帶有符號后不同字母的平均值存在顯著性差異(p<0.01)。圖23是酶樣品對SCC的影響的圖表(P值如圖所示)；a，b_帶有符號后不同字母的平均值存在顯著性差異(P<0.01)。優(yōu)選實(shí)施方案詳述本發(fā)明提供了適合在乳牛飼料中使用以改善草料消化的酶產(chǎn)品。用纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶、13-葡聚糖酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的組合生產(chǎn)所述酶產(chǎn)品。所述產(chǎn)品中的其它配料可以包括，但不限于，載體、調(diào)味劑和酶穩(wěn)定化合物。在此方法中使用的酶配料可以是液體或者固體?？梢詫⒐腆w酶與其它配料直接混合?？梢允紫葘⒁后w酶噴灑在載體上，然后與其它配料混合。在與草料混合之前可以將所述酶產(chǎn)品施用于種子濃縮物?？梢詫⑺雒府a(chǎn)品施用于乳牛、綿羊、羔羊和山羊的日糧。該酶產(chǎn)品的優(yōu)選劑量取決于反芻動物飼料。本領(lǐng)域技術(shù)人員會認(rèn)識到，該劑量取決于飼料中纖維的百分比和纖維的組成。典型的劑量在100-2000g/噸處理的草料之間。在優(yōu)選實(shí)施方案中，對于每噸飼料產(chǎn)品的最終施用在300，OOO和12，000，000酶活性單位之間。可以任選地施用該酶，作為飼料添加劑施用于反芻動物的精飼料中，作為在全混合日糧(TMR)混合期間的配料施用，或者作為在自制全價(jià)飼料混合期間的成分施用。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，1克酶產(chǎn)品包含約200至約800活性單位之間的纖維素酶，約750至約3000活性單位之間的木聚糖酶，約225至約890活性單位之間的P_葡聚糖酶，約1至約100活性單位之間的果膠酶，約50至約800活性單位之間的13-甘露聚糖酶，約1至約IOO活性單位之間的a-半乳糖苷酶。本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實(shí)施方案1克酶產(chǎn)品包含約200至約600活性單位之間的纖維素酶，約750至約2250活性單位之間的木聚糖酶，約225至約625活性單位之間的13-葡聚糖酶，約1至約5活性單位之間的果膠酶，約100至約300活性單位之間的13-甘露聚糖酶，約1至約5活性單位之間的a-半乳糖苷酶。對具有這些范圍之間的酶成分活性的酶產(chǎn)品進(jìn)行了制備和測試。體外評價(jià)相對于未經(jīng)處理的標(biāo)準(zhǔn)系列飼料樣品，測定了本發(fā)明的酶產(chǎn)品的影響。Menke等于1979年建立的并于1988年得到發(fā)展的體外方法是模擬體內(nèi)發(fā)生的消化過程的經(jīng)典方法。在此方法中，瘤胃液體由被插入套管的反芻動物得到并在某些條件下與底物飼料一起溫育。因?yàn)樵诖朔椒ㄖ邪l(fā)現(xiàn)體外產(chǎn)氣量和體內(nèi)消化率之間存在高度相關(guān)性(Menke等，1979;Menke等，1988)，所以測量產(chǎn)氣量作為消化率和代謝能含量水平的指標(biāo)。此方法已表明產(chǎn)氣量和動物體內(nèi)性能之間的高度一致性。在最近二十年中，廣泛地應(yīng)用此方法來評價(jià)草料的營養(yǎng)價(jià)值。三只發(fā)育完全的綿羊被用作供體動物并安裝瘤胃套管。在相同的時(shí)間內(nèi)(8:30，am;4:30，pm)用相同的飼料(30%精飼料和70%干草)喂養(yǎng)全部三只供體動物。在收集瘤胃液體之前，需要8小時(shí)或者更長的日間間隔。供體綿羊的實(shí)驗(yàn)用飼料的配料和化學(xué)組成如表l所示。表l.供體綿羊的實(shí)驗(yàn)用飼料的配料和化學(xué)飽成<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>"*"計(jì)算值，其它是測量值按照Menke等(1988)所述采集并處理瘤胃液體。簡言之，在早晨喂養(yǎng)之前，從三只瘤胃插入套管的綿羊采集瘤胃液體。用吸瓶(suctionbottle)(約2L)收集液體。用中間帶孔的橡皮塞密封此瓶，并通過管連接至略彎的PVC導(dǎo)管(直徑約10mm)。通過瘤胃套管，將在遠(yuǎn)端具有約十個小孔的導(dǎo)管導(dǎo)入瘤胃。使用手動操作的真空泵從瘤胃吸出瘤胃液體。按照Menke等(1988)所述將來自三只綿羊的瘤胃液體與厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液(1:2，v/v)混合，在預(yù)熱至39t:的水浴中帶到實(shí)驗(yàn)室，通過四層干酪包布過濾，并保存在充滿C02的溫?zé)岬慕^熱瓶中。在39t:振蕩水浴中，在充滿30ml用緩沖液處理的瘤胃液體的100ml注射器中溫育添加酶的樣品(200mg，DM)。使用無酶添加劑的空白樣品作為對照。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中一式三份地進(jìn)行。在0、2、4、6、9、12和24h記錄產(chǎn)氣量。用Menke給出的等式從24h時(shí)的產(chǎn)氣量計(jì)算底物24h時(shí)的有機(jī)物消化率(OMD24h):0MD24h，％=0.986XGp24h+0.0606XCP%+11.3其中0MD24h、Gp24h和CP分別是24h時(shí)的有機(jī)物消化率、24h時(shí)的產(chǎn)氣量和底物的粗蛋白含量。使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS(v6.12，1996)，通過T檢驗(yàn)比較數(shù)據(jù)。當(dāng)p<0.05時(shí)表明有差異，當(dāng)p<0.01時(shí)表明有顯著性差異。在第一輪溫育中，使用乳牛的模擬全混合日糧(TMR)來研究酶對TMR消化的影響。模擬TMR的配料如表2所述。表2.樽擬TMR的配料<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>在第二輪中，使用純NDF作為底物來研究酶配方對纖維消化的影響。按照Robertson和VanSoest(1981)以及VanSoest等(1991)所述，從黑麥草提取NDF。簡言之，黑麥草經(jīng)淀粉酶處理，然后用中性洗滌劑清洗。在39t:下，將提取的NDF整夜浸沒在1M硫酸銨((NH4)2S04)溶液中，以除去礦質(zhì)狀態(tài)的微量洗滌劑(Schofield和Pe11，1995)。然后分步地在熱水和乙醇中清洗樣品，用多孔板過濾至坩堝中，然后在5(TC下烘干。通過方法WI-KAE-021、WI-KAE-022和KCCM-005(參見以下酶測定)測定纖維素酶、木聚糖酶、P-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶的活性。對于表5、7、9和11使用所謂的瘤胃方法。瘤胃方法與相應(yīng)的上述方法相同，只是瘤胃方法中的溫育條件(使用39t:和pH6.0)不同。制備酶樣品在實(shí)驗(yàn)室中，為第一輪發(fā)酵制備了4種初始的酶配方，稱為KAC023-001、KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004。主要的酶活性如表3所示。以0.5g/Kg、1.0g/Kg和2.0g/Kg的劑量將酶加入底物中。表3.各酶的活件，U/g<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>基于第一輪發(fā)酵的結(jié)果，選擇最好的配方KAC023-004，并進(jìn)一步優(yōu)化成兩個新的配方，KAC023-005和KAC023-006。主要的酶活性如表4所示。