專利名稱：：具有改變的木質(zhì)素組分的轉(zhuǎn)基因甜高粱及其制備方法具有改變的木質(zhì)素組分的轉(zhuǎn)基因甜高粱及其制備方法
背景技術(shù)：
：甜高粱(Sweetsorghum)，甜高粱種(Sorghumbicolor(L.)Moench)，是提供可用于制造酒精、糖、糖漿、燃料等的穗粒和莖稈的唯一的農(nóng)作物。這種植物的主要問題是細(xì)胞壁中存在木質(zhì)素，其不利地影響了有益物質(zhì)的提取工藝。木質(zhì)素含量的改變有可能改善植物的質(zhì)量。所有用于栽培具有減少的木質(zhì)素含量的變種所采取的傳統(tǒng)育種方法，成功率有限。因此，通過基因工程開發(fā)具有改變的木質(zhì)素含量的栽培變種的可能性被認(rèn)為是完全可能的。木質(zhì)素被認(rèn)為是由對_香豆醇(p-coumarylalcohol)、松柏醇(coniferylalcohol)和芥子醇(sinapylalcohol)單體脫氫聚合而成的。這些單體通過苯基丙酸類合成路徑(phenylpropanoidpathway)合成。這些單體在結(jié)構(gòu)上僅在芳環(huán)(aromaticring)的3C和5C位置的甲氧基不同。改變單體的比例決定著木質(zhì)素的類型。木質(zhì)素分子的變化/異質(zhì)性取決于特定組分的總量當(dāng)對_香豆醇的總量高于其它組分時，其被稱為羥苯基木質(zhì)素(hydroxyphenylODlignin，H木質(zhì)素)；當(dāng)松柏醇的總量高于其它組分時，其被稱為愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(guaiacyllignin(G)，G木質(zhì)素)。類似地，如果芥子醇的含量超過其它組分時，則被稱為紫丁香基木質(zhì)素(Syringyllignin(S),S木質(zhì)素)。在酶降解過程中，G木質(zhì)素比S木質(zhì)素具有更高的抗性。因為在G木質(zhì)素中存在更多數(shù)量的分子間連接而使其更加致密，從而呈現(xiàn)更高的抗性。據(jù)觀察，木質(zhì)素的水平隨著飼料作物，包括如紫花苜蓿(alfalfaCJungetal.,1997))的豆類植物和高羊茅(fescue(BuxtonandRedfearn,1997)的草本植物的莖干的漸進(jìn)成熟而增加。另外，木質(zhì)素組分隨著進(jìn)一步成熟，其中的S/G比漸進(jìn)地升高(BuxtonandRussell，1988)。已采取多種方法降低木質(zhì)素的含量和提高S/G比。但是，結(jié)果發(fā)現(xiàn)是矛盾的，這可能由于缺少對木質(zhì)素生物合成途徑的了解，及由于采用不合適的用于木質(zhì)素生物合成酶活性的下調(diào)方法，這包括轉(zhuǎn)基因、應(yīng)用的啟動子、反義盒的構(gòu)建的選擇，最重要的是轉(zhuǎn)化子的篩選。調(diào)控如苯丙氨酸解氨酶(phenylalanineammonialyase)、肉桂酸-4-羥化酶(cinnamate4_hydroxylase)、4_香豆酸輔酶A連接酶(4-hydroxycinnamateCoAligase)的酶的初始反應(yīng)步驟減少了木質(zhì)素的含量。但是，這會導(dǎo)致多效性的效果，其包括改變的葉子形狀，局部的熒光病變、植株矮小、降低的授粉活性、改變的花的形態(tài)和色素沉著，降低了水平的可溶苯丙氨酸，降低了的S/G比等。由其它工作者進(jìn)行的改變或改良的S/G比而得到的相似效果是導(dǎo)致表型缺陷植物。結(jié)果表明，咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶(caffeicacidO-methyltransferase)的活性下調(diào)會導(dǎo)致紫丁香基木質(zhì)素生物合成的劇烈下降，而對愈創(chuàng)木基木質(zhì)素的影響不大，這個結(jié)果是不理想的，因為后者對化學(xué)降解具有更高的抗性。在這樣的背景下，本發(fā)明應(yīng)用一種不同的方法構(gòu)建反義基因盒從而提供了一種新的在細(xì)胞壁中具有改良的木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因甜高粱植物。圖1用于植物轉(zhuǎn)化的CCoAOMT基因的反義盒的限制性分析H=HindIII，S:SacI，B=BamHI,E=EcoRI,M用Hindlll/EcoRI消化的LambdaDNA；圖2用于植物轉(zhuǎn)化的COMT基因的反義盒的限制性分析H=HindIII，S=SacI,B=BamHI,E=EcoRI,M用Hindlll/EcoRI消化的LambdaDNA；圖3轉(zhuǎn)基因植物的照片；圖4通過PCR從基因組中擴(kuò)增的反義-C0MT。泳道1-7表示假定的轉(zhuǎn)化子；_ve表示對照植物；+ve表示細(xì)菌中的反義構(gòu)建體，M表示標(biāo)準(zhǔn)(marker)；圖5通過PCR從基因組中擴(kuò)增的反義-CCoAOMT。泳道1_7表示假定的轉(zhuǎn)化子；_ve表示對照植物；+ve表示細(xì)菌中的反義構(gòu)建體，M表示標(biāo)準(zhǔn)(marker)；圖6雙鏈介導(dǎo)的反義-COMT構(gòu)建體；圖7雙鏈介導(dǎo)的反義-CCoAOMT構(gòu)建體；圖8雙鏈介導(dǎo)的反義-COMT和反義-CCoAOMT構(gòu)建體。發(fā)明詳述通過大量的試驗，申請人發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素組分受CCoAOMT特別影響，受COMT—般影響，當(dāng)調(diào)控時，CCoAOMT對甜高粱植物中的木質(zhì)素組分具有直接的影響。