專利名稱：含太子參環(huán)肽b組培苗的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種含太子參環(huán)肽B組 培苗的培養(yǎng)方法。
組織培養(yǎng)是指在人工控制的條件下，把植物體的一個器官、 一種 組織、單個細(xì)胞或離體胚等置于盛有一定培養(yǎng)基的容器中進(jìn)行生長分 化的一種培養(yǎng)方法。組織培養(yǎng)技術(shù)克服了整體植物研究中的困難，一 方面是由于所用的培養(yǎng)材料是離體的，取自植物體的一部分，減少了 整體植物中復(fù)雜的相互關(guān)系；另一方面，在人工控制條件下，人們可
以有意識地去選擇和設(shè)置一些能引起某種生理變化的因素進(jìn)行處理， 以便探索離體培養(yǎng)下組織和細(xì)胞發(fā)展變化的規(guī)律。植物組織培養(yǎng)是一 種很有潛力的新興生物技術(shù)。
太子參[尸5"e〃JosteJ7ar/a力etej"。py^77a (Miq. ) Pax ex Pax et Hoffm.]系石竹科(Caryophyllaceae)假繁縷屬(Pseudostellaria) 植物。又名異葉假繁縷，孩兒參等。被《中華人民共和國藥典》2005 年版收載。太子參以塊根入藥，是一種珍貴的中藥材。性平；味甘， 微苦。歸脾、肺經(jīng)。益氣健脾，生津潤肺。用于脾虛體倦，食欲不振， 病后虛弱，氣陰不足，自汗口渴，肺燥干咳。
太子參的化學(xué)成分主要包括環(huán)肽類如太子參環(huán)肽A-H等；苷類如
太子參皂苷、尖葉絲石竹皂苷等；糖類如蔗糖、麥芽糖、a-槐糖等; 氨基酸類如賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、蛋氨酸等；油脂類如 甘油單硬脂酸酯、磷脂?；嫉龋粨]發(fā)油等。其中，環(huán)肽成分是中藥 太子參的特征和主要成分，而太子參環(huán)肽B(Heter鄰hyllin B，HB)尤 是其商品藥材中的共有成分，可作為太子參藥材質(zhì)量控制的化學(xué)成 分。目前己開發(fā)的以太子參為原料的保健產(chǎn)品有復(fù)方太子參口服液、 太子參膠囊、太子參止咳平喘精(散)、太子寶、真空膨化太子參等系 列產(chǎn)品。原料藥材市場需求量逐年加大，藥材價格也隨之攀升，致使 野生資源采挖過度，日趨減少，進(jìn)一步發(fā)展道地太子參藥材生產(chǎn)迫在 眉睫。但是太子參生長過程中很容易被多種病蟲害侵襲，最終影響太 子參栽培藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)，使太子參的栽培規(guī)模難以擴(kuò)大。采用組 織培養(yǎng)方法，對植物體進(jìn)行脫毒并提高太子參有效成分太子參環(huán)肽B 的含量是解決目前資源匱乏的有效途徑之一。
現(xiàn)有技術(shù)目前尚無專門針對太子參環(huán)肽B含量提高的組織培養(yǎng)技 術(shù)的文獻(xiàn)報道和應(yīng)用，而報道過的方法僅是針對繁殖系數(shù)和生物量提 高的一些培養(yǎng)方法。這些方法存在著不定根誘導(dǎo)步驟復(fù)雜，需經(jīng)過外 植體到愈傷組織再到不定根的復(fù)雜步驟；愈傷組織誘導(dǎo)率低，擴(kuò)繁速 度慢，誘導(dǎo)不定根的材料受限；植物通過愈傷組織后形成的培養(yǎng)系不 穩(wěn)定；激素使用復(fù)雜，不定根誘導(dǎo)時間過長，以及太子參有效成分含

發(fā)明內(nèi)容
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本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，基于太子參環(huán)肽B 在植物體內(nèi)分布的特點(diǎn)及其在藥理方面的活性，提供一種含有效成分 太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法，此方法簡便易行，太子參組培苗及 不定根生物量提高快，太子參環(huán)肽B含量高，是獲取大量含高含量太 子參環(huán)肽B的太子參材料的有效方法。
為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供了如下的技術(shù)方案 含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法，包括以下步驟
(1) 太子參叢生芽的誘導(dǎo)、培養(yǎng)取太子參幼枝，經(jīng)洗滌消毒 后，無菌顯微條件下剝離莖尖的葉片，取帶有生長點(diǎn)的莖尖置于叢生 芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)；
(2) 太子參組培苗培養(yǎng)系的建立及太子參環(huán)肽B含量測定將步
驟(1)所得叢生芽近頂端部分切成O. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體置于生 根培養(yǎng)基內(nèi)，20—25'C條件下光照培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，生根后繼續(xù)培養(yǎng)， 并對太子參環(huán)肽B的含量進(jìn)行測定。
上述的培養(yǎng)方法，還可以進(jìn)一步包括以下第(3)步驟
(3) 太子參不定根的液體培養(yǎng)與太子參環(huán)肽B含量測定將太 子參組培苗中誘導(dǎo)初出的不定根用解剖刀切下，用無菌蒸餾水洗去不 定不定根表面的培養(yǎng)基，在無菌條件下稱取0. 5g置于液體培養(yǎng)基中， 在100-130r/min的旋轉(zhuǎn)震蕩器中懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)；并進(jìn)行太子參環(huán)肽 B含量分析。
本發(fā)明具體的方法如下