以1.Og/Kg的劑量將樣品加入純的黑麥草NDF中，并在體外產(chǎn)氣法中與空白對照一起溫育。表4.肝m二誦i細(xì)維口口口,藩，U/g<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>以與產(chǎn)氣測試相似的方法測定瘤胃中纖維素酶和木聚糖酶的穩(wěn)定性，只是使用的劑量顯著更高(100kg/T)以使來自內(nèi)源性酶活性的噪音最小化。底物與KAC023-005或者KAC023-006連同瘤胃液體一起溫育。在0、1、2、4、6和12h測定這兩種酶的活性。按照以下等式計(jì)算剩余活性與初始活性的比，其用于反映瘤胃中酶的穩(wěn)定性。比，％=(At-A0)X100/At，其中，At和AO是th和Oh時(shí)的酶活性。酶測定方法WI-KAE-022甘露聚糖酶是能夠切斷含有甘露糖單元的多糖鏈的酶。甘露聚糖酶將剌槐豆膠(Locustbeangum)甘露聚糖底物水解成還原糖單元。還原糖與3，5-二硝基水楊酸(DNS)反應(yīng)。產(chǎn)生的顏色變化與釋放的還原糖(以甘露糖表示)的量成正比，繼而與存在于樣品中的甘露聚糖酶的活性成正比。通過將14.7g(+/_0.Olg)檸檬酸三鈉溶于900ml去礦質(zhì)水中，然后用去礦質(zhì)水稀釋至1000ml來配制50nM檸檬酸鈉緩沖溶液。通過將10.5g(+/_0.Olg)—水合檸檬酸溶于900ml去礦質(zhì)水中，然后用去礦質(zhì)水稀釋至1000ml來配制50mM檸檬酸緩沖溶液。通過將0.5gSigma剌槐豆膠甘露聚糖溶于70ml檸檬酸緩沖液(pH5.3)中，然后攪拌20分鐘或者直至甘露聚糖完全溶解來配制0.5%(w/v)剌槐豆膠甘露聚糖底物。用檸檬酸鈉緩沖液(pH5.3)稀釋至100ml，并檢測底物溶液的最終pH為5.3(+/-0.05)。通過在環(huán)境條件下的瓶中將1.6g氫氧化鈉溶于70ml去礦質(zhì)水中來配制3，5-二硝基水楊酸(DNS)溶液100ml。加入lg3，5-二硝基水楊酸(DNS)，接著加入30g酒石酸鉀鈉，并用去礦質(zhì)水稀釋至100ml。在室溫下該DNS溶液可以保存1個月。通過用50mM擰檬酸鈉緩沖液(pH5.3)溶解O.lg(+/-0.OOlg)甘露糖，然后使用100ml容量瓶加滿至100ml來配制1000yg/ml甘露糖儲備溶液。通過用檸檬酸鈉緩沖液稀釋適量的甘露糖儲備溶液來配制含有0到500g/ml之間(以50g/ml遞增)的標(biāo)準(zhǔn)甘露糖溶液。在磁攪拌器上(燒杯)，在Yml緩沖液中提取Xg(+/-0.Olg)樣品10分鐘。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在緩沖液中將該溶液稀釋Z倍。移取0.9ml0.5%底物溶液至試管中(應(yīng)測定各樣品兩次)。在5(TC的水浴中溫育此混合物2分鐘。啟動計(jì)時(shí)器并立即以30秒的間隔將0.1ml酶溶液加入試管中。在Vortex混合器上充分振搖各管，并將管重置于水浴中。在5(TC的水浴中精確地溫育試管IO分鐘。通過加入1.5mlDNS溶液，以30秒的間隔終止反應(yīng)，并充分振搖以終止反應(yīng)。在對照管中，加入DNS溶液后，加入酶溶液。對于甘露糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，移取1000ill至各試管中，然后加入1.OmlDNS。將試管置于沸水浴(IO(TC)中5分鐘。冷卻并在540nm讀取光密度?！钚詥挝皇窃诮o定的測定條件下，每60分鐘從甘露聚糖釋放lmg甘露糖的酶的其中f=稀釋因子=YxZxl/X。方法WI-KAE-005a-半乳糖苷酶從pNP-a_D_吡喃半乳糖苷釋放對硝基苯酚。通過分光光度法可以測定釋放的對硝基苯酚的量，它是a-半乳糖苷酶活性的量度。通過將18.45g(+/-0.Olg)檸檬酸三鈉和2.62g(+/-0.Olg)檸檬酸溶于225ml去礦質(zhì)水中來配制檸檬酸鈉緩沖溶液(pH5.5，0.25M)。檢測pH(5.5±0.1)，并且如果需要，用NaOH或者擰檬酸調(diào)節(jié)。用去礦質(zhì)水稀釋至250ml。當(dāng)與要求的pH相比pH變化大于0.05單位時(shí)棄去。通過將15(±0.1)mg對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷溶于5ml去礦質(zhì)水中來配制對硝基苯基-a-D-吡喃半乳糖苷的溶液。通過將5g(+/_0.01g)Na2C03溶于100ml去礦質(zhì)水中來配制5%Na2C03溶液。在磁攪拌器上，在Yml緩沖液中提取Xg(+/-0.Olg)樣品10分鐘。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在緩沖液中將溶液稀釋Z倍。將1ml檸檬酸鈉緩沖液、0.2ml0.OlMpNP-a_D_吡喃半乳糖苷和0.4ml去礦質(zhì)水置于試管中。在37°C的水浴中溫育此混合物5分鐘。啟動計(jì)時(shí)器，并立即以30秒間隔將0.4ml酶溶液加入試管中。在Vortex混合器上充分振搖各管，并將管重置于水浴中。在37t:的水浴中精確地溫育試管15分鐘。通過加入2ml5%Na2C03溶液，以30秒的間隔終止反應(yīng)，并充分振搖以終止反應(yīng)。在對照管中，加入化20)3溶液后，加入酶溶液。以水為對照，在410nm讀取吸光度?！钚詥挝皇窃诮o定的測定條件下，每分鐘從pNP-a-D-比喃半乳糖苷釋放1Pmol對硝基苯酚的酶的量。對硝基苯酚的摩爾消光系數(shù)是18240M—^m—、em=A/C*l=18240M—丄cm—1其中A是吸光度，C是摩爾濃度，而1是程長。U/g=(A樣品一A空白)氺36.55*f/1000其中f=稀釋因子=YxZxl/X。方法WI-KAE-021P-葡聚糖酶與P-葡聚糖反應(yīng)釋放出葡萄糖。纖維素酶復(fù)合物將纖維素水解成低分子量的還原碳水化合物，主要是葡萄糖和纖維二糖。戊聚糖酶(木聚糖酶)水解木聚糖。果膠酶水解果膠。轉(zhuǎn)化酶使蔗糖分子斷裂成果糖和葡萄糖，它們是還原糖。然后按照Somogyi-Nelson法測定所形成的還原糖。反應(yīng)條件<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>通過將25.Og碳酸鈉(無水)、25.Og四水合酒石酸鉀鈉、20.0g碳酸氫鈉和200.Og硫酸鈉(無水)溶于950ml去礦質(zhì)水中并稀釋至1000ml來配制Nelson試劑A(1000ml)。通過將15.Og五水合硫酸銅(II)溶于100ml去礦質(zhì)水中來配制Nelson試劑B(100ml)。加入兩滴濃硫酸H2S04。通過在燒杯中將25mlNelson試劑A與1mlNelson試劑B混合來配制Nelson試劑C(26ml)。通過將50.Og四水合七鉬酸銨溶于800ml去礦質(zhì)水中來配制Nelson顏色試劑(砷鉬酸鹽)(lOOOml)。加入42ml濃硫酸H2S04。將6.0申酸鈉(Na2HAs047H20)溶于50ml去礦質(zhì)水中，然后將其加入鉬酸鹽溶液中。使用容量瓶用去礦質(zhì)水加滿至1000ml。該試劑應(yīng)是黃色而無綠色著色。13葡聚糖酶測定在磁攪拌器上(燒杯)，在Yml緩沖液中提取乂8(+/-0.Olg)樣品10分鐘。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在緩沖液中將該溶液稀釋Z倍。移取lmL最終溶液至試管中。此時(shí)空白仍是空的。一式兩份地測定樣品。移取lmL各標(biāo)準(zhǔn)溶液至相應(yīng)的管中，用去礦質(zhì)水作為零標(biāo)準(zhǔn)。在精確的37t:的水浴中，將試管預(yù)熱5分鐘。以30秒的間隔，將lml0.5%e-葡聚糖底物加入各管。在Vortex混合器上充分振搖各管，并將管重置于37°C的水浴中。在37t:下精確地將管溫育30分鐘。以30秒的間隔，將lmlNelson試劑C加入各管，并充分振搖以終止反應(yīng)。將lml樣品的最終溶液加入樣品空白管中，并將它們充分振搖。