專利名稱：豬顆粒型凍精的制備及解凍方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種豬顆粒型凍精的制備及解凍方法。
技術背景精液的冷凍保存在現代畜牧業(yè)中起著十分重要的作用。使用冷凍精液可 以不受時間、地域和公畜壽命的限制，減少公畜飼養(yǎng)數量，減低生產成本， 提高優(yōu)良種畜的利用率，為畜牧業(yè)生產帶來巨大的經濟效益。同時，精液的 冷凍保存在品種改良、血緣更新、疾病控制和瀕危動物品種保護上也具有極 其重要的意義。豬精液冷凍技術，從20世紀50年代開始以來，進展緩慢，在發(fā)達國家 豬凍精技術已基本可以應用于養(yǎng)豬業(yè)生產，但從世界范圍內看，豬凍精技術 的應用還不夠理想。該技術在我國豬的研究起步較晚，于1974年由廣西壯族 自治區(qū)畜牧研究所首先研究成功。我國大規(guī)模開展豬凍精技術研究始于七十 年代，但由于效果不穩(wěn)定、平均妊娠率較低(45%~50%)，始終未能在生產上 推廣應用。主要問題是冷凍液、解凍液的組成不一致，輸精量大，受精率 和產仔數比鮮精低，操作程序復雜，難以在生產中推廣應用。同時，由于豬 精液冷凍具有潛在的巨大商業(yè)價值和重要的現實意義，因此，目前豬精液冷 凍仍是動物繁殖領域內研究的熱點。 發(fā)明的內容本發(fā)明的目的是提供一種豬顆粒型凍精的制備及解凍方法。 為了實現本發(fā)明的目的，本發(fā)明的豬顆粒型凍精的制備及解凍方法包括 以下步驟1、豬精液的采集和常規(guī)檢查采精前，先用0.1%高錳酸鉀溶液纟寮拭公豬腹部，手握法采集豬富含精 子段精液于蓋有四層消毒紗布的集精杯中。將采得豬精液于30分鐘內帶回實 驗室，觀察精液為乳白色，呈云霧狀，嗅之略帶腥味，鏡檢活率為0.7以上 者，可用于冷凍保存。2、 稀釋液的配制由葡萄糖2. 0g、乳糖l.Og、甘氨酸O. 8g、檸檬酸鈉0. 3g、蔗糖O. 5~ 4.0g、 SDSO. 1~0. 5g、咖啡因0. 0097 - 0. 1554g、青霉素和鏈霉素各100000IU 及蒸餾水lOOml配制成基礎液，取80ml所述基礎液加入20ml卵黃構成稀釋 液I液，在lOOmlI液中加入3 ml的甘油為稀釋液II液，所有液體配好后保存 在0 4。C備用；3、 精液的稀釋與平衡將經檢查合格的精液分裝于10ml試管中，在35DC水浴中預孵育30~60 分鐘后，以1000轉/分離心IO分鐘，棄上清液，按l: 1體積比加入稀釋液I 液，混勻，使重懸浮的精子密度達(4~7) xlO'個/ml;用8層紗布將稀釋精 液包裹好并放入4。C冰箱平衡2h;平衡結束后，再以1: 1加入稀釋液II液(基 礎液+20°/。卵黃+3°/。甘油)，充分混勻，再于4。C水箱繼續(xù)平衡2h;4、 精液的冷凍和保存平衡時間結束后，將液氮倒入泡沫盒中，把帶有凹窩的氟板放入盒內， 距液氮面2-3cm，調節(jié)氟板溫度為-130°C ~-120°C，每個凹窩滴入O. lml精 液，迅速滴凍，氟板上的凍精顆粒在液氮蒸汽中熏蒸5~8min后，將氟板連 同凍精顆粒一起放入液氮內，并取出穿有長繩的消毒布袋放入液氮內預冷， 然后，用鑷子將凍精顆粒從氟板上取下，裝入布袋中，凍精顆粒的收集過程必 須在液氮中進行；凍精顆粒裝好后，應在長繩的末端栓上標簽，記錄好精液 的相關信息，然后移入液氮罐長期保存；5、 冷凍精液的解凍1) 、解凍液的配置葡萄糖5. Og、檸檬酸鈉O. 5g、安鈉咖(10。/。)5ml、青 霉素80000IU、鏈霉素100000IU及蒸餾水100ml;2) 、解凍方法將裝在布袋中的凍精顆粒從液氮中取出，在空氣中停留 20s后迅速放入42。C水浴預熱的解凍液中，搖晃試管8s促進精液和解凍液的 充分混合。解凍液的添加量為lml解凍液/每粒凍精，置于室溫下備用。