專利名稱：：一種防治植物真菌病害的菌劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種防治植物真菌病害的菌劑。
背景技術(shù)：
：20世紀(jì)80年代以來，我國蔬菜種植業(yè)發(fā)展迅速，蔬菜已成為僅次于糧食作物的第二大農(nóng)作物。由于蔬菜栽培的特殊環(huán)境，給蔬菜病害的發(fā)生、發(fā)展提供了適宜的條件，致使蔬菜病害的種類、數(shù)量及危害程度都呈現(xiàn)出逐年增加的趨勢，嚴(yán)重影響蔬菜的產(chǎn)量和質(zhì)量，給菜農(nóng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失，已經(jīng)成為限制我國蔬菜種植業(yè)發(fā)展和增強國際市場競爭力的"瓶頸"。蔬菜病害的防治，是我國蔬菜種植業(yè)發(fā)展的必需，也是菜農(nóng)的迫切要求。蔬菜多為連年重茬種植，從而導(dǎo)致某些病害的病原菌大量積累，尤其是一些土傳病害日趨嚴(yán)重，如黃瓜枯萎病、茄子黃萎病和青椒疫病等的危害逐年加重。長期以來，在蔬菜病害防治方面，農(nóng)藥特別是化學(xué)農(nóng)藥的使用發(fā)揮了巨大的作用。由于化學(xué)農(nóng)藥具有見效快、殺菌譜廣和使用簡便等特點，在病害防治中發(fā)展迅速，成為防病豐產(chǎn)的有效手段之一。但是長期、反復(fù)和大量使用化學(xué)農(nóng)藥會導(dǎo)致有益微生物被殺死或抑制，破壞生物群落結(jié)構(gòu)，造成環(huán)境污染，使蔬菜中有害物質(zhì)大量殘留，導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性或抗藥性，從而使化學(xué)農(nóng)藥的用量增加，帶來了更加嚴(yán)重的問題。當(dāng)代農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，要求生產(chǎn)者在利用資源、提高產(chǎn)量的同時，注意保護(hù)和改善人們賴以生存的環(huán)境，這就對蔬菜病害防治中的傳統(tǒng)觀念和不良做法提出了嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。由于長期使用化學(xué)藥劑防治各種蔬菜病害所造成的生態(tài)環(huán)境破壞和病原菌抗藥性增強等原因，迫切需要尋找一種更安全有效的蔬菜病害防治途徑。生物防治的特點正好彌補了化學(xué)防治的不足，因而成為倍受關(guān)注的研究方向。利用生物方法防治蔬菜病害不僅避免了化學(xué)農(nóng)藥帶來了一系列問題，而且安全、有效和持久，且不易產(chǎn)生耐藥性、對人畜安全無毒、不污染環(huán)境、無殘留、能保持生態(tài)平衡和生產(chǎn)工藝較簡單的特點。由于生物防治兼具保護(hù)生態(tài)和抗病的雙重功效，在蔬菜病害防治中發(fā)揮著巨大的作用，因而得到世界各國研究者的關(guān)注，己經(jīng)成為蔬菜病害防治中十分重要且日益得到重視的有效措施。目前，已發(fā)現(xiàn)多種微生物具有生防的作用，木霉菌就是其中一類普遍存在并具有重要經(jīng)濟(jì)意義的生防有益菌。木霉菌(7Wc/wArmaspp.)作為一種重要的植病生防因子(Biologicalcontrolagents,BCAs)—直受到普遍關(guān)注。國外已有商品化的木霉制劑問世，如美國的Topshield(哈茨木霉T22)和以色列的Trichodex(哈茨木霉T39)。黃瓜枯萎病和青椒疫病是蔬菜種植中最為常見且危害嚴(yán)重的兩類土傳真菌病害，主要癥狀表現(xiàn)為植株凋萎和萎蔫，根和莖的維管束阻塞、變褐等。近年來，由尖鐮孢菌(Fw犯W"moxy^ommSchlecht.)所致的枯萎病已經(jīng)成為蔬菜的主要病害之一，其中，以黃瓜受害最為嚴(yán)重，發(fā)病率一般為20%~30%，受害重的地區(qū)發(fā)病率高達(dá)80%~90%，甚至絕產(chǎn)。青椒疫病是由青椒疫霉CP/^0/7/^0raca;w/c/Leonian)引起的一種土傳病害，是青椒的毀滅性病害，在青椒的整個生育期內(nèi)均可發(fā)病。大水漫灌和高溫高濕的條件容易引起青椒疫病的大面積流行，常造成青椒減產(chǎn)，甚至絕收，青椒疫病已成為世界范圍內(nèi)青椒的毀滅性病害。黃瓜枯萎病和青椒疫病的有效防治成為蔬菜生產(chǎn)中急待解決的難題。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種防治植物真菌病害的菌劑。本發(fā)明所提供的防治植物真菌病害的菌劑，它的活性成分包括長柄木霉(JWc/zoflferma/0"g/6/YZc/2/Wwm)禾口貯豐蒙!錄木霉(7Wc/z6^ermac/^7>7ovz>7Vfe)。所述長柄木霉和檸檬綠木霉的集落形成單位數(shù)目比為1:(0.8-1.2)，具體為1:1。所述長柄木霄(7>/c/<%ferwa/(9"g/6/Yzc/H'afw附)具f本可為長柄木霧(7V/c/o^/er附fl/owg/Zv-flc/n'fl^wm)ACCC30150，所述貯豐蒙f錄木霧(7>/c/zocfermac"n."ow>/tfe)具^本可為檸檬綠木霉(7Wc/wtfemjac"W"ovzWcfe)ACCC30152。本發(fā)明所提供的用于防治植物真菌病害的菌劑的活性成份也可僅有由所述長柄木霉和檸檬綠木霉組成。上述菌劑中，所述長柄木霉和所述檸檬綠木霉可以分別獨立包裝，也可以混合在一起。本發(fā)明的防治植物真菌病害的菌劑可以為液體菌劑，也可以為固體菌劑，在液體菌劑中加入吸附基質(zhì)即可獲得固體菌劑；所述固體菌劑中，所述吸附基質(zhì)為由雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石組成的混合物。