將管置于沸水浴(IO(TC)中20分鐘。冷卻并將lmlNelson顏色試劑加入所有試管中，并在Vortex混合器上充分振搖。將5ml去礦質(zhì)水加入各管，并在Vortex混合器上充分振搖。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在540nm讀取光密度。纖維素酶測定在磁攪拌器上(燒杯)，在￥!11緩沖液中提取乂8(+/-0.0化)樣品10分鐘。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在緩沖液中將該溶液稀釋Z倍。移取lml最終溶液至試管中。此時(shí)空白仍然是空的。一式兩份地測定樣品。移取lml各標(biāo)準(zhǔn)溶液至相應(yīng)的管中，用去礦質(zhì)水作為零標(biāo)準(zhǔn)。不預(yù)熱試管。以30秒的間隔，將lmlCMC底物加入各管。在Vortex混合器上充分振搖各管。將管置于5(TC的水浴中。在5(TC下精確地將管溫育20分鐘。以30秒的間隔，將lmlNelson試劑C加入各管中，并充分振搖以終止反應(yīng)。將lml樣品的最終稀釋液加入樣品空白管，并充分振搖。將管置于沸水浴中20分鐘。冷卻并將lmlNelson顏色試劑加入所有試管中，并在Vortex混合器上充分振搖。將5ml1120加入各管，并在Vortex混合器上充分振搖。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在540nm讀取光密度。木聚糖酶測定在磁攪拌器上(燒杯)，在Yml緩沖液中提取Xg(+/-0.01g)樣品10分鐘。離心5分鐘以得到澄清的酶溶液(>1，700g在離心機(jī)上)。在緩沖液中將該溶液稀釋Z倍。移取lml最終溶液至試管中。此時(shí)空白仍然是空的。一式兩份地測定樣品。移取lml各標(biāo)準(zhǔn)溶液至相應(yīng)的管中，用去礦質(zhì)水作為零標(biāo)準(zhǔn)。不預(yù)熱試管。以30秒的間隔，將lml0.5%木聚糖底物加入各管。在Vortex混合器上充分振搖各管并將管重置于5(TC的水浴中。在50°C下精確地將管溫育15分鐘。以30秒的間隔，將lmlNelson試劑C加入各管，并充分振搖以終止反應(yīng)。將lml最終溶液加入樣品空白管中，并充分振搖。將管置于沸水浴(IO(TC)中20分鐘。冷卻并將lmlNelson顏色試劑加入所有試管，并在Vortex混合器上充分振搖。將5ml去礦質(zhì)水加入各管，并在Vortex混合器上充分振搖。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在540nm讀取光密度。果膠酶測定在磁攪拌器上，在Yml緩沖液中提取Xg(+/_0.01g)樣品10分鐘(NB:對于脂質(zhì)包衣的酶(lipid-coatedenzymes)如RonozymeVP(CT)，加入5滴10%吐溫20溶液，并攪拌5分鐘。然后超聲處理15分鐘，然后再攪拌樣品5min)。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在緩沖液中將該溶液稀釋Z倍。移取lml最終溶液至試管中。此時(shí)空白仍然是空的。一式兩份地測定樣品。移取lml各標(biāo)準(zhǔn)溶液至相應(yīng)的管中，用去礦質(zhì)水作為零標(biāo)準(zhǔn)。在精確的37t:的水浴中預(yù)熱試管5分鐘。以30秒的間隔，將lml底物溶液加入各管。在Vortex混合器上充分振搖各管，并將管重置于37°C的水浴中。在37t:下精確地將管溫育15分鐘。以30秒的間隔，將lmlNelson試劑C加入各管，并充分振搖以終止反應(yīng)。將lml最終溶液加入樣品空白管中，并充分振搖它們。將管置于沸水浴(IO(TC)中20分鐘。冷卻并將lmlNelson顏色試劑加入所有試管，并在Vortex混合器上充分振搖。將5ml去礦質(zhì)水加入各管，并在Vortex混合器上充分振搖。離心以得到澄清的酶溶液(>1，700g，5分鐘)。在540nm讀取光密度。j±E—活性單位等于在該測定指定的條件下，每分鐘釋放1Pg糖等價(jià)物的酶的量。基于標(biāo)準(zhǔn)樣品的結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并從該曲線確定糖等價(jià)物的量。稀釋因子應(yīng)對各活性提供分別在下列范圍間的反應(yīng)吸光度以使其保持在該測定的線性范圍內(nèi)。<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>[o川]果,試劑空白吸光度應(yīng)小于O.02以得到準(zhǔn)確的結(jié)果。若其大于O.02，則稀釋樣品并重復(fù)測定，除非樣品的吸光度低于O.100。當(dāng)分析AsplelaseF及其結(jié)束的產(chǎn)物時(shí)，由于原料中還原糖的存在，第2點(diǎn)會不適用。綠鵬藩:將10.51g檸檬酸溶于950ml去礦質(zhì)水中。用10MNaOH調(diào)至pH5.3。使用容量瓶用去礦質(zhì)水稀釋至1L。當(dāng)與要求的pH相比pH變化大于0.05單位時(shí)，棄去該緩沖溶液。木聚糖底物(0.5%)稱量0.508(+/-0.018)樺木木聚糖(SigmaX-0502)，并加入100mlpH5.3檸檬酸緩沖溶液。在攪拌的同時(shí)，煮沸此溶液10分鐘。冷卻底物至5(TC。建議的保存時(shí)間是l天。D(+)-木糖儲備溶液1000yg/ml用去礦質(zhì)水溶解O.lg(+/-0.OOlg)無水木糖，并使用100ml容量瓶加滿至100ml。雄碰麵如下稀釋木糖儲備溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>纖維素酶活件:將7.90g三水合乙酸鈉或者4.lg無水乙酸鈉溶于950ml去礦質(zhì)水中。用冰醋酸將pH調(diào)節(jié)至pH4.8。使用容量瓶用去礦質(zhì)水稀釋至1L。當(dāng)與要求的pH相比pH變化大于0.05單位時(shí)，棄去該緩沖溶液。CMC-底物(羧甲某纖維素)將0.40g(+/-0.OOlg)CMC粉末緩慢地加入100mlpH4.8乙酸鹽緩沖溶液。在室溫下攪拌直至完全溶解。建議的保存時(shí)間冰箱中2周。使用前，在9(TC下加熱該底物25分鐘，并冷卻至50°C。葡萄糖儲備溶液(100(^g/ml)用去礦質(zhì)水溶解O.lg(+/_0.OOlg)無水葡萄糖并使用100ml容量瓶加滿至100ml。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液如下稀釋葡萄糖儲備溶液葡萄糖(嗎/ml)稀釋的儲備溶液1000昭/ml去礦質(zhì)水<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>404ml稀釋至100ml505ml稀釋至100mlP葡聚糖酶活性:將2.35g磷酸二氫鉀和14.72g二水合磷酸氫二鈉溶于950ml去礦質(zhì)水中。用INNa0H(若pH<7.5)或者用INHC1(若pH>7.5)調(diào)節(jié)pH。使用容量瓶用去礦質(zhì)水稀釋至1L。當(dāng)與要求的pH相比pH變化大于0.05單位時(shí)，棄去該緩沖溶液。P-葡聚糖底物(0.5%)稱量0.508(+/-0.0化)來自大麥的P-葡聚糖，中等粘度(由Megazyme提供)。加入100mlpH7.5緩沖溶液。在約7(TC的水浴中攪拌的同時(shí)，溶解此混合物(約10至15分鐘)。使底物冷卻至37t:。建議的保存時(shí)間是l天。葡萄糖儲備溶液(1000yg/ml)用去礦質(zhì)水溶解0.lg(+/_0.OOlg)無水葡萄糖并用100ml容量瓶加滿至100ml。gf娜碰麵如下稀釋葡萄糖儲備溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>將10.51g檸檬酸溶于950ml去礦質(zhì)水中。