6、冷凍精液的品質評定方法和判定指標精液解凍后，對其進行活力、頂體完整率、彎尾率、畸形率、復蘇率及 存活時間的檢測，綜合評價其質量。具體4喿作如下1)、活力^r測精液解凍后，置于室溫下放置3~5分鐘，取50ul精液滴于37。C預熱的 載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，在顯微鏡下觀察呈直線運動的精子所占百分率。 解凍后的活率不低于0.52。 2)、頂體完整率精子解凍后的頂體完整率主要采用考馬斯亮藍染色法評定。經考馬斯亮 藍染色后的精子呈藍色著染，頂體不完整或缺失的精子其頂體部不著色，如 圖3,圖4-1和4-2所示。在1000 x油鏡下檢查，每張片選擇左、中、右三個區(qū)域，計數至少200個精子，計算精子頂體完整率-頂體完整的精子數/ 計數總精子數。 3)、 畸形率精子解凍后畸形率主要采用用凡那他氏鍍銀染色法進行評定。如圖1 -1、 1-2、 1-3所示為正常精子；圖2-l、 2-2、 2-3、 2-4所示為畸形 精子。將制作好的標本置1000 x油鏡下檢查，每張片選擇左、中、右三個區(qū) 域，計數至少200個精子，計算精子畸形率-畸形精子數/計數總精子數。 4)、彎尾率用低滲腫脹實驗測定解凍精子的彎尾率，即可檢測精子的質膜完整率。 將精液與低滲液以1: 30的比例稀釋后，置37。C水浴中孵育30-60rain。取 50ul低滲精液滴于血細胞計數板上，計數5個中方格中的精子總數和彎尾精 子數，兩個計數室的結果相加計算平均數。彎尾率=彎尾數子數/計數總精子 數。5)、存活時間將解凍后的精液放入37。C水浴鍋中，每間隔一個小時觀測一次活率，當 活率下降到一半時，每隔0. 5h檢查一次，直至活率為零，存活時間不低于 420min。與已有的技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于1. 鮮精經水浴平衡后直接離心，不用加入其它稀釋液，減少操作步 驟，降低成本；2. 凍精的顆粒劑型操作筒單，取用方便；3. 頂體完整與否是精子能否受精的關鍵因素，傳統的頂體染色方法 雜質較多，樣^^r查看得不太清楚，采用考馬斯亮藍染色能克服這一問題， 且操作簡單方便。4. 解凍液配方簡單，易得，能起到精液解凍和解凍后保存的作用， 精液解凍后的存活時間不低于420min。


圖l-l、 1-2、 l-3解凍后在1000倍油鏡下觀察的正常精子；圖2-1、 2-2、 2-3 、 2-4分別為解凍后在1000倍油鏡下觀察的畸形精子；圖3為解凍后在IOOO倍油鏡下觀察的頂體完整精子；圖4 - 1和4 - 2為解凍后在1000倍油鏡下觀察的頂體部分和全部脫落精子。
具體實施方式
實施例1顆粒型凍精的制備1、 豬精液的采集和常規(guī)檢查采精前，先用0.1%高錳酸鉀溶液擦拭公 豬腹部，手握法采集豬富含精子段精液于蓋有四層消毒紗布的集精杯中。將 采得豬精液于30分鐘內帶回實驗室，觀察精液為乳白色，呈云霧狀，嗅之略 帶腥味，鏡檢活率為O. 7以上者，可用于冷凍保存。2、 稀釋液的配制葡萄糖2. Og、乳糖l.Og、蔗糖l. 5g、甘氨酸O. 8g、 檸檬酸鈉0. 3g、 SDS 0. 25g、咖啡因0. 0971g、溶于100ml蒸餾水中為基礎 液，青霉素和鏈霉素各1000IU/ml。取80ml基礎液并加入20ml卵黃為I液， 在lOOmlI液中加入3ml的甘油為II液。所有液體配好后保存在0 ~ 4。C備用。 3、精液的稀釋與平衡經檢查合格的精液分裝于10ml試管中，在35flC水浴 中預孵育30~ 60min后，以1000轉/分離心10min，棄上清液，按1: 1加入 稀釋液I液(基礎液+20%卵黃)，混勻，使重懸浮的精子密度達(4-7) xio9 個/ml。用8層紗布將稀釋精液包裹好并放入4。C冰箱平衡2h;平衡結束后， 再以1: 1加入II液(基礎液+20%卵黃+3%甘油)，充分混勻，再于4。C水箱繼續(xù)平衡2h。精液最終稀釋比例為i : 3。