所述雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石的重量份數(shù)比為1:(0.38-0.42):(0.18-0.22):(0.18-0.22):(0.18—0.22)，具體為41:0.4:0.2:0.2:0.2。上述固體菌劑中，所述活性成分和所述吸附基質(zhì)的配比為4.5X1()SCFU孢子(1.6-1.7)g吸附基質(zhì)，具體為4.5Xl()8CFU孢子1.65g吸附基質(zhì)。所述真菌病害為由下述11種真菌中的至少一種所引起的真菌病害黃瓜立枯病菌(i.so/am')、黃瓜枯萎病菌(尸.ox;Asporam)、黃瓜黑星病菌(C.c"CMme"'"ww)、番茄早疫病菌04.犯/a"/)、番茄灰霉病菌fS.c/wefl)、茄子黃萎病菌(K白菜黑斑病菌(AZ)mw/cae)、小麥赤霉病菌(F.gram/"earwm)、小麥根腐病菌(及soroA:/"/a"m附)、斑點落葉病菌(A附g//)、青本叔疫病病菌(尸.ca/w/c/)。本發(fā)明利用上述制備的菌劑進(jìn)行防治效果實驗，結(jié)果表明，液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)54.8%，對青椒疫病的防治效果達(dá)67.9%。固體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)45.12%,并且使黃瓜增產(chǎn)11.06%，其防病與增產(chǎn)效果顯著；固體菌劑對青椒疫病的防治效果達(dá)61.90%，并且實驗組青椒的平均株高比對照組增加8.92%，青椒增產(chǎn)37.19%，說明本發(fā)明的菌劑的防病、促生和增產(chǎn)的效果顯著。.,具體實施例方式以下實施例所用菌種均來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(簡稱ACCC，地址北京市海淀區(qū)中關(guān)村南大街12號，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所，郵編100081)。實施例1、防治植物真菌病害的菌劑的制備及其防治效果實驗1、防治植物真菌病害的液體菌劑的制備篩選產(chǎn)厚垣包子培養(yǎng)基KH2PO42.0g/L、NH4NO31.0g/L、FeSO4.7H2O0.005g/L、MnSO40.0016g/L、CaCl20.3g/L、NaCl1.0g/L、MgS04.7H200.3g/L、玉米秸稈粉(過40mm篩)10g/L。PH6.0。115"C條件下滅菌20分鐘。將長柄木霉ACCC30150和檸檬綠木霉ACCC30152分別接種到PDA液體培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)3天(搖床轉(zhuǎn)速265轉(zhuǎn)/分)。然后按照10%(體積百分含量)的接種量接種到上述篩選產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分)至長柄木霉和檸檬綠木霉的發(fā)酵液中厚垣孢子的量均達(dá)到4.5X108CFU/ml，將上述長柄木霉的發(fā)酵液和檸檬綠木霉的發(fā)酵液按照1:1的體積比混合，得到防治植物真菌病害的液體菌劑。2、防治植物真菌病害的固體菌劑的制備一將雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石按照5:2:1:1:1的質(zhì)量比混合，得到防治植物真菌病害的固體菌劑的吸附基質(zhì)。將1.65g吸附基質(zhì)和含有4.5XIOSCFU孢子的上述步驟1得到的液體菌劑相混合，得到防治植物真菌病害的固體菌劑。3、菌劑的防治效果實驗(1)液體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗用溫度為37"C的無菌水浸泡黃瓜(品種名稱長春密刺，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子1224h，催芽。將栽培土混勻，裝在育苗盤中，當(dāng)種子發(fā)芽后，按行播種，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，待黃瓜幼苗長到23片真葉時，進(jìn)行黃瓜枯萎病防治試驗。將黃瓜枯萎病病菌(ACCC30442)制成孢子濃度為1(^個/mL的菌懸液，將上述黃瓜幼苗先斷根，再在上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接種上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液5mL，覆一薄層土。然后，將上述接種黃瓜枯萎病病菌的黃瓜幼苗接種上述步驟1制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種2.5mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種黃瓜枯萎病病菌的正常生長的黃瓜作為陰性對照(CKo)，以接種黃瓜枯萎病病菌而不接種上述步驟1制備的防治植物真菌病害的液體菌劑的黃瓜作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)查試驗結(jié)果。實驗設(shè)三次重復(fù)，上述步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果如表i所示。表l液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組21.,154.8陽性對照組(CK)46..7一結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果可達(dá)54.8%。