用10MNaOH調(diào)節(jié)至pH4.0。使用容量瓶用去礦質(zhì)水稀釋至1L。當(dāng)與要求的pH相比pH變化大于0.05單位時(shí)，棄去該緩沖溶液。聚半乳糖醛酸底物O.15%稱量O.15g(+/-0.Olg)聚半乳糖醛酸鈉鹽(SigmaP-3850)。加入lOOmlpH4.0緩沖溶液。攪拌并在8(TC下加熱此溶液15分鐘。使底物冷卻至37t:。建議的保存時(shí)間是l天。D(+)-半乳糖醛酸儲備溶液1000yg/ml用去礦質(zhì)水溶解0.109g(+/-0.OOlg)半乳糖醛酸(一水合物)并用100ml容量瓶加滿至100ml。半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)溶液如下稀釋半乳糖醛酸儲備溶液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>實(shí)施例l-對某于苜蓿的草料的影響以lOOOg/噸的劑量，將代表本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案的酶產(chǎn)品KAC023-005與苜蓿底物混合。在100ml注射器中，將200毫克(200mg)該混合物與30ml用厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液處理的瘤胃液體一起溫育。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中，一式三份地進(jìn)行。在12h和24h時(shí)記錄產(chǎn)氣量。從24h時(shí)的產(chǎn)氣量計(jì)算底物24h時(shí)的有機(jī)物消化率(0MD24h)。結(jié)果如圖l所示。使用1000g/T劑量的酶引起苜蓿的0MD-24h增長3.2X。棚列2-X條轉(zhuǎn)剖媳柳條卩向以1000g/噸的劑量，將KAC023-005與羊草底物混合。在100ml注射器中，將200毫克(200mg)該混合物與30ml用厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液處理的瘤胃液體一起溫育。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中，一式三份地進(jìn)行。在12h和24h時(shí)記錄產(chǎn)氣量。結(jié)果如圖2所示。酶的添加使羊草的Gp-24h和0MD-24h分別顯著地增加10.9%和7.6%(p<0.01)。棚列3-X寸針干.綠貝亡,柳條卩向以1000g/噸的劑量，將酶產(chǎn)品KAC023-005與基于玉米青貯的底物混合。在100ml注射器中，將200毫克(200mg)該混合物與30ml經(jīng)厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液處理的瘤胃液體一起溫育。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中，一式三份地進(jìn)行。在12h和24h時(shí)記錄產(chǎn)氣量。結(jié)果如圖3所示。全株玉米青貯的Gp-24h和0MD-24h分別顯著地(p<0.01)增加16.2%和12.1%。實(shí)施例4-對全混合日糧的影響以500g/噸、lOOOg/噸和2000g/噸的劑量，將酶產(chǎn)品KAC023-005與模擬TMR的飼料混合。在100ml注射器中，將200毫克(200mg)該混合物與30ml經(jīng)厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液處理的瘤胃液體一起溫育。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中，一式三份地進(jìn)行。在12h和24h時(shí)記錄產(chǎn)氣量。結(jié)果如圖4所示。當(dāng)用不同劑量的酶處理時(shí)，Gp-24h和0MD-24h極大地增加(P<0.01)。Gp-24h的增加值隨著劑量的增加而升高。但是，數(shù)據(jù)表明當(dāng)以1000g/T的劑量加入酶時(shí)，產(chǎn)氣量可以達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)(P>0.05)。換言之，用1000g/T底物的劑量，酶的作用達(dá)到飽和。實(shí)施例5-對黑麥草中性洗滌纖維的影響以1000g/噸的劑量，將酶產(chǎn)品KAC023-005與提取自黑麥草的中性洗滌纖維(NDF)底物混合。在100ml注射器中，將200毫克(200mg)該混合物與30ml經(jīng)厭氧緩沖液/礦物質(zhì)溶液處理的瘤胃液體一起溫育。進(jìn)行兩輪溫育，在各輪溫育中，一式三份地進(jìn)行。在24h時(shí)記錄產(chǎn)氣量。結(jié)果如圖5所示。當(dāng)在體外溫育時(shí)，酶使黑麥草NDF的OMD-24h增長18.3X(p<0.01)。此結(jié)果表明酶產(chǎn)品能夠提高纖維的消化率。實(shí)施例6_附加的TMR測試對模擬TMR進(jìn)行第二次測試。24h時(shí)產(chǎn)氣量的結(jié)果如圖6所示。配方KAC023_002、KAC023-003和KAC023-4均有效地改善了產(chǎn)氣量。在使用的三種劑量即0.5g/kg、lg/kg和2g/kg下，還觀察到劑量效應(yīng)。配方KAC023-001在低劑量下未表現(xiàn)出影響，但是在高劑量下表現(xiàn)出一定的改善。配方KAC023-003和KAC023-004隨著劑量的增加顯示出產(chǎn)氣量增加。配方KAC023-002在lg/kg下達(dá)到飽和。按照Menke的方法，在24小時(shí)溫育中，在產(chǎn)氣量和消化率間存在緊密的相關(guān)性。圖7所示為模擬TMR飼料中的有機(jī)物消化率(OMD)。從底物的粗蛋白含量和Gp24h計(jì)算OMD。因?yàn)閷τ谒兴姆N酶配方，底物均相同，酶對OMD的影響顯示出與Gp24h相似的模式。綜合產(chǎn)氣量和消化率的結(jié)果，當(dāng)在體外溫育時(shí)，所有的四種酶配方均可以提高模擬TMR的消化率。在這四種配方中，KAC023-001的有效性最低。它僅在高劑量(2g/Kg)下表現(xiàn)出影響。KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004均在統(tǒng)計(jì)學(xué)上優(yōu)于KAC023-001。在KAC023-002和KAC023-003間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在所有的四種樣品中，KAC023-004是最好的。因此，在接下來的實(shí)驗(yàn)中根據(jù)KAC023-004設(shè)計(jì)新的配方。在乳業(yè)養(yǎng)殖中，纖維素酶和木聚糖酶被認(rèn)為是最重要的外源性酶(Beauchemin等，2003a，Beauchemin等，2003b，Beauchemin等，2003c，)。KAC023-001僅包含纖維素酶和木聚糖酶。以上數(shù)據(jù)表明當(dāng)纖維素酶和木聚糖酶的水平低時(shí)，對TMR的體外消化率無影響。在高劑量(2g/kg)下，KAC023-001表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的影響。這表明這兩種酶的水平需要通過進(jìn)一步優(yōu)化來增加。除了纖維素酶和木聚糖酶之外，其它酶也發(fā)揮重要作用。所有四種配方均包含相同水平的纖維素酶和木聚糖酶。與KAC023-001相比，KAC023-002、KAC023-003和KAC023-004另外還分別包含P_葡聚糖酶、果膠酶和此二者。這表明添加P_葡聚糖酶和/或果膠酶對于有效性是必不可少的。瘤胃中這兩種酶的缺乏可能是有機(jī)物消化率的限制因素。