步驟(1)中所采用的消毒方法為太子參幼枝用自來水清洗3-5 遍，置于肥皂液中浸泡1小時后再用流水沖洗1-2小時，取出用無菌濾紙吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后用無菌 水沖洗3次，吸干表面水分后置于10%的過氧化氫溶液中浸泡13分 鐘，取出后用無菌蒸餾水沖洗6次，吸干表面水分并在無菌顯微條件 下進(jìn)行莖尖剝離后置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 6-卞基氨基嘌呤 (6-BA) 1.5mg/L中培養(yǎng)，滅菌前培養(yǎng)基PH值精密調(diào)至6. 5。
步驟(2)是將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養(yǎng)基中 分別加入奈乙酸(NAA) 0. 1-2. Omg/L、吲哚乙酸(IAA) 0. 1-3. Omg/L、 吲哚丁酸(IBA) 0. 1-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1. 0 mg/L、脫落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2,4-D) 0.5-1.5mg/L中的一種或幾種植物激素
所配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)；滅菌前培養(yǎng)基PH值精密調(diào)至 6.5;太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量用高效液相色譜(HPLC) 測定，條件如下安捷倫生產(chǎn)的Agilent 1100 series;色譜柱為Agilent ZORBAXSB-C18， 5 u m， 4.6X 150mm;柱溫30°C;流動相為水 乙腈=73: 27;流動相流速lml/min;檢測波長192nm; HB的保 留時間(RT)為14.003min;總環(huán)肽溶液進(jìn)樣后收取14min的吸收峰 進(jìn)行FAB-質(zhì)譜分析，得到分子量為777的[M-i;r峰，證明為 HB[M=778]。
將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養(yǎng)基中分別加入奈乙 酸(NAA)O. l-2.0mg/L、卩引哚乙酸(IAA)O. 1-3. Omg/L、卩引哚丁酸(IBA) 0. l-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤 (6-BA) 0. l-1.0mg/L、脫落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧 乙酸(2,4-D) 0.5-1.5mg/L中的一種和幾種植物激素所配制的培養(yǎng) 基NAA或NAA + IBA或NAA+IBA+2. 4-D或NAA+IBA+ABA或NAA+ IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或NAA+IBA+ IAA+KT+6-BA中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。
步驟(3)是將步驟(2)中叢生芽直接誘導(dǎo)出的HB含量較高即 不低于850. 31 ii g/g組培苗干重的不定根從組培苗中切下，洗去培養(yǎng) 基后精密稱量0. 5g接種到含有奈乙酸(NAA) 0. 1-2. Omg/L、吲哚丁 酸(IBA)O.卜4. 0mg/L、6-卞基氨基嘌呤(6-BA)0. 1-1. Omg/L的1/2MS 液體培養(yǎng)基中，懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)，其含量測定方法同權(quán)利要求3中步驟 (2)。
其中上述所有步驟太子參環(huán)肽B含量分析采用Excel軟件進(jìn)行分 析評價。
與現(xiàn)有技術(shù)相比較，本發(fā)明的優(yōu)異性在于:本發(fā)明不定根誘導(dǎo)步 驟簡化，只需經(jīng)過外植體至不定根的步驟；不定根的誘導(dǎo)率高、誘導(dǎo) 時間短，生物量生長快，培養(yǎng)系穩(wěn)定，太子參環(huán)肽B含量較高；誘導(dǎo) 與培養(yǎng)方法簡單、效率高，其中太子參生長點(diǎn)誘導(dǎo)成苗率在97%以 上，叢生芽誘導(dǎo)不定根的生根率大于99%;本發(fā)明太子參組培苗生 物量增長快，不定根生長迅速，太子參環(huán)肽B含量高。
具體實(shí)施例方式
下面對本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明。本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方 案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但 本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以此為限。
實(shí)施例1:
取太子參[尸sei/J。5^e77ar/a力"aro/ 力/77a (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.]幼枝，用自來水清洗3 — 5遍，置于肥皂液中浸泡1小時后再
用流水沖洗1一2小時。取出用無菌濾紙吸干表面水分，用75%的乙 醇浸泡消毒20—40秒，然后用無菌水沖洗3次，吸干表面水分后置 于0. 1%的氯化汞溶液中浸泡20分鐘，取出后用無菌蒸餾水沖洗6次， 吸干表面水分并在無菌顯微條件下進(jìn)行莖尖剝離。無菌顯微條件下剝 離莖尖的葉片，取帶有生長點(diǎn)的莖尖置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA) L5mg/L (滅菌前培養(yǎng)基PH值精密調(diào)至6. 5) 中培養(yǎng)。