(2)固體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗將黃瓜幼苗于5月4日3葉1心期進(jìn)行移栽，以栽培地的傳統(tǒng)栽培管理為基準(zhǔn)，水分及其它管理措施保持一致。所有實驗小區(qū)均不使用化學(xué)藥劑防控病害。試驗共設(shè)三個處理，分別為正常施肥組(CK1組)，正常施肥+基質(zhì)組(CK2組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基質(zhì)，穴施于黃瓜根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步驟2的固體菌劑，穴施于黃瓜根下)。每種處理設(shè)4個重復(fù)，各實驗小區(qū)隨機排列。每小區(qū)移栽2行黃瓜，行距為65cm，株距為29cm，共計12個小區(qū)。試驗期間每隔20天調(diào)6査一次，記錄病株數(shù)和死株數(shù)，計算出病株率和死株率。實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組黃瓜枯萎病的田間發(fā)病情況結(jié)果如表2所示。表2不同處理組黃瓜枯萎病的田間發(fā)病情況調(diào)查日期(月-曰)CK1組CK2組固體菌劑組病株率％死株率％病株率％死株率％病株率％死株率％5-2012.6±2.3o.o士o.o10.3±1.2o.o士o.o9.8±1.1o.o士o.o6-1018.5±2.82.6±0.311.5土1.6o.o士o.o10.4±0.6o.o士o.o6-3026.4±1.85.8±0.624.6土1.15.1±1.212.5±0.72.1±0.17-2028.5±1.96.1±0.527.3±2.15.2±0.615.1±0.62.3±0.78-0129.7±0.86.1±0.828.5±0.35.3±0.416.3±0.72.4±0.8結(jié)果表明，在同樣的管理條件下，與CK1組相比，CK2組與固體菌劑組的病株率和死株率都有不同程度的下降。其中定植后15天時，三個實驗組均無死株。CK2組與固體菌劑組的病株率較0(1組下降18.25%—22.22%;之后，CK1組與CK2組之間病株率與死株率的差異越來越小，而固體菌劑組與CK1組和CK2組之間的病株率與死株率差異越來越大。表明上述步驟2制備的固體菌劑對黃瓜枯萎病有較好的防治效果。不同處理組黃瓜枯萎病的發(fā)病起始期及防治效果如表3所示。_表3固體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果處理發(fā)病始期(月-日)_防病效果(％)固體菌劑組5-1845.12CK2組5-184.04CK1組__^_^結(jié)果表明，固體菌劑組和CK2組比CK1組的發(fā)病時間均晚5天，其防病效果較CK1組分別提高45.12%和4.04%，固體菌劑組與CK1組和CK2組的防病效果差異極顯著。上述各處理分次收獲黃瓜，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表4所示。_表4固體菌劑對黃瓜的增產(chǎn)效果~"Sl產(chǎn)量(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(%)固體菌劑組71.311.06CK2組66.73.89CK1組64.2—結(jié)果表明，固體菌劑組比CK1組黃瓜增產(chǎn)11.06。/。，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，可提高黃瓜的抗病能力，減輕黃瓜枯萎病害造成的損失。(3)液體菌劑防治青椒疫病試驗用溫度為37C的無菌水浸泡青椒(品種名稱茄門青椒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子24h，催芽。將栽培土混勻，裝在栽培盤中，當(dāng)種子發(fā)芽后，直接播種在栽培盆中，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，當(dāng)青椒幼苗長到56片真葉時，進(jìn)行青椒疫病防治試驗。將青椒疫病病菌(ACCC30093)制成孢子濃度為10MVmL的菌懸液，將上述青椒幼苗不移栽直接灌根接種上述青椒疫病病菌的菌懸液，每棵苗接種5mL上述青椒疫病病菌的菌懸液，覆一薄層土。然后，將上述接種青椒疫病病菌的青椒幼苗再接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種3mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種青椒疫病病菌正常生長的青椒作為陰性對照(CKo)，以接種青椒疫病病菌而不接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑的青椒作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)查試驗結(jié)果。實驗設(shè)三次重復(fù)，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果如表5所示。表5液體菌劑對青椒疫病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組15.,067.9陽性對照組(CK)46..7一結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果可達(dá)67.9%。(4)固體菌劑防治青椒疫病試驗青椒幼苗于4葉期進(jìn)行移栽，以栽培地的傳統(tǒng)栽培管理為基準(zhǔn)，水分及其它管理措施保持一致。所有實驗小區(qū)均不使用化學(xué)藥劑防控病害。