專利名稱：一種杜仲毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)、生理學(xué)、育種學(xué)以及基因工程等領(lǐng)域，涉及一種杜仲毛狀 根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法，具體涉及發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化杜仲并獲 得產(chǎn)桃葉珊瑚甙的杜仲毛狀根的具體程序。本發(fā)明還提供利用基因工程技術(shù)獲得的高產(chǎn) 桃葉珊瑚甙的杜仲毛狀根及其培養(yǎng)的子代。
背景技術(shù)：
植物次生代謝產(chǎn)物具有十分重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)功能，在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人們的日常生活中 具有廣闊的應(yīng)用前景，其中在天然藥物開發(fā)中的地位尤為引人矚目，然而至今仍沒有找 到有效的或成熟的合成方法。相對于常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)，毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)具有生長迅速、、 合成次生代謝物質(zhì)能力強(qiáng)且遺傳穩(wěn)定性穩(wěn)定、向培養(yǎng)液釋放部分代謝產(chǎn)物等優(yōu)點。由于 Ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的毛狀根生長快，易于培養(yǎng)，有效成分高，具有表達(dá)完整的代謝通路，為 藥用植物次生代謝產(chǎn)物的工業(yè)化生產(chǎn)提供了廣闊前景。
目前，雖然國內(nèi)外采用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化藥用植物獲得生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物的毛狀 根的相關(guān)研究較多，但對遺傳轉(zhuǎn)化杜仲獲得產(chǎn)環(huán)烯醚萜類藥用成分毛狀根的研究仍是空 白。杜仲(五wcomm/a w/woW^ Oliv.)為杜仲科植物，是我國特有經(jīng)濟(jì)林木和名貴藥用植 物。近年來藥理上已證實杜仲在心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、性激素樣作用和抗 菌保肝防癌等方面有較好的藥理作用而被廣泛用于醫(yī)療事業(yè)。但由于人們超量濫挖，絕 大部分地區(qū)杜仲瀕臨滅絕，加之杜仲生長周期長，恢復(fù)生產(chǎn)非一時能夠見效。因而，尋 找新的藥源十分必要。毛狀根具有生長迅速、遺傳穩(wěn)定、能在無激素的培養(yǎng)基上生長等 特點，并且還能夠合成與原植物含量相當(dāng)或高于原植物含量的次生代謝產(chǎn)物，在植物細(xì) 胞工程領(lǐng)域具有較大的優(yōu)勢。因此毛狀根培養(yǎng)已成為近年來發(fā)展起來的生產(chǎn)藥用植物有 效次生代謝物的理想培養(yǎng)系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一目的就是提供一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)遺傳轉(zhuǎn)化杜仲獲得產(chǎn)藥用成分桃葉珊 瑚甙的毛狀根的方法，該方法將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入杜仲中，獲得杜仲毛狀根。
本發(fā)明的另一方面，還提供了一種用上述方法轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，這種經(jīng)轉(zhuǎn)化的宿主 細(xì)胞發(fā)育為毛狀根。在實例中該宿主細(xì)胞是杜仲。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種獲得產(chǎn)桃葉珊瑚甙杜仲毛狀根的方法和利用該方法獲得的產(chǎn)桃葉珊瑚甙的杜 仲毛狀根，該毛狀根是一種采用本發(fā)明所述方法創(chuàng)造的新生命體。 該方法步驟如下
1、 杜仲無菌外植體的獲得；
2、 采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到杜仲細(xì)胞、組織、器官 或植株中；其中轉(zhuǎn)基因方法選擇發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺 傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化或生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化；包括以下步驟