因此，本發(fā)明提供一種與野生植物相比具有改變的木質(zhì)素含量和/或改變的木質(zhì)素組分的甜高粱，這是通過包含如SEQIDNO2所示的用于編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)的分離的DNA序列的構(gòu)建體的整合，操作甜高粱中的咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)的表達(dá)而實現(xiàn)的。在本發(fā)明的一個優(yōu)選方面，甜高粱顯示了改變的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶活性?？蛇x擇地，植物還顯示了與野生植物的咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶活性相比改變的咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶活性。因此，本發(fā)明的優(yōu)選植物包含至少一個外源核苷酸，該外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因“反義”的核苷酸序列，使得轉(zhuǎn)錄外源核苷酸時，內(nèi)源咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶的活性被抑制。本發(fā)明的植物包含至少兩個外源核苷酸，第一外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因反義的核苷酸序列，第二外源核苷酸包含與至少一部分咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶基因反義的核苷酸序列。當(dāng)呈現(xiàn)調(diào)控內(nèi)源咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶和內(nèi)源咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶兩者的活性時，上述的構(gòu)建體包含第一和第二外源核苷酸。外源核苷酸可以呈現(xiàn)于植物中作為相同核苷酸分子的一部分(例如，當(dāng)它們呈現(xiàn)于相同載體時)；或者它們可以作為單獨(dú)的分子存在(例如，當(dāng)它們呈現(xiàn)于不同的載體時)。本發(fā)明在此還提供制備具有改變的木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因植物的方法。植物被遺傳性地改造，以降低木質(zhì)素合成所涉及的一種或多種酶的活性。在一實施例中，本發(fā)明公開了制備基因工程植物的方法，其包括用至少一個外源核苷酸轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，該外源核苷酸與植物中木質(zhì)素生物合成所涉及的至少一個生物合成酶的降低的活性相關(guān)聯(lián)，然后使轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞生長為與可比較的野生植物的木質(zhì)素含量相比具有降低的木質(zhì)素含量的基因工程植物。在本發(fā)明中，所需要的酶是CCoAOMT，外源核苷酸包括與至少一部分CCoAOMT基因“反義”的核苷酸序列?？蛇x擇地，植物細(xì)胞還可以用例如與至少一部分COMT基因“反義”的第二外源核苷酸轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞然后生長為與野生植物相比具有改變的木質(zhì)素含量和/或改變的木質(zhì)素組分的轉(zhuǎn)基因植物。轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞然后生長為具有改變的木質(zhì)素組分的基因工程植物。通過公知方法，例如通過表達(dá)載體，將外源核苷酸整合入植物細(xì)胞中。通過用編碼所有需要的反義分子的單一載體或通過每個都編碼一個或多個反義核苷酸的多個載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，可以制得包含兩個或更多個不同的反義核苷酸的植物細(xì)胞。單個反義核苷酸的多個拷貝可以，但非必要包含在單一載體中。最好，反義核苷酸的每個拷貝可操作地連接到其各自的啟動子和終止子上。CCoAOMT基因(或基因單元)以與可借助于反轉(zhuǎn)錄酶/聚合酶通過mRNA獲得的cDNA("拷貝〃DNA)互補(bǔ)的方式存在。CCoAOMT基因還可以以部分或全部合成的形式存在。通過合成的基因，也可以理解為其是通過新加入部分天然基因形成的。表汰盒表達(dá)盒將包含用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞的選擇標(biāo)記基因。選擇標(biāo)記基因用于篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞或組織。選擇標(biāo)記基因包括編碼抗生素抗性潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(hptll)的基因。表達(dá)盒可以包含一個或多于一個的被轉(zhuǎn)移到轉(zhuǎn)化植物并在其中表達(dá)的基因或核苷酸序列。因此，每個核苷酸序列將被可操作性地連接到5'和3'的調(diào)控序列?？