4、精液的冷凍和保存平衡時間結束后，將液氮倒入泡沫盒中，把帶有 凹窩的氟板放入盒內，距液氮面2 3cm，調節(jié)氟板溫度為-130 -120°C。每 個凹窩滴入0. lml精液，迅速滴凍。氟板上的凍精顆粒在液氮蒸汽中熏蒸5 ~ 8min后，將氟板連同凍精顆粒一起放入液氮內，并取出穿有長繩的消毒布袋 放入液氮內預冷。然后，用鑷子將凍精顆粒從氟板上取下，裝入布袋中。凍精 顆粒的收集過程必須在液氮中進行。凍精顆粒裝好后，應在長繩的末端栓上 標簽，記錄好精液的相關信息。制備完成，移入液氮罐長期保存。 實施例2冷凍精液的解凍1、 解凍液的配方葡萄糖5. Og、檸檬酸鈉0. 5g、安鈉咖(10W5ml、青 霉素和鏈霉素各100000IU、蒸餾水100ml。2、 解凍方法將裝在布袋中的凍精顆粒從液氮中取出，在空氣中停留20s 后迅速放入42。C水浴預熱的解凍液中，搖晃試管8s促進精液和解凍液的充分 混合。解凍液的添加量為lml解凍液/每粒凍精，置于室溫下備用。實施例3冷凍精液的品質評定方法和判定指標精液解凍后，對其進行活力、頂體完整率、彎尾率、畸形率、復蘇率及 存活時間的檢測，綜合評價其質量。具體操作如下1、 活力檢測精液解凍后，置于室溫下放置3-5分鐘，取50ul精液滴于42。C預熱的 載玻片上，迅速蓋上蓋玻片，在顯4敖鏡下觀察呈直線運動的精子所占百分率。 解凍后的活率不低于0.52。2、 頂體完整率精子解凍后的頂體完整率主要釆用考馬斯亮藍染色法評定。具體操作如下(1) 溶液的配制A. 稱取50mg考馬斯亮藍R250溶于蒸餾水100 ml中，煮沸溶解，0. 45 jum濾膜過濾。B. 加入高氯酸3. 5ml(2) 染色步驟A. 染色前，先將染液置于37'C水浴鍋中預熱10 min;B. 取50ul解凍精液，滴于載玻片上，抹片、風干；C. 將精子涂片置于考馬斯亮藍-高氯酸染色液中浸染5 7min;染色后涂 片用自來水沖洗后吹干、封片，4竟檢。(3)頂體完整率檢查經考馬斯亮藍染色后的精子呈藍色著染，頂體不完整或缺失的精子其頂 體部不著色。如圖3 ，圖4-l和4-2所示。在1000 x油鏡下檢查，每張片選擇左、中、右三個區(qū)域，計數至少200個 精子，計算精子頂體完整率-頂體完整的精子數/計數總精子數。3、 畸形率精子解凍后畸形率主要采用用凡那他氏鍍銀染色法進行評定，如圖1 -l、 1-2、 1-3所示為正常精子；圖2-l、 2-2、 2 - 3 、 2 - 4所示為畸形精 子。具體操作如下(1) 染色液的配制A. 胡氏固定液福爾馬林2 m 1 、醋酸lm 1 、蒸餾水1 0 0 m 1 ;B. 染色液單寧酸5 g、石炭酸l g、蒸餾水l 0 Om 1 ;C. 硝酸4艮溶液硝酸纟艮0. 25g 、蒸餾水1 0 0 m 1(2) 染色步驟A. 取50ul解凍精液，滴于載玻片上，抹片，風干后，將胡氏固定液滴 于玻片上，停lmin，自來水沖洗10s,滴干水分；B. 將染色液滴于玻片上，置酒精燈上加熱至玻片上出現蒸汽為止，自來 水沖洗30s，滴干水分；C. 滴2 ~ 3滴硝酸銀溶液于玻片上，同時滴加一滴氨水，左右搖晃玻片， 使硝酸銀溶液與氨水充分混合，染液變?yōu)闇啙岬狞S褐色后，置酒精燈上慢慢 加熱，經20~ 30s。D. 最后用自來水沖洗干凈，風干，鏡4僉。(3) 畸形率檢查在1000 x油鏡下檢查，每張片選擇左、中、右三個區(qū)域，計數至少200 個精子，計算精子畸形率-畸形精子數/計數總精子數。4、彎尾率用低滲腫脹實驗測定解凍精子的彎尾率，即可檢測精子的質膜完整率。(1) 低滲溶液的配制果糖O. 6756g、 二水檸檬酸鈉0. 3676g,溶于50ml 雙蒸水中。最終滲透壓150mosm/kg(2) 操作步驟將精液低滲液為l:30的比例稀釋后，置37。C水浴中孵 育30 — 60min。(3) 彎尾率檢查取50ul精液滴于血細胞計數板上，計數5個中方格中的精子總數和彎 尾精子數，兩個計數室的結果相加計算平均數。