A、 活化發(fā)根農(nóng)桿菌；
B、 用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染杜仲無菌外植體；
C、 發(fā)根農(nóng)桿菌與杜仲無菌外植體的共培養(yǎng)，步驟如下
I、 將侵染后的杜仲外植體接種于添加100^moH/1乙酰丁香酮的MS固
體培養(yǎng)基上；
II、 置于溫度為25'C土1.(TC恒溫暗培養(yǎng)1 5天；
D、 外植體的除菌培養(yǎng)
3、 杜仲毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)；
4、 杜仲毛狀根的分子檢測，方法如下-
A、 提取杜仲毛狀根DNA;
B、 獲得含ra/B和ro/C引物的PCR反應(yīng)體系；
C、 PCR反應(yīng)擴(kuò)增毛狀根特有基因ra/B和raZC;
D、 電泳檢測目標(biāo)條帶；
5、 杜仲毛狀根中桃葉珊瑚甙的含量檢測。
用上述方法獲得的生命體，它是可生產(chǎn)環(huán)烯醚萜類藥用成分的杜仲毛狀根。 在本發(fā)明中，術(shù)語"生命體"指杜仲的細(xì)胞、組織、器官、植株。
在本發(fā)明中，術(shù)語"任何轉(zhuǎn)基因方法"包括發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基 因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化、生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明中，術(shù)語"在特定的條件下篩選和鑒定轉(zhuǎn)化子"是指用在離體培養(yǎng)的條件 下根據(jù)毛狀根的特殊形態(tài)學(xué)特征初步鑒定轉(zhuǎn)化子；可以使用PCR、 Southern雜交、
Northern雜交和Western印跡等方法來鑒定轉(zhuǎn)化子。
在本發(fā)明中，術(shù)語"在適合的條件下培養(yǎng)杜仲毛狀根"是指對經(jīng)過鑒定的杜仲毛狀 根離體培養(yǎng)，并檢測桃葉珊瑚甙的含量，篩選桃葉珊瑚甙含量提高的優(yōu)良轉(zhuǎn)化子進(jìn)行培 養(yǎng)，獲得其后代。
在本發(fā)明中，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA導(dǎo)入杜仲細(xì)胞獲得 轉(zhuǎn)化毛狀根，通過篩選優(yōu)良無性系，獲得桃葉珊瑚甙含量相對較高而穩(wěn)定的毛狀根無性 系，為桃葉珊瑚甙的生產(chǎn)提供一種新型優(yōu)質(zhì)的可持續(xù)使用的藥源。
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，例如《分子克隆》(New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的 條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例l
杜仲無菌外植體的獲得
方法利用外植體建立杜仲無菌外植體
大小均勻一致的當(dāng)年生新鮮杜仲種子(棄種皮)，0.4mg七"赤霉素(GA)浸泡24 小時；然后用0.1% (M/V)升汞(HgCl2)溶液浸泡12分鐘，無菌水沖洗5次；接著用 無菌紙吸干表面水分，并將其接種在基本培養(yǎng)基中(培養(yǎng)基盛于150mL三角瓶中，于 121。C滅菌20分鐘)，該培養(yǎng)基配方為MS + 0.4 mg'I/1 GA， 30g'L"蔗糖，pH值為5.8， 再添加7.5g丄"的瓊脂粉。在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)杜仲的葉片，培養(yǎng)條件為25'C， 12h-d'1 光照，光照強(qiáng)度為55^11101.111-2<1。 40天后，杜仲種子經(jīng)過吸脹、露白和成苗三個階段， 誘導(dǎo)獲得無菌的杜仲無菌幼苗，待其枝葉著生完全后可用于遺傳轉(zhuǎn)化。
實施例2
發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化杜仲獲得毛狀根
1、發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1 (西南大學(xué)生物工程與生物技術(shù)教研室培養(yǎng))。使用前自超 低溫冰箱取出200 ^，接種于25 ml YEB液體培養(yǎng)基中(添加利福平終濃度為40 mg丄—1), 28°C， 200rpm振蕩培養(yǎng)兩次，復(fù)蘇菌體。 2、 第二次活化培養(yǎng)結(jié)束兩小時前加入乙酰丁香酮，使其終濃度達(dá)到100 /mioH/1 也即菌液OD6(K)=0.3時，加入乙酰丁香酮，繼續(xù)28°C， 200 rpm振蕩培養(yǎng)，菌液OD6M=0.5 時，可用于轉(zhuǎn)化。