蛇x擇地，可以提供多個表達(dá)盒。本發(fā)明提供用于減少甜高粱(Sorghumbicolor,高粱)中木質(zhì)素的高粱的有效轉(zhuǎn)化的組合物和方法。轉(zhuǎn)化的高粱植物的特征在于包含轉(zhuǎn)移的核苷酸，例如是轉(zhuǎn)移的基因或側(cè)翼連接有至少一個T-DNA接頭并插入到高粱植物基因組內(nèi)的目的基因。由此生成的植物在形態(tài)和生殖上是正常的?？Х弱］o酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶，下稱CCoAOMT，在生物合成途徑中催化咖啡酰輔酶A的甲基化，使其從反式-4-香豆酰-CoA轉(zhuǎn)化為反式-阿魏酰-CoA。此處所說的CCoAOMT基因，應(yīng)理解為其轉(zhuǎn)錄成RNA后并翻譯為蛋白質(zhì)的任意核苷酸(DNA)，形成了具有CCoAOMT的性質(zhì)的酶，該核苷酸從其天然環(huán)境中分離而來，或被整合到載體上或在原核或真核DNA中被包裹為“外源”DNA或“附加”DNA。此處所說的CCoAOMT基因，還應(yīng)理解為是在其起始和/或末端包含不會或?qū)嵸|(zhì)上不會妨礙基因的功能的附加DNA序列的CCoAOMT基因。這些DNA序列，還可以稱為“基因單元”("geneunits")，例如可以通過限制性酶切切割形成，因為在基因的起始和末端沒有有慣常的限制性酶的切點(diǎn)可以利用。CCoAOMT基因或基因單元在其末端還可以攜帶適于它們操作的DNA序列(例如“連接子”)。本發(fā)明的方法有益于轉(zhuǎn)化高粱植物細(xì)胞。這些細(xì)胞可以來源于具有愈傷組織形成潛能的未成熟的胚組織和枝條頂端分生組織?？蛇x擇地，愈傷組織可以來源于花粉囊、小孢子、成熟的胚，其原則上來源于能夠形成愈傷組織和/或第二胚的高粱植物的任何其它組織。生成再生愈傷組織的有用的組織是從已發(fā)育的種子中切下的枝條頂端分生組織。用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養(yǎng)皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育，在黑暗中保持3天，以在農(nóng)桿菌(Agrobacterium)孵育前使枝條頂端生長。反義盒的生成和其在農(nóng)桿菌中的轉(zhuǎn)化本發(fā)明包含的用于生成咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)和咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)的cDNA的反義盒及將其導(dǎo)入植物細(xì)胞的步驟包括(1)從高粱植物的莖稈組織中分離mRNA；(2)由mRNA制備cDNA；(3)分離所需要的cDNA;(4)通過測序測定cDNA的性質(zhì)；(5)通過應(yīng)用用于生成雙鏈RNA的連接子加入正向和反向的基因片段構(gòu)建基因.品.(6)通過在表達(dá)各個轉(zhuǎn)錄本的啟動子的下面放置正向_反向基因盒構(gòu)建表達(dá)盒；(7)在根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中轉(zhuǎn)化盒；(8)將攜帶各個基因盒的根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化到合適的高粱移植體中；及(9)篩選假定的轉(zhuǎn)化子。此處使用的重組技術(shù)包含所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的及在例如Sambrooketal(1989)的標(biāo)準(zhǔn)參考資料中描述的標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)。一般地，根據(jù)制造商的使用說明書，需要進(jìn)行包含DNA連接、DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)。本發(fā)明包含雙鏈RNA-介導(dǎo)的基因干涉或融合發(fā)卡(CVhairpin)RNA方法。雙鏈RNA(dsRNA)-介導(dǎo)的基因干涉的使用已經(jīng)在多種生物體包括植物中證明。雙鏈RNA分子與單鏈RNA相比具有的優(yōu)勢是a)雙鏈RNA能啟動依賴同源的mRNA降解的天然的核糖核酸酶H(RNaseH)；b)合成的雙鏈SiRNA分子形成了特異地抑制基因表達(dá)的3'突出粘性末端(3，-overhang)；c)雙鏈siRNA具有意想不到的高效率和穩(wěn)定性。已經(jīng)證明極少數(shù)目的dsRNA分子可以對大量轉(zhuǎn)錄的靶目標(biāo)產(chǎn)生在ssRNA情況下不可能實現(xiàn)的特異的抑制(MontogomeryandFire,1998)。cDNA的制備cDNA通過反轉(zhuǎn)錄從甜高粱莖稈的mRNA制備。引物對提供可以用于被反轉(zhuǎn)錄酶延長的自由3’端的mRNA退火。酶使其按通常的5’到3’延長，由與mRNA模板配對的互補(bǔ)堿基引導(dǎo)形成雜交分子，該雜交分子由與互補(bǔ)的cDNA鏈配對的模板RNA鏈堿基組成。最初的mRNA降解后，使用DNA聚合酶合成互補(bǔ)的DNA鏈，將單鏈cDNA轉(zhuǎn)變?yōu)殡p螺旋cDNA。應(yīng)用從來自異源植物系統(tǒng)的基因的保守氨基酸序列設(shè)計的兼并引物，通過5’和3’RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds，快速擴(kuò)增cDNA末端)，應(yīng)用PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))分離所需的完全的cDNA。