試驗共設(shè)五個處理，分別為正常施肥組(CKo組)，正常施肥+低劑量基質(zhì)組(CK1組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，正常施肥+高劑量基質(zhì)組(CK2組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，低劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)，高劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)。每種處理設(shè)3個重復(fù)，各實驗小區(qū)隨機排列。每壟栽2行青椒，壟距50cm，每兩壟為一個小區(qū)(19.2m2)，共15個小區(qū)。種植密度3300株/667m2。試驗期間每隔20天調(diào)查一次，記錄病株數(shù)和病情級別，計算出病株率和病情指數(shù)。實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組青椒疫病的田間發(fā)病情況及防治效果如表6所示。表6固體菌劑對青椒疫病的防治效果處理發(fā)病率％病情指數(shù)防治效果％高劑量菌劑組201061.90低劑量菌劑組26.67■13,7545.95CK2組3517.92/CK1組36.6718,33/CKo組48.3325.42/結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑中，高劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為61.90%，低劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為45.95%。不同處理組對青椒株高的影響結(jié)果如表7所示。表7固體菌劑對青椒株高的影響處理平均株高增加(％)高劑量菌劑組90.358.92低劑量菌劑組86.554.34CK2組84.05/CK1組84.8/CKo組82.95/結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑對青椒的生長有一定的促進(jìn)作用。低劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加4.34%，高劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加8.92%。上述各處理分次收獲青椒，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表8所示。_表8固體菌劑對青椒的增產(chǎn)效果_處理產(chǎn)量(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>/結(jié)果表明，高劑量菌劑組比CKo組青椒增產(chǎn)37.19%，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑，其防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，青椒的株高明顯提高，而且還可提高青椒的抗病能力，減輕青椒疫病病害造成的損失。實施例2、防治植物真菌病害的菌劑的制備及其防治效果實驗1、防治植物真菌病害的液體菌劑的制備篩選產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基KH2PO42.0g/L、NH4NO31.0g/L、FeS04.7H200.005g/L、MnSO40.0016g/L、CaCl20.3g/L、NaCl1.0g/L、MgS04.7H200.3g/L、玉米秸稈粉(過40mm篩)10g/L。PH6.0。115"條件下滅菌20分鐘。將長柄木霉ACCC30150和檸檬綠木霉ACCC30152分別接種到PDA液體培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)3天(搖床轉(zhuǎn)速265轉(zhuǎn)/分)。然后按照10%(體積百分含量)的接種量接種到上述篩選產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分)至長柄木霉和擰檬綠木霉的發(fā)酵液中厚垣孢子的量均達(dá)到4.5X108CFU/ml，將上述長柄木霉的發(fā)酵液和檸檬綠木霉的發(fā)酵液按照1:1.2的體積比混合，得到防治植物真菌病害的液體菌劑。2、防治植物真菌病害的固體菌劑的制備將雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石按照1:0.42:0.22:0.22:0.22的質(zhì)量比混合，得到防治植物真菌病害的固體菌劑的吸附基質(zhì)。將1.7g吸附基質(zhì)和含有4.5X10SCFU孢子的上述步驟1得到的液體菌劑相混合，得到防治植物真菌病害6勺固體菌劑。'3、菌劑的防治效果實驗，具體試驗過程同實施例l。(1)液體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗用溫度為37"C的無菌水浸泡黃瓜(品種名稱長春密刺，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子1224h，催芽。將栽培土混勻，裝在育苗盤中，當(dāng)秒子發(fā)芽后，按行播種，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，待黃瓜幼苗長到23片真葉時，進(jìn)行黃瓜枯萎病防治試驗。