3、 室溫下4000 rpm離心10分鐘，棄上清，菌體用等體積MS液體培養(yǎng)基(含100 /rniol七—1乙酰丁香酮)懸浮，在28°C， 200 rp振蕩培養(yǎng)30分鐘，使菌液濃度達(dá)到的 OD60(p0.6左右，成為轉(zhuǎn)化液，此時可用于杜仲的遺傳轉(zhuǎn)化；1、 2、 3個步驟稱為活化
發(fā)根農(nóng)桿菌。
4、 發(fā)根農(nóng)桿菌與杜仲的共培養(yǎng)取無菌杜仲幼嫩真葉、子葉和胚軸各30份左右，
用無菌解剖針戳一些圓形傷口，放入上述轉(zhuǎn)化液中，浸染5 25分鐘后取出，用無菌衛(wèi) 生紙吸干，接種于添加100/miol丄"乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)1~5天，培 養(yǎng)條件為25°C，無光照。
5、 杜仲的除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌吸水紙上吸干外植體上多余水分，轉(zhuǎn) 移至無植物生長調(diào)節(jié)物的MS固體除菌培養(yǎng)基(添加500mg丄"頭孢菌素以達(dá)到除菌的 目的)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25°C，黑暗條件下培養(yǎng)。10天后，在杜仲受傷的部位開 始出現(xiàn)毛狀根。
6、 杜仲毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)外植體每隔3天轉(zhuǎn)入新鮮的同樣的培養(yǎng)基中，
待轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根長到5cm左右時，分別切下單條的毛狀根，接種在無 植物生長調(diào)節(jié)物的1/2 MS固體培養(yǎng)基上(添加500mg乇"頭孢菌素以達(dá)到除菌的目的) 繼代培養(yǎng)；在無植物生長調(diào)節(jié)物的1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長的杜仲毛狀根表現(xiàn)出毛狀 根特有的形態(tài)學(xué)特征生長十分迅速、分枝很多、生長失去向地性。以后每15 20天 繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，農(nóng)桿菌可以去除；然后分別轉(zhuǎn)入1/2MS、 1/2MS+IBA0.2 mg.1/1固體培養(yǎng)基和1/2 MS液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。
實施例3
杜仲毛狀根的分子檢測
1、杜仲毛狀根基因組DNA的提取，方法如下
(1) 取200mg液體培養(yǎng)兩周的毛狀根，過濾后用10mL蒸餾水洗滌，充分吸干， 液氮速凍，研磨成粉。
(2) 1.5 mLEppendorf管中，加500 ;/L抽提buffer (3%巰基乙醇)，充分震蕩65 'C水浴50分鐘，每5分鐘顛倒混勻。
(3) 4°C、 12,000rpm，離心10分鐘。
(4) 吸上清，加500pL酚氯仿異戊醇(25:24:1)，輕輕混勻，靜置5分鐘鐘
至分層。
(5) 室溫，12,000rpm，離心10分鐘。
(6) 吸上清約350 /zL,加等體積的氯仿異戊醇(24:1),輕輕混勻，靜置5分 鐘至分層。
(7) 室溫，12,000 rpm，離心10分鐘。
(8) 吸上清約250 ^L，加2倍體積的無水乙醇(一2(TC預(yù)冷)，充分混勻，室溫 放置10分鐘見有絮狀DNA析出。
(9) 室溫，12,000 rpm，離心10分鐘。
(10) 棄上清，沉淀用75%的乙醇洗2次，稍離心，吸凈殘余乙醇，室溫放置IO 分鐘，使乙醇揮發(fā)完全。
(11) 力B1 ;/LRNAase， 50//LTE，混勻，37。C水浴30—40分鐘。
(12) 加40;/L氯仿，輕輕混勻，靜置5分鐘至分層。
(13) 室溫，12,000rpm，離心10分鐘。
(14) 吸取上清(約35〃L)到新Eppendorf管中，一2(TC保存，用于PCR檢測。
抽提緩沖液配方如下
100mM Tris-HCl(pH8.0)
2.5%(V/V) 巰基乙醇
500mM NaCl
20mM EDTA
1.5%(W/V) SDS
2、杜仲毛狀根中ra/B和ra/C基因的PCR檢測
誘發(fā)并維持毛狀根形態(tài)的w/5和ra/C基因是來源于發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒上?；?檢測的PCR引物n /B (423 bp )的引物為/ra氾(5 ， -GCT CTT GC A GTG CT A GAT TT-3，)，見序列表l， m /B (5，-GAAGGTGCAAGCTACCTCTC-3，)，見序列表 2; ra/C (626 bp)的引物為/ro/C (5，-TAACATGGC TGAAGACGACC-3，)，見序 列表3， m /C (5，-AAACTTGCACTCGCCATGCC-3，)，見序列表4。