DNA擴(kuò)增后，將雙鏈DNA插入到pUC18載體中在Ε.coli中增殖。通過藍(lán)_白斑篩選假定的重組克隆。通過測序并結(jié)合計算機(jī)分析鑒定和測定包含所需cDNA的克隆的特征。通過連接子在正和反方向加入所需cDNA片段的適當(dāng)區(qū)域生成正義_反義構(gòu)建體。將該構(gòu)建體導(dǎo)入到用于高粱植物轉(zhuǎn)化的表達(dá)載體中，以抑制內(nèi)源COMT/CCoAOMT基因。載體最好包含具有廣泛宿主范圍的原核復(fù)制起點(diǎn)。還應(yīng)該包含選擇標(biāo)記，使其能夠篩選具有所需構(gòu)建體的細(xì)菌細(xì)胞。合適的原核選擇標(biāo)記包含對如卡那霉素的抗生素的抗性。眾所周知，在載體中還可以呈現(xiàn)其它編碼附加功能的DNA序列。例如，在農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的情況下，還可以包含用于后續(xù)轉(zhuǎn)移到植物染色體的T-DNA序列。為了在植物中表達(dá)，采用在其中可以導(dǎo)入目的基因的雙載體。重組表達(dá)盒除了包含所需要的序列外，還將包含植物啟動子區(qū)域、轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄終止子序列。典型地包括盒的5’和3’端的特異限制性酶位點(diǎn)，以使得能夠易于插入到先前存在的載體中。本領(lǐng)域技術(shù)人員也知曉控制真核基因表達(dá)的序列。本發(fā)明的啟動子的制備DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA是由被稱為啟動子的DNA區(qū)域調(diào)控的。啟動子區(qū)域包含傳遞信號給RNA聚合酶使其結(jié)合DNA、并將其中一條DNA鏈作為模板啟動mRNA的轉(zhuǎn)錄、形成相應(yīng)的互補(bǔ)RNA鏈的堿基序列。由于RNA鏈的5’區(qū)域與3’區(qū)域互補(bǔ)，因此將生成雙鏈RNA，該雙鏈RNA隨后應(yīng)用產(chǎn)生短的干涉RNA(RNAi)的機(jī)制降解。啟動子序列包括TATA盒共有序列(TATAAT)，其通常為位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的20-30個堿基對(bp)(按照慣例，為從相對于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的-30到-20bp)。TATA盒是相對于起始點(diǎn)具有相對固定位置的唯一的上游啟動子元件。CAAT盒共有序列以-75為中心，但在從起始點(diǎn)的相當(dāng)不固定的距離處從任一方向起作用。另一通常的啟動子元件是位于-90的GC盒，其包含共有序列GGGCGG。其可以以多個拷貝且在任一方向出現(xiàn)。在啟動子區(qū)域還可以發(fā)現(xiàn)其它賦予最大效率的序列。在啟動子和結(jié)構(gòu)基因組合中，啟動子最好大約位于其與異源轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離與在其天然背景中的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的距離相同的位置。表達(dá)盒中應(yīng)用的具體的啟動子對本發(fā)明來說不是關(guān)鍵。在植物細(xì)胞中指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的任意啟動子都是適合的。啟動子可以是組成型或誘導(dǎo)型的。在本發(fā)明的研究中應(yīng)用的玉米泛素啟動子(ubiquitinpromoter)已經(jīng)顯示在大部分組織中被高度激活和結(jié)構(gòu)性地表達(dá)。該玉米泛素啟動子包含在植物中選擇性表達(dá)玉米泛素基因的第一內(nèi)含子。啟動子在Hindlll/BamHI位點(diǎn)克隆到載體中，該位點(diǎn)下放置了C0MT/CC0A0MT反義構(gòu)建體。在2x35S啟動子下包含選擇標(biāo)記基因潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，以能夠篩選具有所需構(gòu)建體的植物細(xì)胞?；驑?gòu)建體的分析A)用于植物轉(zhuǎn)化的COMT基因的反義盒的限制性分析為了進(jìn)行限制性分析，從農(nóng)桿菌克隆中分離重組的DNA。重組DNA的分離方法如下將包含重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌克隆接種至5ml的YEP培養(yǎng)基(酵母提取物10g/l，蛋白胨10g/l和氯化鈉5g/l)中，在28°C下孵育36小時。用溶液I(葡萄糖9g/l，Tris3g/l和EDTA3.72g/l)懸浮收集的細(xì)胞，并在37°C下用溶菌酶(4mg/ml)處理30分鐘。然后添加溶液II(1%十二烷基硫酸鈉(SDS)和0.2NNaOH)。在室溫下孵育30分鐘，添加溶液III(醋酸鉀294.4g/l)，冰浴15分鐘。離心混合物。先用苯酚-氯仿隨后用氯仿-異戊醇處理收集的上清液。通過加入十分之一體積的醋酸鈉和兩倍體積的冷卻乙醇沉淀質(zhì)粒DNA，在-20°C下保持30分鐘，以IOOOOrpm離心10分鐘。干燥沉淀塊并用TE溶解(1MTRIS和0.5MEDTA)。通過用于產(chǎn)生重組盒的酶的限制性消化分析DNA，消化的片段用分子大小標(biāo)準(zhǔn)參照物檢測(圖1)。