P-葡聚糖是草糠中的主要成分。它由連接的P-(l，3)-和P-(l，4)-D-吡喃葡萄糖單元的線性無支鏈多糖組成。果膠是在水果皮和蔬菜皮中發(fā)現(xiàn)的酸性結(jié)構(gòu)多糖的異質(zhì)群體。其結(jié)構(gòu)的大部分由同聚物的部分甲基化的聚-a-(l，4)-D-半乳糖醛酸殘基組成。P-葡聚糖和果膠均構(gòu)成飼料中營養(yǎng)素釋放的空間位阻。因此，如果P-葡聚糖和果膠未被有效地分解，可以影響到有機(jī)物消化率。我們的數(shù)據(jù)明顯地表明添加P-葡聚糖酶或果膠酶顯著地改善了添加酶的有效性。兩種酶都添加發(fā)揮最好的有效性。實(shí)施例7-附加的NDF測試為了更好地評價(jià)纖維消化中的酶性能，我們使用純化的黑麥草NDF作為底物。在純NDF中，沒有蛋白質(zhì)或淀粉，因此可以消除這兩種因素的干擾。我們還根據(jù)第一輪的結(jié)果更改了我們的酶配方。KAC023-005和KAC023-006均含有更高水平的纖維素酶和木聚糖酶。此外，兩種配方均包含P-葡聚糖酶、果膠酶、P-甘露聚糖酶和a-半乳糖苷酶。使用的劑量是lg/kg。黑麥草NDF的Gp和0MD的結(jié)果如圖8所示。當(dāng)在體外溫育時(shí)，兩種配方均顯著地(p<0.01)提高了纖維的Gp和消化率。這表明二種酶配方均可以提高纖維的消化率。KAC023-005比KAC023-006更有效。將1.Og/Kg樣品1加入黑麥草NDF引起消化率提高18.3%。除了纖維素酶之外，在這兩種配方中，所有其它酶的活性均相同。KAC023-005中纖維素酶的活性低于KAC023-006中，但是KAC023-005的總有效性更好。這表明更高的酶活性不一定意味著更好的有效性。反而是不同酶的最佳組合更加促進(jìn)總消化率的提高。此結(jié)果與之前由Eun和Beauchemin(出版中)進(jìn)行的研究矛盾。Eun和Beauchemin使用若干商品化的酶產(chǎn)品來研究纖維素酶活性和體外產(chǎn)氣量，并且發(fā)現(xiàn)這兩種參數(shù)間的線性相關(guān)性(r=o.71;p<o.01)。一種解釋是Eun的論文中纖維素酶活性實(shí)際上是指內(nèi)切葡聚糖酶活性而不是總纖維素酶活性，而在我們的研究中，我們測定總纖維素酶活性。因此，內(nèi)切葡聚糖酶和產(chǎn)氣量間的線性相關(guān)性可能不等于總纖維素酶活性和產(chǎn)氣量間的線性相關(guān)性。另一種可能的解釋是在這兩項(xiàng)研究中，測定纖維素酶活性的條件和方法非常不同。第三種可能性是在E皿的論文中報(bào)道的線性相關(guān)性是底物特異性的。在E皿的論文中，使用苜蓿作為底物，而在我們的研究中，使用TMR。實(shí)施例8-瘤胃中酶的穩(wěn)定性在瘤胃中使用酶添加劑的主要擔(dān)心之一是這些酶的穩(wěn)定性。瘤胃微生物分泌可以快速降解外源性酶的蛋白酶。在此研究中，在體外測定兩種配方中纖維素酶和木聚糖酶的穩(wěn)定性。為了使來自纖維素酶和木聚糖酶的內(nèi)源性活性的噪音最小化，我們使用高劑量(100kg/T)，以使得與外源性酶相比，這兩種酶的內(nèi)源性活性可忽略。因此，在我們的研究中，我們不需要擔(dān)心來自內(nèi)源性酶的干擾。我們的纖維素酶和木聚糖酶的穩(wěn)定性如圖9所示。溫育12h后，KAC023-005中的纖維素酶活性保持在72.9%，并且兩種樣品中的所有其它酶的活性均保持在超過90%。輔你l10-，齢禾中,口口口,氣量進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)，以更好地理解各酶的作用、各酶的量和酶的比例對酶產(chǎn)品有效性的影響。最初，制備了基于KAC023-5的四種不同的酶產(chǎn)品，并在瘤胃條件下使用產(chǎn)氣量方法進(jìn)行評價(jià)。使用的劑量是1.Og/Kg。表5-酶產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>表6-表9的酶產(chǎn)品的產(chǎn)氣量<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>a'"柱內(nèi)的不同字母表示存在差異(p<0.05)表5中的這些配方全都無效，表明除了酶分布的組成之外，不同酶的比例也是重要的。在瘤胃條件下，相互對照地評價(jià)了先前的配方之一；使用的劑量為1.0g/Kg。表7-酶產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>表8-表7的酶產(chǎn)品的產(chǎn)氣量苜蓿羊草玉米秸稈玉米青貯<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>a'b柱內(nèi)的不同字母表示存在差異(p<0.05)結(jié)果表明纖維素酶和木聚糖酶的比例是重要的。如果木聚糖酶過高(KAC23-11和KAC023-12)，或者如果纖維素酶過高(KAC023-13、KAC023-14和KAC023-15)，則酶產(chǎn)品失去有效性。通過對比KAC023-17和KAC023-18，a_半乳糖苷酶似乎對玉米青貯有一定的改善。通過對比KAC023-05和KAC023-19，KAC023-05中的酶活性已達(dá)到飽和。進(jìn)一步增加纖維素酶、木聚糖酶和P-葡聚糖酶不進(jìn)一步提高有效性。接下來在瘤胃條件下評價(jià)了果膠酶和a-半乳糖苷酶的重要性；使用的劑量為<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>a'"'d柱內(nèi)的不同字母表示存在差異(p<0.05)通過對比KAC023-18和KAC023-22、KAC023-20和KAC023-21，顯然，a-半乳糖苷酶是需要的。通過對比KAC023-18和KAC023-20、KAC023-22和KAC023-21,顯然，果膠酶是需要的。通過對比瘤胃條件下KAC023-20和每種移除各成分酶的酶產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來進(jìn)一步地證實(shí)各成分酶的重要性；劑量為1.Og/Kg。表ll-酶產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表12-表10的酶產(chǎn)品的產(chǎn)氣量<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>a'b'"柱內(nèi)的不同字母表示存在差異(p<0.05)結(jié)果表明對于最佳性能，六種成分酶的所有酶活性均是重要的。省略任何酶活性導(dǎo)致產(chǎn)氣量在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著降低。實(shí)施例11材料和方法酶樣品在此實(shí)施例中使用的酶樣品是如表13中所述的配方KAC023-20。表13-酶產(chǎn)品<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>試驗(yàn)動物通過產(chǎn)奶天數(shù)(DM)和泌乳性能在胎次內(nèi)平衡，從江蘇省南京的乳牛場挑選40只泌乳的中國荷斯坦牛(ChineseHolstein)，并隨機(jī)分配成4組對照和處理1-3，每組10只動物。在處理1、2和3中，分別以250g/T、500g/T和1000g/T將KAC023-20加入精飼料中。試驗(yàn)動物和分組的細(xì)節(jié)如表14所示。表14.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)動物的信息<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>精飼料的組成如表15所示。表15.