10將黃瓜枯萎病病菌(ACCC30442)制成孢子濃度為106個/11^的菌懸液，將上述黃瓜幼苗先斷根，再在上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接種上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液5mL，覆一薄層土。然后，將上述接種黃瓜枯萎病病菌的黃瓜幼苗接種上述步驟1制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種2.5mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種黃瓜枯萎病病菌的正常生長的黃瓜作為陰性對照(CKo)，以接種黃瓜枯萎病病菌而不接種上述步驟1制備的防治植物真菌病害的液體菌劑的黃瓜作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)查試驗結(jié)果。實驗設(shè)三次重復(fù)，上述步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果如表9所示。表9液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組22.551.8陽性對照組(CK)46.7一結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果可達(dá)51.8%。(2)固體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗'將黃瓜幼苗于5月4日3葉1心期進(jìn)行移栽，以栽培地的傳統(tǒng)栽培管理為基準(zhǔn)，水分及其它管理措施保持一致。所有實驗小區(qū)均不使用化學(xué)藥劑防控病害。試驗共設(shè)三個處理，分別為正常施肥組(CK1組)，正常施肥+基質(zhì)組(CK2組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基質(zhì)，穴施于黃瓜根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步驟2的固體菌劑，穴施于黃瓜根下)。每種處理設(shè)4個重復(fù)，各實驗小區(qū)隨機排列。每小區(qū)移栽2行黃瓜，行距為65cm，株距為29cm，共計12個小區(qū)。試驗期間每隔20天調(diào)査一次，記錄病株數(shù)和死株數(shù)，計算出病株率和死株率。實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組黃瓜枯萎病的發(fā)病起始期及防治效果如表10所示。表10固體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果處理發(fā)病始期(月-曰)防病效果(％)固體菌劑組5-1845.04CK2組5-183.98CK1組5-13—結(jié)果表明，固體菌劑組和CK2組比CK1組的發(fā)病時間均晚5天，其防病效果較CK1組分別提高45.04%和3.98%，固體菌劑組與CK1組和CK2組的防病效果差異極顯著。上述各處理分次收獲黃瓜，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表ll所示。表11固體菌劑對黃瓜的增產(chǎn)效果處理產(chǎn)量(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(%)固體菌劑組71.210.90CK2組66.63.76CK1組64.2—結(jié)果表明，固體菌劑組比CKl組黃瓜增產(chǎn)10.90y。，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，可提高黃瓜的抗病能力，減輕黃瓜枯萎病害造成的損失。(3)液體菌劑防治青椒疫病試驗用溫度為37t:的無菌水浸泡青椒(品種名稱茄門青椒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子24h，催芽。將栽培土混勻，裝在栽培盤中，當(dāng)種子發(fā)芽后，直接播種在栽培盆中，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，當(dāng)青椒幼苗長到5~6片真葉時，進(jìn)行青椒疫病防治試驗。將青椒疫病病菌(ACCC30093)制成孢子濃度為10MVmL的菌懸液，將上述青椒幼苗不移栽直接灌根接種上述青椒疫病病菌的菌懸液，每棵苗接種5mL上述青椒疫病病菌的菌懸液，覆一薄層土。然后，將上述接種青椒疫病病菌的青椒幼苗再接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種3mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種青椒疫病病菌正常生長的青椒作為陰性對照(CKo)，以接種青椒疫病病菌而不接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑的青椒作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)査試驗結(jié)果。實驗設(shè)三次重復(fù)，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果如表12所示。表12液體菌劑對青椒疫病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組16,265.3陽性對照組(CK)46,7一結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果可達(dá)65.3%。(4)固體菌劑防治青椒疫病試驗青椒幼苗于4葉期進(jìn)行移栽，以栽培地的傳統(tǒng)栽培管理為基準(zhǔn)，水分及其它管理措施保持一致。