B)用于植物轉(zhuǎn)化的CCoAOMT基因的反義盒的限制性分析方法同上(圖2)。通過PCR鑒定基因組中的反義-COMT應(yīng)用整個基因組DNA來鑒定基因組中反義-COMT基因的存在。對于PCR，正向引物從啟動子的1393bp處設(shè)計，反向引物從基因的5’區(qū)域制得。整個擴(kuò)增區(qū)域為1.2kb(0.4kb的啟動子區(qū)域和0.Skb的用于反義構(gòu)建體的基因片段)(圖5)。在轉(zhuǎn)化子中用于反義COMT基因的PCR篩選的引物序列正向弓丨物5，gaattctgtttcaaactacctggtgg3，J^向弓L5'gaattcatggggtcgacggcggaggacgtg3，。通過PCR鑒定基因組中的反義-CCoAOMT應(yīng)用整個基因組的DNA鑒定基因組中的反義-CCoAOMT基因的存在。對于PCR，正向引物從啟動子的1393bp處設(shè)計，反向引物從基因的5’區(qū)域制得。整個擴(kuò)增區(qū)域為0.89kb(大約0.4kb的啟動子區(qū)域和大約0.49kb的用于反義構(gòu)建體的基因片段)(圖6)。在轉(zhuǎn)化子中用于反義CCoAOMT基因的PCR篩選的引物序列正向弓丨物5，gaattctgtttcaaactacctggtgg3，反向弓丨物5，gaattcatggggtcgacggcggaggacgtg3，從苯4外棺體轉(zhuǎn)化甜高粱(Sorghumbicolor,)用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%的氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養(yǎng)皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育。黑暗中孵育3天后，切離生成的莖尖并用其中具有農(nóng)桿菌懸浮液的感染培養(yǎng)基感染20分鐘。在共培養(yǎng)基上孵育外植體，并于25°C在黑暗中保持3天。間或用頭孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸餾水洗滌外植體，以防止細(xì)菌污染，并將其轉(zhuǎn)移到具有2mg/l的2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、30gm/l的蔗糖和250mg/l的頭孢噻肟酸的MS上，黑暗中保持12天，以生成愈傷組織。切離在莖尖的切口末端的愈傷組織部分，并將其轉(zhuǎn)移到具有潮霉素篩選的再生培養(yǎng)基(具有30g/l的蔗糖，2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28°C的21的光照/黑暗周期條件下。2周后，將綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有更高濃度的選擇標(biāo)記(4mg/l的潮霉素)的相同培養(yǎng)基上。將獲得的芽轉(zhuǎn)移到具有更高濃度的潮霉素(5mg/l)的相同培養(yǎng)基上2個月，每2周定期傳代培養(yǎng)。使伸長的芽生長于生根培養(yǎng)基上以生成根。最后在1/2MS液體培養(yǎng)基上用6mg/l的潮霉素篩選成苗。由單一愈傷組織生成的苗被稱為單系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化本發(fā)明的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法可以分為若干個步驟?；镜牟襟E包括感染步驟；共培養(yǎng)步驟；可選擇的休眠步驟(restingstep)；篩選步驟；及再生步驟。在感染步驟中，分離待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，并使其接觸農(nóng)桿菌。如果靶細(xì)胞是未成熟的胚，分離胚，并使其接觸農(nóng)桿菌的懸浮液。如上所述，農(nóng)桿菌已被改造為包含目的基因或目的核苷酸。該核苷酸插入到載體的T-DNA區(qū)域內(nèi)。本發(fā)明中應(yīng)用的一般的分子技術(shù)由例如Sambrook等(eds.)的分子克隆實驗室手冊，1989，冷泉港實驗室雜志，冷泉港(ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,N.Y.)提供。在感染步驟和共培養(yǎng)步驟中使用的農(nóng)桿菌的濃度可以影響轉(zhuǎn)化頻率。同樣地，非常高濃度的農(nóng)桿菌會損傷待轉(zhuǎn)化的組織，例如未成熟的胚，并導(dǎo)致愈傷組織的反應(yīng)降低。因此，本發(fā)明的方法中使用的農(nóng)桿菌的濃度可以隨著應(yīng)用的農(nóng)桿菌的菌株、轉(zhuǎn)化的組織、轉(zhuǎn)化的高粱的基因型等而變化。為了優(yōu)化特定的高粱系或組織的轉(zhuǎn)化程序，待轉(zhuǎn)化的組織(例如未成熟的胚)可以用各種濃度的農(nóng)桿菌孵育。同樣地，可以用標(biāo)記基因表達(dá)和轉(zhuǎn)化的程度評測各種農(nóng)桿菌的濃度。盡管農(nóng)桿菌的濃度可以變化，本發(fā)明中應(yīng)用的農(nóng)桿菌，一般地0D600nm為0.7到1.O。為了優(yōu)化轉(zhuǎn)化效率，一般將待轉(zhuǎn)化的組織加入到包含某一濃度的農(nóng)桿菌且為液態(tài)接觸相的農(nóng)桿菌懸浮液中。接觸相有利于待轉(zhuǎn)化的細(xì)胞/組織與農(nóng)桿菌懸浮液的最大接觸。