精飼料的會目成<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>以l:1的比例，將精飼料與青貯飼料和草料混合來配制全價(jià)飼料作為TMR。TMR的采食量基于乳牛的泌乳期。T服的組成和每只動物每天的采食量如表16所示。每天三次用TMR喂養(yǎng)試驗(yàn)動物?？呻S時(shí)無限制地供應(yīng)淡水。表16.TMR的組成和每天毎只動物采食量成分重量(新鮮的)，Kg<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在由15d適應(yīng)期和30d測試期組成的為期45天的單因素實(shí)驗(yàn)(one-wayexperiment)中進(jìn)行石開究。測定的參數(shù)在適應(yīng)期的開始和結(jié)束時(shí)測定所有參數(shù)，包括產(chǎn)乳量、乳脂肪、乳蛋白質(zhì)、乳糖、NFS禾口SCC。在測試期內(nèi)，每天記錄產(chǎn)乳量。每2天取乳樣來測定乳脂肪、乳蛋白質(zhì)、乳糖和NFS的含量。每周三采集乳樣品來測量SCC?；\條使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS(v6.12，1996)，通過單因素AN0VA分析數(shù)據(jù)。當(dāng)p〈0.05時(shí)，平均值存在差異，并且當(dāng)p<0.01時(shí)存在顯著性差異。題,口口口X們1量白條卩向整個測試期中的泌乳曲線如圖10所示。隨著泌乳高峰期后試驗(yàn)的進(jìn)行，產(chǎn)乳量存在下降的總體模式并伴有一定程度的波動。所有3種處理的產(chǎn)乳量均高于對照。在最初的10天，這種趨勢不是非常明顯。但是，當(dāng)處理被延長時(shí)，處理和對照間的差異變得愈發(fā)明顯。產(chǎn)乳量的下降顯著地放緩。在表20中總結(jié)了對產(chǎn)乳量的統(tǒng)計(jì)分析。每6天的數(shù)據(jù)被分組為一泌乳階段并通過統(tǒng)計(jì)進(jìn)行分析。所得結(jié)果與圖IO中的曲線一致。在最初的兩個階段(00-12d)內(nèi)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p>0.05)。自第三階段起，實(shí)現(xiàn)了KAC023-20對產(chǎn)乳量的積極影B向，因?yàn)樗@著地提高產(chǎn)乳量(P<0.01)。除了第三階段(13-18d)(p<0.05)，在所有劑量下，KAC023-20均未顯示出對產(chǎn)乳量的影響(P>0.05)，表明在250g/TKAC023-20下外源性酶的活性已飽和。在最初的兩個階段(00-12d)中KAC023-20未表現(xiàn)出影響，意味著乳?？赡苄枰L時(shí)間(超過22天)以適應(yīng)外源性酶。但是，整個測試期(00-30d)的數(shù)據(jù)表現(xiàn)出產(chǎn)乳量的顯著增長(p<0.01)(表17)。KAC023-20的施用使日產(chǎn)乳量平均增長3.2X或者0.85Kg/頭。表17.KAC023-20對產(chǎn)乳暈的影響，Kg/d<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a'b列內(nèi)帶有不同字母的平均值存在顯著性差異(p<0.01)u'e列內(nèi)帶有不同字母的平均值存在差異(p<0.05)KAC023-20對乳成分的影響如圖11中所示，在此研究中，KAC023-20未表現(xiàn)出對乳成分的影響。在3種處理中，未觀察到乳脂肪的顯著增長。在250g/T劑量下，與對照相比，存在數(shù)值的增長約2.7%(p=0.3023)。在乳蛋白質(zhì)、乳糖或者NFS方面，在處理和對照間未得到顯著性差異(p>0.05)。KAC023-20對體細(xì)胞數(shù)(SCC)的影響由乳測定的SCC是反映乳牛健康狀況的重要的并且非常廣泛地被接受的標(biāo)準(zhǔn)。高水平的SCC通常是不良健康狀況的指標(biāo)，例如亞臨床乳腺炎、酮癥等。KAC023-20對SCC的影響如圖12所示。在低劑量的KAC023-20(250g/T)下未觀察到積極影響。在中等施用量(500g/T)下觀察到SCC的數(shù)值的降低，并且在高施用量(1000g/T)下觀察到SCC顯著降低(p<0.05)。這表明KAC023-20提高泌乳乳牛的健康狀況。討論在乳牛養(yǎng)殖業(yè)，能量成為動物生產(chǎn)力(包括產(chǎn)奶量、繁殖和健康維護(hù))的瓶頸。能量供應(yīng)不足會縮短泌乳高峰期并且降低總產(chǎn)乳量。改善纖維消化率可以提高能量釋放，并因此給動物提供更好的能量以使其發(fā)揮生產(chǎn)力。常規(guī)飼料中的粗纖維由連接的P-(l，3)_和P-(l，4)-D-吡喃葡萄糖單元的線性無支鏈的多糖組成。這些單元可以折疊和凝結(jié)成結(jié)晶和非結(jié)晶區(qū)域。瘤胃中細(xì)菌分泌的纖維水解酶可以降解纖維的非結(jié)晶區(qū)域，但是迄今尚無證據(jù)證明細(xì)菌的酶可以降解結(jié)晶區(qū)域。在瘤胃中，結(jié)晶區(qū)域僅能夠被由瘤胃真菌分泌的外切葡聚糖酶和微晶纖維素酶降解。因?yàn)榱鑫傅奈⑸飬^(qū)系主要由細(xì)菌占主要地位，所以纖維的水解受兩種真菌酶即外切葡聚糖酶和微晶纖維素酶限制。已證明外源性酶通過直接將纖維的結(jié)晶區(qū)域降解成纖維二糖和葡萄糖或者增加瘤胃細(xì)菌種群來改善纖維消化。Nsereko等(2002)發(fā)現(xiàn)當(dāng)在飼料中添加纖維水解酶時(shí)，能夠降解纖維二糖和木聚糖的細(xì)菌的數(shù)量顯著地增加(p<0.05)。Lewis等(1996)以前已觀察到外源性酶對纖維的有效水解，并證明外源性木聚糖酶和纖維素酶顯著地提高DM、NDF和ADF的消化率。該研究清楚地證明通過向飼料中添加酶樣品對纖維有效的水解可以顯著地提高處于泌乳中期的乳牛的產(chǎn)乳量(P<0.01)并且在數(shù)值上提高其乳脂肪(p>0.05)，證實(shí)了能量利用率和產(chǎn)乳量之間的正相關(guān)性。在中國，為了追求更高的產(chǎn)乳量，存在增加精飼料與粗飼料比例的趨勢。瘤胃中高水平的精飼料的結(jié)果是乳酸的濃度較高，導(dǎo)致瘤胃pH較低。由于瘤胃中的纖維素分解細(xì)菌對酸性條件極為敏感，瘤胃的pH低于6.0至6.2被認(rèn)為對這些細(xì)菌的生長有害(Russell和Wilson,1996)。對于瘤胃中的纖維分解細(xì)菌，偏離最佳pH6.2肯定會導(dǎo)致一系列代謝疾病，即酸中毒和酮癥。因此，高水平的精飼料會嚴(yán)重地?fù)p害纖維分解細(xì)菌的功能并且損害纖維的消化率。用外源性酶對反芻動物飼料進(jìn)行添加利用了這些酶的較低最佳pH(通常在4.0和6.0之間)，并因此非常適合于高水平的精飼料酸化的瘤胃。體細(xì)胞數(shù)被廣泛地用作乳牛的健康指標(biāo)，其對產(chǎn)乳量很關(guān)鍵。只有當(dāng)SCC低于閾值71，000細(xì)胞/ml時(shí)，才可以達(dá)到最佳產(chǎn)乳量，并且在閾值之上SCC的每次翻倍都會導(dǎo)致1.51b/天的額外乳損失(Shook和Saeman，1983)。在此研究中，我們發(fā)現(xiàn)只有通過用1000g/T的KAC023-20處理，SCC才降低(p<0.05)，但是在其它劑量下不降低。這充分地表明本發(fā)明的酶組合和乳牛的免疫系統(tǒng)或健康間的劑量依賴關(guān)系。既然KAC023-20改善了飼料的能量釋放，更好的能量平衡使得乳牛更健康就不足為奇了。我們的結(jié)果也與Yang等之前的報(bào)告(1999)一致，其證實(shí)了產(chǎn)乳量中相似的劑量依賴性增加，1000至2000g/T的外源性酶使產(chǎn)乳量分別從23.7增加至24.6和25.6Kg/d。獵總而言之，在此研究中，KAC023-20的添加提高了泌乳性能而不影響乳成分。