所有實驗小區(qū)均不使用化學(xué)藥劑防控病害。試驗共設(shè)五個處理，分別為正常施肥組(CKO組)，正常施肥+低劑量基質(zhì)組(CK1組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，正常施肥+高劑量基質(zhì)組(CK2組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，低劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)，高劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)。每種處理設(shè)3個重復(fù)，各實驗小區(qū)隨機排列。每壟栽2行青椒，壟距50cm，每兩壟為一個小區(qū)U9.2m2)，共15個小區(qū)。種植密度3300株/667m2。試驗期間每隔20天調(diào)査一次，記錄病株數(shù)和病情級別，計算出病株率和病情指數(shù)。實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組青椒疫病的田間發(fā)病情況結(jié)果如表13所示。表13固體菌劑對青椒疫病的防治效果<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑中，高劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為59.48%，低劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為45.08%。不同處理組對青椒株高的影響結(jié)果如表14所示。表14固體菌劑對青椒株高的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑對青椒的生長有一定的促進(jìn)作用。低劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加4.04%，高劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加8.62%。上述各處理分次收獲青椒，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表15所示。表15固體菌劑對青椒的增產(chǎn)效果處理產(chǎn)量(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(％)高劑量菌劑組124.235.56低劑量菌劑組123.134.24Ck2組95.03.60Ckl組93.21.64CKo組91.7/結(jié)果表明，高劑量菌劑組比CKo組青椒增產(chǎn)35.56。/。，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑，其防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，青椒的株高明顯提高，而且還可提高青椒的抗病能力，減輕青椒疫病病害造成的損失。實施例3、防治植物真菌病害的菌劑的制備及其防治效果實驗1、防治植物真菌病害的液體菌劑的制備篩選產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基KH2PO42.0g/L、NH4NO31.0g/L、FeS04.7H200.005g/L、MnSO40.0016g/L、CaCl20.3g/L、NaCl1.0g/L、MgS04.7H200.3g/L、玉米秸稈粉(過40mm篩)10g/L。PH6.0。115。C條件下滅菌20分鐘。將長柄木霉ACCC30150和檸檬綠木霉ACCC30152分別接種到PDA液體培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)3天(搖床轉(zhuǎn)速265轉(zhuǎn)/分)。然后按照10%(體積百分含量)的接種量接種到上述篩選產(chǎn)厚垣孢子培養(yǎng)基中，3(TC搖床培養(yǎng)(搖床轉(zhuǎn)速250轉(zhuǎn)/分)至長柄木霉和擰檬綠木霉的發(fā)酵液中厚垣孢子的量均達(dá)到4.5X108CFU/ml,將上述長柄木霉的發(fā)酵液和檸檬綠木霉的發(fā)酵液按照1:0.8的體積比混合，得到防治植物真菌病害的液體菌劑。2、防治植物真菌病害的固體菌劑的制備將雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石按照1:0.38:0.18:0.18:0.18的質(zhì)量比混合，得到防治植物真菌病害的固體菌劑的吸附基質(zhì)。將1.6g吸附基質(zhì)和含有4.5X1()SCFU孢子的上述步驟1得到的液體菌劑相混合，得到防治植物真菌病害的固體菌劑。3、菌劑的防治效果實驗，具體試驗過程同實施例l。(1)液體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果如表16所示。表16液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組22.152.7陽性對照組(CK)46.7一結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果可達(dá)52.7%。(2)固體菌劑防治黃瓜枯萎病試驗用溫度為37t;的無菌水浸泡黃瓜(品種名稱長春密刺，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子1224h，催芽。將栽培土混勻，裝在育苗盤中，當(dāng)種子發(fā)芽后，按行播種，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，待黃瓜幼苗長到23片真葉時，進(jìn)行黃瓜枯萎病防治試驗。