細(xì)胞與農(nóng)桿菌懸浮液接觸的時間為至少約3分鐘到約15分鐘，較佳地為約4分鐘到約10分鐘，最好為約5分鐘到約8分鐘。感染步驟的液體接觸相是在液體溶液MS培養(yǎng)基中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖，ΙΟΟμΜ乙酰丁香酮(aCet0Syring0ne)，pH調(diào)整為5.2形成的。本發(fā)明應(yīng)用的其它培養(yǎng)基為共培養(yǎng)培養(yǎng)基(MS中加入20g/l蔗糖，10g/l葡萄糖，2mg/l2，4-D，100μM乙酰丁香酮和8.5g/l瓊脂，ρΗ5.8)、細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)基(YEP培養(yǎng)基-酵母提取物-10g/l，蛋白胨-IOg/1和氯化鈉_5g/l)、感染培養(yǎng)基(MS中加入68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和100μM乙酰丁香酮，ρΗ5.2)、再生培養(yǎng)基(MS中加入30g/l蔗糖，2mg/lBAPand8.5g/l瓊脂)和生根培養(yǎng)基(1/2MS中加入20g/l蔗糖，0.5mg/lIAA和0.5mg/lNAA)。感染期間農(nóng)桿菌的濃度農(nóng)桿菌的O.D.-在0.7-1.0之間后續(xù)的共培養(yǎng)步驟，或休眠步驟中(如果應(yīng)用的話)，將已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞接受選擇壓力以篩選那些已經(jīng)接收到并正表達(dá)由農(nóng)桿菌導(dǎo)入的來自異源核苷酸的多肽的細(xì)胞。細(xì)胞為胚的情況下，將胚轉(zhuǎn)移到具有固態(tài)培養(yǎng)基的平板上，該固態(tài)培養(yǎng)基包括抑制農(nóng)桿菌生長的抗生素及篩選劑。用于篩選轉(zhuǎn)化子的篩選劑將選擇用于包含至少一個位于超級雙元載體(superbinaryvector)內(nèi)并通過農(nóng)桿菌導(dǎo)入的可選擇的標(biāo)記插入的外植體的擇優(yōu)生長。一般地，所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
公知的任何一種適于培養(yǎng)高粱的培養(yǎng)基都可應(yīng)用于篩選步驟，例如包含懸浮有30g/l蔗糖，2mg/l2，4-D的N6鹽或MS鹽的培養(yǎng)基，黑暗中保持15天。篩選期間，培養(yǎng)胚，直到觀察到愈傷組織形成。典型地，在選擇培養(yǎng)基上生長的愈傷組織能夠生長到直徑約為1.5到2cm大小。愈傷組織達(dá)到合適大小后，在再生培養(yǎng)基上在黑暗中培養(yǎng)愈傷組織數(shù)周，一般地為約1到3周，以使體細(xì)胞胚成熟。優(yōu)選的再生培養(yǎng)基包括包含懸浮有30g/l蔗糖，2mg/lBAP和8.5g/l瓊脂的MS培養(yǎng)基。然后在生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)愈傷組織，在光照/黑暗循環(huán)中培養(yǎng)，直到芽和根生長。然后將小苗轉(zhuǎn)移到包含生根培養(yǎng)基的管子中大約又一周，使其生長和發(fā)育更多根。然后將植物移植到溫室中的罐中的土壤混合物中。應(yīng)用的外植體切自發(fā)芽的種子的頂端分生組織的切塊來自苯尖外棺體的高粱的轉(zhuǎn)化稈序用滅菌蒸餾水洗滌用吐溫20(5分鐘)和0.2%的氯化汞(7分鐘)滅過菌的種子表面。然后將種子在培養(yǎng)皿中的浸有滅菌蒸餾水的滅菌過濾紙上孵育。在黑暗中孵育3天后，切離生成的莖尖并用其中具有農(nóng)桿菌懸浮液的感染培養(yǎng)基感染20分鐘。在共培養(yǎng)基上孵育外植體并于25°C在黑暗中保持3天。間或用頭孢噻肟酸(cefotaxime)和蒸餾水洗滌外植體，以防止細(xì)菌污染，并將其轉(zhuǎn)移到具有2mg/l的2，4-D、30gm/l的蔗糖和250mg/l的頭孢噻肟酸的MS上，在黑暗中保持12天，以形成愈傷組織。切離在莖尖的切口末端的愈傷組織部分，并將其轉(zhuǎn)移到具有潮霉素篩選的再生培養(yǎng)基(具有30g/l的蔗糖、2mg/l的BAP和2mg/l的潮霉素的MS)上，保持在28°C的21的光照/黑暗周期條件下。2周后，將綠色的愈傷組織轉(zhuǎn)移到含有更高濃度的選擇標(biāo)記(4mg/l的潮霉素)的相同培養(yǎng)基上。將獲得的芽轉(zhuǎn)移到具有更高濃度的潮霉素(5mg/l)的相同培養(yǎng)基上2個月，每2周定期傳代培養(yǎng)。使伸長的芽生長于生根培養(yǎng)基上以生成根。最后在1/2MS液體培養(yǎng)基上用6mg/l的潮霉素篩選成苗。由單一愈傷組織生成的苗稱為單系。MiSA-O-甲某轉(zhuǎn)(CCoAoMT)的_法測丨定方法收集對照的愈傷組織和轉(zhuǎn)化的愈傷組織，并在液氮中混勻。在4°C在提取緩沖液(IOOmMTris-HCl,pH7.5，10%甘油，2mMDTT，0.2mMMgCl2，ImM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonylfluoride))中提取粉狀的組織1小時，在G-50柱上脫鹽。應(yīng)用以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品的Bradford法測定蛋白質(zhì)的濃度。