此研究表明KAC023-20在250、500和1000g/T下顯著地提高產(chǎn)乳量，但是在提高泌乳性能方面，250g/T的施用劑量可能是成本最低的。在1000g/T的劑量下，SCC降低，這表明當(dāng)高水平地添加KAC023-20時(shí)，其改善了乳牛的健康狀況。實(shí)施例12材料和方法酶樣品在此試驗(yàn)中使用的酶樣品是實(shí)施例11所述的配方KAC023-20。試驗(yàn)動物根據(jù)胎次、產(chǎn)奶日數(shù)(DIM)和泌乳性能，從遼寧省沈陽市的乳牛場挑選了72只泌乳的中國荷斯坦牛，配對并且分成兩組，即對照和處理，各組36只動物。在處理中，以500g/噸精飼料將酶樣品加入精飼料中。試驗(yàn)動物和分組的細(xì)節(jié)如表18所示。表18.試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)動物的信息<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>精飼料的成分如表19所示。表19.精飼料的成分<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>將精詞料與青貯詞料和草料混合成全價(jià)飼料作為全混合日糧(TMR)。TMR的采食量基于乳牛的泌乳期。TMR的成分和每只動物每天的采食量如表20所示。每天三次地喂養(yǎng)試驗(yàn)動物并且可隨時(shí)無限制地供應(yīng)淡水。表20.TMR的成分和毎只動物毎天的采食量成分重量(新鮮的)，Kg精飼料10.0玉米青貯17.0苜蓿1.4羊草3.2啤酒糟，潮濕的.6.0玉米秸稈1總量38.8在由15d預(yù)處理期和40d測試期組成的為期55天的成對樣品實(shí)驗(yàn)(Paired-Samplesexperiment)中進(jìn)行石開究。測l定的參數(shù)在預(yù)處理期的開始和結(jié)束時(shí)測定所有的參數(shù)，如產(chǎn)乳量、乳脂肪、乳蛋白質(zhì)和SCC。在測試期內(nèi)，每5天記錄產(chǎn)乳量。每15天取乳樣來測定乳脂肪、乳蛋白質(zhì)的含量和SCC。數(shù)據(jù)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS(v6.12，1996)通過成對樣品T-檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，因此，誤差條未包括在數(shù)據(jù)分析中。當(dāng)p<0.05時(shí)，平均值存在差異，并且當(dāng)p<0.01時(shí)，存在顯著性差巳升°結(jié)果和討論酶樣品對產(chǎn)乳量的影響整個測試期內(nèi)的泌乳曲線如圖13所示。處理組的產(chǎn)乳量高于對照，并且經(jīng)酶樣品處理乳曲線的降低顯著放緩。產(chǎn)乳量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖14所示。收集每5天的數(shù)據(jù)作為一個泌乳階段，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所得結(jié)果與乳曲線一致。在最初的四個階段(00-20d)，未觀察到穩(wěn)定的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從第五階段起，得到酶樣品對產(chǎn)乳量的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的積極影響。酶樣品提高產(chǎn)乳量(P<0.05)。對于整個測試期，處理組的產(chǎn)乳量顯著地高于對照(p<0.01)。在最初的四個階段(00-20d)中的無影響表明乳牛可能需要長時(shí)間來適應(yīng)外源性酶。從整個測試期起，利用酶樣品可以提高產(chǎn)乳量約0.82Kg/d每頭或者3.05%。酶樣品對乳成分的影響酶樣品對乳脂肪的影響如圖15所示。當(dāng)添加酶樣品時(shí)，在測試期的不同階段內(nèi)，未觀察到乳脂肪的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的增長(P>0.05)。但是，對于整個測試期，在處理中得到顯著增長(p<0.05)，這表明酶樣品對乳脂肪含量具有積極影響。在之前的在南京進(jìn)行的動物試驗(yàn)(實(shí)施例11)中，酶樣品僅顯示出乳脂肪的數(shù)值的增長，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的增長，這與此試驗(yàn)的結(jié)果不同。一種原因可能是在動物試驗(yàn)的開始，此試驗(yàn)中的乳脂肪含量(2.5%)低于南京農(nóng)場(3.2%)。較低的乳脂肪通常更易于提咼。酶樣品對乳蛋白質(zhì)無顯著的影響(p>0.05)(圖16)，這與之前的試驗(yàn)(實(shí)施例11)一致。酶樣品對SCC的影響酶樣品對SCC的影響如圖17所示。在測試期最初的15天中，未觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的影響。但是，從第30天起，與對照相比，處理組中的SCC急劇降低(p<0.05)。在整個測試期內(nèi)，當(dāng)添加酶樣品時(shí)SCC顯著地降低。<0.01)，這表明酶樣品改善了泌乳乳牛的健康狀況。這與之前的南京試驗(yàn)(實(shí)施例11)一致，其中當(dāng)以1000g/T精飼料添加酶樣品時(shí)，也觀察到乳SCC的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的降低(p<0.05)。獵總而言之，在此研究中，酶樣品的添加提高了泌乳性能。此研究表明酶樣品在500g/噸精飼料下顯著地提高產(chǎn)乳量(p<0.01)和乳脂肪(p<0.05)。對乳蛋白質(zhì)無影響。SCC顯著地降低(p<0.01)表明酶樣品改善了乳牛的健康狀況。在此試驗(yàn)中，當(dāng)施用酶樣品時(shí)，ROI達(dá)到5.56。實(shí)施例13材料和方法,口口口在此試驗(yàn)中使用的酶樣品是配方KAC023-19。試驗(yàn)動物根據(jù)產(chǎn)奶日數(shù)(DIM)和泌乳性能，從內(nèi)蒙古包頭市的乳牛場挑選了30只初產(chǎn)的泌乳的中國荷斯坦牛，平均活畜重量為520±6.44Kg，并隨機(jī)地分成3組，即對照、處理1和處理2，每組10只動物。在這兩個處理中，分別以500g/噸精飼料和1000g/T精飼料，將酶樣品加入精飼料中。試驗(yàn)動物和分組的細(xì)節(jié)如表21所示。將精飼料與青貯詞料和草料混合成全價(jià)飼料作為全混合日糧(TMR)。TMR的配料和營養(yǎng)素如表22所示。三組的平均飼料采食量為每頭每天35Kg(新鮮的)。每天喂養(yǎng)兩次試驗(yàn)動物，并且可隨時(shí)無限制地供應(yīng)淡水。表21.試驗(yàn)設(shè)計(jì)和試驗(yàn)動物的信息<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>在由15d預(yù)處理期和30d測試期組成的為期45天的單因素實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行研究。測定的參數(shù)在整個試驗(yàn)期內(nèi)，每天記錄產(chǎn)乳量。每兩天測定乳組成來分析脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、非脂肪固體(NFS)。每周通過SCC計(jì)數(shù)分析器測定體細(xì)胞數(shù)(SCC)。每天對試驗(yàn)動物進(jìn)行目視觀察，包括毛色、身體狀況、發(fā)情率和采食量。