將黃瓜枯萎病病菌(ACCC30442)制成孢子濃度為1(^個/mL的菌懸液，將上述黃瓜幼苗先斷根，再在上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液中浸泡5min，然后移栽入盆，每棵苗再接種上述黃瓜枯萎病病菌的菌懸液5mL，覆一薄層土。然后，將上述接種黃瓜枯萎病病菌的黃瓜幼苗接種上述步驟1制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種2.5mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種黃瓜枯萎病病菌的正常生長的黃瓜作為陰性對照(CKo)，以接種黃瓜枯萎病病菌而不接種上述步驟1制備的防治植,真菌病害的液體菌劑的黃瓜作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)査試驗結(jié).緊-實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組黃瓜枯萎病的發(fā)病起始期及防治效果如表17所示。表17固體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果處理發(fā)病始期(月-日)防病效果(％)固體菌劑組5-1845.08CK2組5-184.01CK1組5-13一結(jié)果表明，固體菌劑組和CK2組比CK1組的發(fā)病時間均晚5天，其防病效果;較CK1組分別提高45.08%和4.01%，固體菌劑組與CK1組和CK2組的防病效果差異極顯著。上述各處理分次收獲黃瓜，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表18所示。表18固體菌劑對黃瓜的增產(chǎn)效果處理產(chǎn)lt(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(%)固體菌劑組71.2510.98CK2組66.653.82CK1組64.20一結(jié)果表明，固體菌劑組比CKl組黃瓜增產(chǎn)10.98y。，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，可提高黃瓜的抗病能力，減輕黃瓜枯萎病害造成的損失。(3)液體菌劑防治青椒疫病試驗用溫度為37。C的無菌水浸泡青椒(品種名稱茄門青椒，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜與花卉研究所提供)的種子24h，催芽。將栽培土混勻，裝在栽培盤中，當(dāng)種子發(fā)芽后，直接播種在栽培盆中，再在上面覆一薄層土，噴水保濕，當(dāng)青椒幼苗長到5~6片真葉時，進(jìn)行青椒疫病防治試驗。將青椒疫病病菌(ACCC30093)制成孢子濃度為10MVmL的菌懸液，將上述青椒幼苗不移栽直接灌根接種上述青椒疫病病菌的菌懸液，每棵苗接種5mL上述青椒疫病病菌的菌懸液，覆一薄層土。然后，將上述接種青椒疫病病菌的青椒幼苗再接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑，每棵苗接種3mL，覆土培養(yǎng)。同時以不接種青椒疫病病菌正常生長的青椒作為陰性對照(CKo)，以接種青椒疫病病菌而不接種上述步驟l制備的防治植物真菌病害的液體菌劑的青椒作為陽性對照(CK)。保濕培養(yǎng)，一周后調(diào)查試驗結(jié)果。實驗設(shè)三次重復(fù)，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果如表19所示。表19液體菌劑對青椒疫病的防治效果組別病情指數(shù)防治效果(％)試驗組16.065.7陽性對照組(CK)46.7—結(jié)果表明，上述步驟1制備的液體菌劑對青椒疫病的防治效果可達(dá)65.7%。(4)固體菌劑防治青椒疫病試驗青椒幼苗于4葉期進(jìn)行移栽，以栽培地的傳統(tǒng)栽培管理為基準(zhǔn)，水分及其它管理措施保持一致。所有實驗小區(qū)均不使用化學(xué)藥劑防控病害。試驗共設(shè)五個處理，分別為正常施肥組(CKo組)，正常施肥+低劑量基質(zhì)組(CK1組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，正常施肥+高劑量基質(zhì)組(CK2組)(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g基質(zhì)，穴施于青椒根下，基質(zhì)為上述步驟2制備固體菌劑的吸附基質(zhì))，低劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用10g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)，高劑量固體菌劑組(每棵苗除了正常施肥外，再施用20g上述步驟2的固體菌劑，穴施于青椒根下)。每種處理設(shè)3個重復(fù)，各實驗小區(qū)隨機排列。每壟栽2行青椒，壟距50cm，每兩壟為一個小區(qū)(19.2m2)，共15個小區(qū)。種植密度3300株/667m2。試驗期間每隔20天調(diào)查一次，記錄病株數(shù)和病情級別，計算出病株率和病情指數(shù)。實驗設(shè)三次重復(fù)。不同處理組青椒疫病的田間發(fā)病情況結(jié)果如表20所示。表20固體菌劑對青椒疫病的防治效果處理發(fā)病率％病情指數(shù)防治效果％高劑量菌劑組20.6710.2059.87低劑量菌劑組27.3813.8245.63CK2組35,4917.94/CK1組36.7618.41/CKo組48.3325.42/結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑中，高劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為59.87%，低劑量固體菌劑組對青椒疫病的防治效果為45.63%。