將包含5μ1的[14CH3]-S-adenosyl-L-Met，5μ1的咖啡酸(ImM)或咖啡酰CoA(ImM)，30μ1的測定緩沖液(IOOmMTris-HCl,pH7.5，10%甘油，2mMDTT，0.2mMMgCl2)的測定混合物和蛋白提取物在30°C孵育30分鐘。在COMT和CCoAOMT的情況下，通過分別加入50μ1的0.2ΜHCl和10μ1的3MNaOH終止反應(yīng)?；旌衔镌?7°C保持10分鐘后，用40μ1的IMHCl酸化CCoAOMT混合物。用200μ1的正己烷(hexane)乙酸乙酯(ethylacetate)(11，ν/ν)提取標(biāo)注的阿魏酸(Labeledferulicacid)。將分離的有機(jī)相轉(zhuǎn)移到閃爍計數(shù)瓶并測定放射性。結(jié)果測定每個轉(zhuǎn)化系的五個轉(zhuǎn)化的愈傷組織的酶活性，以驗證反義策略作為初步研究的作用。結(jié)果顯示，盡管發(fā)現(xiàn)在多數(shù)情況下活性的改變不明顯，但某些愈傷組織響應(yīng)明顯(通過星號指示)。但是，結(jié)果已經(jīng)證實采用的用于下調(diào)表達(dá)水平的策略是有效的。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>G和S木質(zhì)素的估算方法在Lapierreetal.(1986)的硫代酸解法(thioacidolysis)和蘭尼鎳脫硫(Raneynickeldesulfurization)法條件下測定已轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化植物的木質(zhì)素組分。利用約20mg的細(xì)胞壁殘漁與15ml的0.2M三氯化鵬(borontrifluoride)和乙醚(etherate)在8.751的二氧雜環(huán)乙烷/乙硫醇混合物(dioxane/ethanethiolmixture)反應(yīng)進(jìn)行硫代酸解。將二氯甲烷中等份的硫代酸解溶液與Iml蘭尼鎳水漿混合以脫硫。通過氣相色譜-質(zhì)譜測定如木質(zhì)素的三甲基硅基衍生物(trimethylsilylderivatives)的木質(zhì)素衍生的單體的組分。結(jié)果樣品GS(μπιο/g干重)(μπιο/g干重)A.對照(非轉(zhuǎn)化系)1.對照14403752.對照23954003.對照3410396B.pfiX_e°mt轉(zhuǎn)化系1.COMTl4403602.COMT23904153.COMT33812624.COMT6460400C.pSX—e°mt轉(zhuǎn)化系1.ccoaomt13153652.CCoAOMT24214053.CCoAOMT5375452D.ρsk。mt_ee。a()mt轉(zhuǎn)化系1.COMT-CCoAOMT13073122.COMT-CCoAOMT3375397甜高粱中的G和S木質(zhì)素組分的含量發(fā)現(xiàn)20天的老野生甜高粱植物的莖稈中的G和S木質(zhì)素的平均含量分別為415μmol/g干燥樣品和390μmol/g干燥樣品。平均的紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比(S/G比)約為0.94。在轉(zhuǎn)化系COMT中觀察到總木質(zhì)素減少。盡管在轉(zhuǎn)化系為COMT的情況下觀察到S/G比降到0.7，但是，在轉(zhuǎn)化系為CCoAOMT的情況下觀察到S/G比增加到1.2。結(jié)果顯示，雙鏈反義介導(dǎo)的CCoAOMT下調(diào)適于具有改變的木質(zhì)素含量和組分的甜高粱植物的繁殖。本發(fā)明中包含的培養(yǎng)基組分共培養(yǎng)培養(yǎng)基MS+20g/l蔗糖+10g/l葡萄糖+2mg/l2，4-D+100μM乙酰丁香酮+8.5g/l瓊脂，pH5.8細(xì)菌培養(yǎng)培養(yǎng)基YEP培養(yǎng)基-gm/公升酵母提取物-IOg蛋白胨-IOg[oho]氯化鈉-Sg感染培養(yǎng)基具有68.5g/l蔗糖，36g/l葡萄糖和10(^11乙酰丁香酮的1^，？!15.2再生培養(yǎng)基具有30g/l蔗糖，2mg/lBAP和8.5g/l瓊脂的MS牛根培養(yǎng)基具有20g/l蔗糖，0.5mg/lIAA和0.5mg/lNAA的1/2MS在感染期間的農(nóng)桿菌的濃度農(nóng)桿菌的O.D.-在0.7-1.0之間愈傷纟目織感染的條件愈傷組織在具有30g/l蔗糖，2mg/l2，4_D的MS中生長，在黑暗中保持15天。權(quán)利要求由SEQIDNO2所示的分離的編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAoMT)的DNA序列。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其特征在于所述DNA是cDNA。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的分離的DNA，其特征在于所述DNA是從甜高粱(高粱)中分離的。4.包含由SEQIDNO2所示的第一外源核苷酸的構(gòu)建體，所述核苷酸可操作地連接到啟動子，其中第一核苷酸在反義方向上，并與至少一部分CCoAOMT基因反義，所述構(gòu)建體可選擇地包含由SEQIDNO1所示的與編碼咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的核苷酸序列反義的第二核苷酸。5.包含權(quán)利要求4所述的反義構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述宿主細(xì)胞是根癌農(nóng)桿菌。