數(shù)據(jù)分析使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS(v6.12，1996)通過單因素ANOVA分析數(shù)據(jù)，使用Duncan多范圍檢驗(yàn)來解析處理平均值間的差異。當(dāng)p<0.05時(shí)，平均值存在差異，并且當(dāng)p<0.01時(shí)，存在顯著性差異。結(jié)果與討論,口口口X們l量白條卩向整個試驗(yàn)期的泌乳曲線如圖18所示。處理組的產(chǎn)乳量高于對照。產(chǎn)乳量的統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖19所示。與對照相比，處理1和處理2的平均產(chǎn)乳量分別顯著地增長0.31(p<0.01)和0.51kg/d(P<0.05)，而在處理1和處理2之間無顯著性差異(p>0.05)。兩個處理組的差異不顯著。但是，與處理1相比，處理2顯示出產(chǎn)乳量的數(shù)值的降低。這表明在500g/T的劑量下施用酶樣品已達(dá)到此產(chǎn)品對改善產(chǎn)乳量的最大影響。此結(jié)論與在華東進(jìn)行的試驗(yàn)(實(shí)施例11)一致。,口口口艦成扁駒向酶樣品對乳脂肪的影響如圖20所示。與對照相比，處理1和處理2分別在乳脂肪上表現(xiàn)出2.34%和4.09%的顯著增長(p<0.05)。處理2的乳脂肪高于處理1(p<0.05)。在之前的在南京進(jìn)行的動物試驗(yàn)中，酶樣品表現(xiàn)出乳脂肪的數(shù)值的增長(實(shí)施例11)。并且在遼寧進(jìn)行的動物試驗(yàn)中，當(dāng)在500g/T精飼料的劑量下用酶樣品處理時(shí)，乳脂肪顯著地提高(P=0.0230)(實(shí)施例12)。這些結(jié)果證明酶樣品可以提高乳脂肪的含量。酶樣品對乳蛋白質(zhì)無顯著性影響(p>0.05)(圖21)，這與之前的試驗(yàn)(實(shí)施例11和12)—致。如圖22A和22B所示，在此研究中，當(dāng)以500g/t和1000g/T添加酶樣品時(shí)，乳中的乳糖含量均顯著地增加(P<0.01)，這表明酶樣品可能提高乳糖含量。但是，這需要更多研究來證實(shí)。與在南京進(jìn)行的試驗(yàn)(實(shí)施例ll)一致，酶樣品對NFS未表現(xiàn)出顯著的影響(p>0.05)。酶樣品對SCC的影響酶樣品對SCC的影響如圖23所示。與對照相比，兩個處理的SCC均急劇降低(p〈0.01)，并且在兩個處理之間無顯著性差異。數(shù)值上的評價(jià)表明隨著酶樣品添加劑量的增加，SCC逐漸降低，這與在南京進(jìn)行的試驗(yàn)(實(shí)施例11)一致。在實(shí)施例11的試驗(yàn)中，當(dāng)分別以500g/T和1000g/T的劑量添加酶樣品時(shí)，觀察到數(shù)值的降低和統(tǒng)計(jì)學(xué)上的降低(p<0.05)。在遼寧進(jìn)行的試驗(yàn)中，處理(500g/T)的SCC顯著地低于對照(p<0.01)(實(shí)施例12)?；谶@三個試驗(yàn)的結(jié)果，得出結(jié)論施用酶樣品可以降低乳中的SCC，并且提高泌乳乳牛的健康狀況。目視觀察對試驗(yàn)乳牛的目視觀察結(jié)果如表23所示。經(jīng)酶樣品處理后，通過目視觀察，乳牛的毛色、身體狀況、繁殖和采食量得到了改善。在此研究中，試驗(yàn)動物是初產(chǎn)的并且其機(jī)體未完全成熟。首胎的身體狀況對后續(xù)胎次的生產(chǎn)性能非常重要。良好的身體狀況意味著生產(chǎn)性能和繁殖性能的更好的潛力。在此研究中，經(jīng)由目視觀察到身體狀況得到了改善，并且當(dāng)添加酶樣品時(shí)，體況得分(BCS)顯著地提高。酶樣品剌激乳牛進(jìn)入發(fā)情期，這表明繁殖性能得到了改善。這些表明提高了乳牛的效率并會獲得更大的收益。表23.對試驗(yàn)動物目視觀察的結(jié)果對照和處理組的實(shí)驗(yàn)初期處理組的試驗(yàn)中期和后期毛色不全且無光澤、不完全脫毛整潔、光滑、光亮身體狀況改善；大多數(shù)BCS>3,0，甚至3.5當(dāng)試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，約80%發(fā)情期快速采食，幾乎無剩余飼料身體狀況消瘦、大多數(shù)BCSC5多數(shù)不發(fā)情正常速度、食物選擇獵總而言之，在此研究中，酶樣品的添加提高了泌乳性能。此研究表明在500g/T和1000g/T精飼料的劑量下，酶樣品均顯著地提高了產(chǎn)乳量(p〈0.01)、乳脂肪(p<0.05)和乳中的乳糖含量(p<0.01)。對乳蛋白質(zhì)無影響。SCC顯著地降低(p〈0.01)，表明酶樣品改善了乳牛的健康狀況。在此試驗(yàn)中，當(dāng)分別以500g/T和1000g/T施用酶樣品時(shí)，R01達(dá)到2.88和1.76。經(jīng)酶樣品處理后，通過目視觀察到身體狀況和繁殖得到了改善。前述說明書和圖表包括本發(fā)明的說明性實(shí)施方案。本文所述的前述實(shí)施方案和方法可以基于本領(lǐng)域技術(shù)人員的能力、經(jīng)驗(yàn)和偏好發(fā)生變化。僅僅以某種順序列出所述方法的步驟并不對所述方法步驟的順序作出任何限制。前述說明書和圖表僅僅解釋和說明本發(fā)明，并且本發(fā)明并不限于它們，除非權(quán)利要求這樣限定。擁有本公開的本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)ζ溥M(jìn)行修改和變化而不脫離本發(fā)明范圍。權(quán)利要求改善反芻動物的草料飼料的消化率的方法，其包括以下步驟(a)從苜蓿、羊草、玉米青貯、秸稈青貯、玉米秸稈、黑麥草和全混合日糧中選擇草料；(b)用酶產(chǎn)品處理所述草料，所述酶產(chǎn)品具有纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶活性；和(c)使經(jīng)處理的草料保持在所述酶產(chǎn)品還原草料中碳水化合物的條件下；2.權(quán)利要求l的方法，其中所述酶產(chǎn)品以提供下述酶活性的量存在約200至約800單位每克之間的纖維素酶活性，約750至約3000單位每克之間的木聚糖酶活性，約225至約890單位每克之間的13_葡聚糖酶活性，約1至約100單位每克之間的果膠酶活性，約50至約800單位每克之間的13-甘露聚糖酶活性，和約1至約100單位每克之間的a-半乳糖苷酶活性。3.權(quán)利要求2所述的方法，其中所述酶產(chǎn)品以提供下述酶活性的量存在約200至約600單位每克之間的纖維素酶活性，約750至約2250單位每克之間的木聚糖酶活性，約225至約625單位每克之間的13_葡聚糖酶活性，約1至約5單位每克之間的果膠酶活性，約100至約300單位每克之間的13_甘露聚糖酶活性，和約1至約5單位每克之間的a-半乳糖苷酶活性。4.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述酶產(chǎn)品以提供約125克至約2000克每噸草料之間的量存在。5.改善反芻動物生產(chǎn)力的方法，其包括用權(quán)利要求1所述的經(jīng)處理的草料喂養(yǎng)反芻動物的步驟。全文摘要本申請描述了用于改善反芻動物的草料飼料的消化率的方法。將草料，包括苜蓿、羊草、玉米青貯、秸稈青貯、玉米秸稈、黑麥草或者TMR，用酶產(chǎn)品處理，所述酶產(chǎn)品具有纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶、甘露聚糖酶和α-半乳糖苷酶的活性。文檔編號A23K1/165GK101730479SQ200880022628公開日2010年6月9日申請日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2007年6月29日發(fā)明者劉永才,勞曄,段智勇申請人:凱敏工業(yè)公司