彎尾率=彎尾數子數/計數總 精子數5.存活時間將解凍后的精液放入42。C水浴鍋中，每間隔一個小時觀測一次活率，當 活率下降的一半時，每隔0. 5h檢查一次，直至活率為零，存活時間不低于 420min。實施例4實施例1中稀釋液的配制不同之處在于稀釋液的配方為葡萄糖2. 0g 、乳糖1.0g、甘氨酸0. 8g、檸檬酸鈉0. 3g、 蔗糖3. Qg、 SDS 0. 2g、咖啡因0. 0388g 、青霉素和鏈霉素各100000IU及蒸 餾水1G0ml。實施例5實施例1中稀釋液的配制不同之處在于稀釋液的配方為葡萄糖2. 0g、乳糖1. 0g、甘氨酸0. 8g、檸檬酸鈉0. 3g、 蔗糖1.5g、 SDS 0. 25g、咖啡因0. 0188g、青霉素和鏈霉素各100000IU及蒸 餾水100ml。
權利要求
1、一種豬顆粒型凍精的制備及解凍方法，方法包括一下步驟1)、豬精液的采集和常規(guī)檢查將采得豬精液于30分鐘內帶回實驗室，鏡檢活率為0.7以上者，可用于冷凍保存；2)、稀釋液的配制由葡萄糖2.0g、乳糖1.0g、甘氨酸0.8g、檸檬酸鈉0.3g、蔗糖0.5～4.0g、SDS0.1～0.5g、咖啡因0.0097～0.1554g、青霉素和鏈霉素各100000IU及蒸餾水100ml配制成基礎液，取80ml所述基礎液加入20ml卵黃構成稀釋液I液，在100mlI液中加入3ml的甘油為稀釋液II液，所有液體配好后保存在0～4℃?zhèn)溆茫?)、精液的稀釋與平衡將經檢查合格的精液分裝于10ml試管中，在35℃水浴中預孵育30～60分鐘后，以1000轉/分離心10分鐘，棄上清液，按1∶1體積比加入稀釋液I液，混勻，使重懸浮的精子密度達(4～7)×109個/ml；用8層紗布將稀釋精液包裹好并放入4℃冰箱平衡2h；平衡結束后，再以1∶1加入稀釋液II液(基礎液+20％卵黃+3％甘油)，充分混勻，再于4℃冰箱繼續(xù)平衡2h；4)、精液的冷凍和保存平衡時間結束后，將液氮倒入泡沫盒中，把帶有凹窩的氟板放入盒內，距液氮面2～3cm，調節(jié)氟板溫度為-130℃～-120℃，每個凹窩滴入0.1ml精液，迅速滴凍，氟板上的凍精顆粒在液氮蒸汽中熏蒸5～8min后，將氟板連同凍精顆粒一起放入液氮內，并取出穿有長繩的消毒布袋放入液氮內預冷，然后，用鑷子將凍精顆粒從氟板上取下，裝入布袋中，凍精顆粒的收集過程必須在液氮中進行；凍精顆粒裝好后，應在長繩的末端栓上標簽，記錄好精液的相關信息，然后移入液氮罐長期保存；5)、冷凍精液的解凍A、解凍液的配置葡萄糖5.0g、檸檬酸鈉0.5g、安鈉咖(10％)5ml、青霉素80000IU、鏈霉素100000IU及蒸餾水100ml；B、解凍方法將裝在布袋中的凍精顆粒從液氮中取出，在空氣中停留20s后迅速放入42℃水浴預熱的解凍液中，搖晃試管8s促進精液和解凍液的充分混合。解凍液的添加量為1ml解凍液/每粒凍精，置于室溫下備用。
全文摘要
一種豬顆粒型凍精的制備及解凍方法，方法的步驟為豬精液的采集和常規(guī)檢查、稀釋液的配制、精液的稀釋與平衡、精液的冷凍和保存、冷凍精液的解凍。本發(fā)明還涉及所述稀釋液及解凍液的配制。與已有的技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于鮮精經水浴平衡后直接離心，不用加入其它稀釋液，減少操作步驟，降低成本；凍精的顆粒劑型操作簡單，取用方便；解凍液配方簡單，易得，能起到精液解凍和解凍后保存的作用，精液解凍后的存活時間不低于420min。
文檔編號A61D19/00GK101219074SQ20081006929
公開日2008年7月16日 申請日期2008年1月25日 優(yōu)先權日2008年1月25日
發(fā)明者文 劉, 張鳳鳴, 琴 李, 潘紅梅, 王可甜, 王金勇, 白小青, 元 蔡, 谷山林, 陳四清, 麻常勝 申請人:重慶市畜牧科學院