反應(yīng)體系均為(25 //L): ddH20 18 //L， 10 x PCR buffer 2.5 //L， 25 mmoI/L MgCL2 2.0 ;/L， 10 mmol'L—1 dNTP mix 0.25 //L， 10 mmol/L primerl 0.25 //L， 10 mmol/L primer 20.25
pL， 71^ DNApolymerase 0.25 〃L (1.25 U)， Template基因組DNA 1.5//L。
PCR反應(yīng)程序94。C 5min—35循環(huán)(94°C for40 sec—55°C for40 sec—72°C for
lmin)—72°C 8 min。陽性對照為相應(yīng)的工程菌，杜仲的天然葉片作為陰性對照。PCR
產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外檢測。的擴(kuò)增條帶大小為423 bp， w/c為626bp。
實施例4
杜仲毛狀根中桃葉珊瑚甙含量與野生根中的含量比較
1、 桃葉珊瑚甙對照品的HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作
Waters高效液相色譜儀Waters 1525型泵，Waters 2487型檢測池。色譜條件色 譜柱為COSMOSILCirPAQ柱(4.6mmx250mm， 5(am);流動相為乙腈-水相(85:15)， 其中水相為水-四氫呋喃(THF)-H3P04 (85:12:0.3)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為 210nm。標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制桃葉珊瑚武標(biāo)準(zhǔn)品(購自sigma公司)，以1000、 500、 250、 100、 50、 25、 10、 5ng'mL"標(biāo)準(zhǔn)液作HPLC分析。每一濃度進(jìn)樣三次記錄圖譜及色譜 參數(shù)，分別以峰面積和進(jìn)樣量(/^ml/1)進(jìn)行線性回歸，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，對照品 峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、 杜仲中桃葉珊瑚甙含量的測定
通過分子檢測且長勢良好的杜仲毛狀根稱取鮮重后于50 'C下烘干，稱重后研磨成 粉，稱取150mg毛狀根干粉用10mL72。/。的乙醇水溶液超聲破碎(60 kHz) 30min，過 濾，重復(fù)一次，合并濾液。濾液于旋轉(zhuǎn)蒸干儀上濃縮蒸干(50°C)，用甲醇(色譜級) 定容至10mL， -2(TC保存，作為供試樣品溶液。對照為以同樣方法提取的自然杜仲根 及皮供試樣品溶液。樣液于測定前用0.45 pm微孔濾膜過濾備用。
HPLC含量測定結(jié)果為杜仲毛狀根中桃葉珊瑚甙的含量最高達(dá)30.105wg'1 DW， 高于自然根及皮；在三種培養(yǎng)方式中，液體培養(yǎng)的毛狀根系生物量增長最快，桃葉珊瑚 甙含量最高，1/2MS+IBA固體培養(yǎng)的毛狀根系較1/2MS固體培養(yǎng)的毛狀根系而言生物 量大，但是其桃葉珊瑚甙含量遠(yuǎn)不如1/2MS固體培養(yǎng)的毛狀根系。可見杜仲毛狀根的 誘導(dǎo)和培養(yǎng)技術(shù)是獲取桃葉珊瑚甙的高效策略。
序列表
<110>西南大學(xué)
<120> —種杜仲毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法 <130>無
<160> 4
< 170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA <213>人工序列
<400> 1
gctcttgcag tgctagattt 20
<210> 2 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 2
gaaggtgcaa gctacctcte 20
<210> 3 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 3
taacatggct gaagacgacc 20
<210> 4 <211> 20 <212> DNA <213>人工序列 <400> 4
aaacttgcac tcgccatgcc 20
權(quán)利要求