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體，其特征在于，所述構(gòu)建體在植物細(xì)胞中的表達(dá)導(dǎo)致植物中木質(zhì)素含量和組分的改變。8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的構(gòu)建體，其特征在于，改變的木質(zhì)素組分的特征是，與野生型植物的紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比(S/G比)相比，具有改變的紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的構(gòu)建體，其特征在于在轉(zhuǎn)化的植物中S/G比是1.2。10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體，其特征在于第一外源核苷酸包含“反義”于至少一部分CCoAOMT基因的“反義”核苷酸序列。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的構(gòu)建體，其特征在于第一外源核苷酸包含與至少一部分內(nèi)源CCoAOMTRNA的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的構(gòu)建體，其特征在于所述內(nèi)源RNA是前體RNA或mRNA。13.根據(jù)權(quán)利要求4所述構(gòu)建體，其特征在于第二外源核苷酸包含與至少一部分內(nèi)源COMTRNA的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。14.根據(jù)權(quán)利要求11和13所述的反義構(gòu)建體，其特征在于內(nèi)源RNA是前體RNA或mRNA。15.一種制備具有改變的木質(zhì)素含量和組分的轉(zhuǎn)基因植物的方法，所述方法包含a.用第一和可選擇地用第二外源核苷酸轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，以生成基因工程細(xì)胞，所述核苷酸與基因工程植物中的咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAoMT)和咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的活性與在野生植物中的CCoAoMT和COMT的活性相比發(fā)生改變相關(guān)；及b.使植物細(xì)胞在與野生型植物相比具有改變的木質(zhì)素含量的轉(zhuǎn)基因植物中生長。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于用包含第一外源核苷酸的載體轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞，以生成基因工程植物細(xì)胞，該第一外源核苷酸包含與CCoAOMT基因“反義”的第一核苷酸序列，并可選擇地包含與COMT反義的第二外源核苷酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于第一外源核苷酸的表達(dá)引起轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞產(chǎn)生第一“反義”RNA轉(zhuǎn)錄，該第一外源核苷酸具有與至少一部分內(nèi)源CCoAOMTRNA互補(bǔ)的核苷酸序列。18.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于第二外源核苷酸與COMT活性的降低相關(guān)。19.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，與野生植物的紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比相比，基因工程植物的改變的木質(zhì)素含量和組分具有增加的紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比。20.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于紫丁香基木質(zhì)素/愈創(chuàng)木基木質(zhì)素比為1.2。21.分別由SEQIDNO3和4所示的用于擴(kuò)增CCoAOMT的正向和反向引物。22.包含權(quán)利要求4所述的構(gòu)建體的載體。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的載體，其特征在于應(yīng)用的載體是PUC18載體。全文摘要本發(fā)明提供了一種與野生植物相比具有改變的木質(zhì)素含量和/或改變的木質(zhì)素組分的甜高粱，其通過包含SEQIDNO2所示的和可選擇地包含SEQIDNO1所示的分離的DNA序列的構(gòu)建體的整合，通過在甜高粱中具體操縱咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAoMT)的表達(dá)和可選擇地操縱咖啡酸O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)的表達(dá)獲得。文檔編號A01H5/00GK101802181SQ200880012082公開日2010年8月11日申請日期2008年2月20日優(yōu)先權(quán)日2007年2月21日發(fā)明者埃斯蒂塔瓦·巴素,巴尼布瑞塔·班迪,蘇米特拉·庫瑪爾·孫,莫利奈·庫瑪爾·麥提,薩塔若帕·卡爾申請人:納佳遒納能源私人有限公司