不同處理組對青椒株高的影響結(jié)果如表21所示。表21固體菌劑對青椒株高的影響處理平均株高增加(％)高劑量菌劑組90.218.75低劑量菌劑組86.424.18CK2組83.96/CK1組84.63/CKo組82.95/結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑對青椒的生長有一定的促進(jìn)作用。低劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加4.18%，高劑量菌劑組青椒的平均株高比CKo組增加8.75%。上述各處理分次收獲青椒，分別稱重計算產(chǎn)量。結(jié)果如表22所示。_表22固體菌劑對青椒的增產(chǎn)效果_處理產(chǎn)量(kg/小區(qū))增產(chǎn)效果(％)高劑量菌劑組124.936.21低劑量菌劑組123.835.01Ck2組95.74.36Ckl組94.12.62CKo組91.7/結(jié)果表明，高劑量菌劑組比CK1組青椒增產(chǎn)36.21。/。，差異顯著。上述實驗結(jié)果表明，上述步驟2制備的固體菌劑，其防病與增產(chǎn)效果顯著，接種上述步驟2的固體菌劑后，青椒的株高明顯提高，而且還可提高青椒的抗病能力，減輕青椒疫病病害造成的損失。權(quán)利要求1、一種防治植物真菌病害的菌劑，它的活性成分包括長柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)和檸檬綠木霉(Trichodermacitrinoviride)。2、根據(jù)權(quán)利要求l所述的菌劑，其特征在于所述長柄木霉和擰檬綠木霉的集落形成單位數(shù)目比為1:(0.8-1.2)。3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的菌劑，其特征在于所述長柄木霉和檸檬綠木霉的集落形成單位數(shù)目比為l-.l。4、根據(jù)權(quán)利要求1一3中任一所述的菌劑，其特征在于所述長柄木霉(JWc/zocferma/0"g/6rac/z/a,應(yīng))為長柄木霉(7WcAot/em7a/owg/6rac/H'她w)ACCC30150，所述擰檬纟錄木霉(Jh.c/wcferwac/fr/"ovz>/<ie)為擰才蒙纟錄木霉(7>/c/wfifermflc^/"ovzWafe)ACCC30152。5、根據(jù)權(quán)利要求1一4中任一所述的菌劑，其特征在于所述菌劑中包括吸附基質(zhì)，所述吸附基質(zhì)為由雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石組成的混合物。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的菌劑，其特征在于所述雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石的重量份數(shù)比為1:(0.38-0.42):(0.18-0.22):(0.18-0.22):(0,18-0.22)。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的菌劑，其特征在于所述雞糞、小麥麩皮、豆餅粉、草炭和蛭石的重量份數(shù)比為為1:0.4:0.2:0.2:0.2。8、根據(jù)權(quán)利要求1一7中任一所述的菌劑，其特征在于所述活性成分和所述吸附基質(zhì)的配比為4.5X1()SCFU孢子'.(1.6-1.7)g吸附基質(zhì)。9、根據(jù)權(quán)利要求8所述的菌劑，其特征在于所述活性成分和所述吸附基質(zhì)的配比為4.5X108CFU孢子1.65g吸附基質(zhì)。10、根據(jù)權(quán)利要求1一9中任一所述的菌劑，其特征在于所述真菌病害為由下述ll種真菌中的至少一種所引起的真菌病害黃瓜立枯病菌(7Jo/am')、黃瓜枯菱病菌(尸.ox;^s/7orwm)、黃瓜黑星病菌(CCWCM附en'"W附)、番莉早疫病菌so/ow/)、番茄灰霉病菌c/we"fl)、茄子黃萎病菌(F.^^//ae)、白菜黑斑病菌(A6raw/cfle)、小麥赤霉病菌(F.gram/"earaw)、小麥根腐病菌(5.^swoA:/"/awwm)、斑點落葉病菌(Ama/Z)和青椒疫病病菌(P.ca戸!'c/)。全文摘要本發(fā)明公開了一種防治植物真菌病害的菌劑，它的活性成分包括長柄木霉(Trichodermalongibrachiatum)和檸檬綠木霉(Trichodermacitrinoviride)。利用本發(fā)明的菌劑進(jìn)行防治效果實驗，結(jié)果表明，液體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)54.8％，對青椒疫病的防治效果達(dá)67.9％。固體菌劑對黃瓜枯萎病的防治效果達(dá)45.12％，并且使黃瓜增產(chǎn)11.06％，其防病與增產(chǎn)效果顯著；固體菌劑對青椒疫病的防治效果達(dá)61.90％，并且實驗組青椒的平均株高比對照組增加8.92％，青椒增產(chǎn)37.19％，說明本發(fā)明的菌劑的防病、促生和增產(chǎn)的效果顯著。文檔編號A01N63/04GK101637187SQ200810224678公開日2010年2月3日申請日期2008年10月23日優(yōu)先權(quán)日2008年10月23日發(fā)明者姜瑞波,張曉霞,張瑞穎,李世貴,阮志勇,顧金剛,馬曉彤申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所