1.一種杜仲毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法，特征在于采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化杜仲的細(xì)胞、組織、器官或植株，其步驟如下(1)杜仲無菌外植體的獲得；(2)采用轉(zhuǎn)基因方法轉(zhuǎn)移發(fā)根農(nóng)桿菌的Ri質(zhì)粒的T-DNA到杜仲細(xì)胞、組織、器官或植株中；其中轉(zhuǎn)基因方法選擇發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、花粉管通道介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化或生殖細(xì)胞浸泡法介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)化；包括以下步驟A、活化發(fā)根農(nóng)桿菌；B、用發(fā)根農(nóng)桿菌浸染杜仲無菌外植體；C、發(fā)根農(nóng)桿菌與杜仲無菌外植體的共培養(yǎng)，步驟如下I、將侵染后的杜仲外植體接種于添加100μmol·L-1乙酰丁香酮的MS固體培養(yǎng)基上；II、置于溫度為25℃±1.0℃恒溫暗培養(yǎng)1～5天；D、外植體的除菌培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，在無菌吸水紙上吸干外植體上多余水分，轉(zhuǎn)移至無植物生長調(diào)節(jié)物的MS固體除菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為25℃，黑暗條件下培養(yǎng)，10天后，在杜仲受傷的部位開始出現(xiàn)毛狀根；(3)杜仲毛狀根的獲得與繼代培養(yǎng)；外植體每隔3天轉(zhuǎn)入新鮮的同樣的培養(yǎng)基中，待轉(zhuǎn)化外植體上誘導(dǎo)出的毛狀根長到5cm左右時，分別切下單條的毛狀根，接種在無植物生長調(diào)節(jié)物的1/2MS固體除菌培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；以后每15～20天繼代培養(yǎng)一次，繼代5次后，去除農(nóng)桿菌；然后分別轉(zhuǎn)入1/2MS、1/2MS+IBA 0.2mg·L-1固體培養(yǎng)基和1/2MS液體培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)；(4)杜仲毛狀根的分子檢測，方法如下A、提取杜仲毛狀根DNA；B、獲得含rolB和rolC引物的PCR反應(yīng)體系；C、PCR反應(yīng)擴(kuò)增毛狀根特有基因rolB和rolC；D、電泳檢測目標(biāo)條帶；(5)杜仲毛狀根中桃葉珊瑚甙的含量檢測。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的杜仲毛狀根誘導(dǎo)和培養(yǎng)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法， 特征在于，在杜仲毛狀根的分子檢測步驟中基因檢測的PCR引物ra氾的引物為:^o/B(5，-GCT CTT GCA GTG CTA GAT TT- 3，)，見序列表1 ， m>/B (5，-GAA GGT GCA AGC TAC CTC TC- 3，)，見序列表2; w/C的引物為#o/C (5，-TAACAT GGC TGA AGA CGA CC隱3，)，見序列表3， m /C (5，-AAA CTT GCA CTC GCC ATG CC- 3，)，見 序列表4;反應(yīng)體系均為ddH20 18^/L， 10 x PCRbuffer 2.5 j L， 25 mmol/L MgCL2 2.0 PL, 10 mmol丄-1 dNTP mix 0.25/iL， 10 mmol/L primer 1 0.25 //L， 10 mmol/L primer2 20.25 ^L， Tag DNApolymerase 0.25 pL， Template基因組DNA 1.5 ;/L。
3. 用權(quán)利要求1或2所述方法獲得產(chǎn)桃葉珊瑚甙的杜仲的毛狀根，其特征在于其 基因組中整合了來自于Ri質(zhì)粒的誘導(dǎo)毛狀根的基因。
4. 用權(quán)利要求3所述方法獲得杜仲毛狀根的后代。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種杜仲毛狀根誘導(dǎo)生產(chǎn)藥用成分桃葉珊瑚甙的方法，遺傳轉(zhuǎn)化獲得可生產(chǎn)桃葉珊瑚甙的杜仲毛狀根，其過程是用發(fā)根農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化杜仲，獲得了杜仲毛狀根，經(jīng)分子檢測確為遺傳轉(zhuǎn)化的毛狀根，HPLC檢測表明遺傳轉(zhuǎn)化獲得的杜仲毛狀根能夠生產(chǎn)桃葉珊瑚甙。本方法可以為藥用成分桃葉珊瑚甙的生產(chǎn)提供一種新型可持續(xù)的新型藥源。
文檔編號A01H5/06GK101358197SQ200810070260
公開日2009年2月4日 申請日期2008年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月9日
發(fā)明者敏 孫, 孫一銘, 蕊 楊, 桅 雷 申請人:西南大學(xué)