將步驟(l)所得叢生芽用解剖刀將近頂端部分切成0.8-1.0cm帶 節(jié)間的外植體，將外植體的生物學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基(MS +NAA1. 5mg/L，滅菌前培養(yǎng)基ra值精密調(diào)至6. 5)中進(jìn)行不定根的誘 導(dǎo)。每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架中光照培養(yǎng)。培 養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99%。培養(yǎng)60d時對該組培 苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為0.405g是接種量的 40. 5倍。
太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量用高效液相色譜(HPLC)測 定，條件如下安捷倫生產(chǎn)的Agilent 1100 series;色譜柱為Agilent Z0RBAXSB-C18， 5um， 4.6X 150mm;柱溫30°C;流動相為水 乙腈=73: 27;流動相流速lml/min;檢測波長192nm。 HB的保 留時間(RT)為14.003分鐘?？偔h(huán)肽溶液進(jìn)樣后收取14分鐘的吸收 峰進(jìn)行FAB-質(zhì)譜分析，得到分子量為777的[M-l]-峰，證明為 HB[M=778]。
經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的太子參組培苗中太子參 環(huán)肽B的含量為492. 33 ii g/g組培苗干重。
實(shí)施例2:
先按實(shí)施例1的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢
生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物學(xué) 下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0. 5mg/L)，每 瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架中光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時 外植體開始生根，其生根率大于99%。培養(yǎng)60d時對該組培苗進(jìn)行 收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為0. 25g是接種量的25倍。再 進(jìn)行HPLC分析(所用方法與實(shí)施例1相同)，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 的太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為170. 07 u g/g組培苗干重。 實(shí)施例3:
先按實(shí)施例l的方法步驟(O獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢 生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物 學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0.5mg/L +2， 4-Dl. Omg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架 中光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99%。培 養(yǎng)60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為 0. 24g是接種量的24倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的 太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為134. 32 u g/g組培苗干重。
實(shí)施例4:
先按實(shí)施例l的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢 生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物 學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0.5mg/L +ABA0. 3mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架中 光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99%。培養(yǎng)
60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為0. 29g 是接種量的29倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的太子參 組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為323. 93 u g/g組培苗干重。 實(shí)施例5:
先按實(shí)施例l的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢 生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物 學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAAO. 8mg/L+IBA0. 5mg/L + 6-BAO, 2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架中 光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99%。培養(yǎng) 60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為0. 30g 是接種量的30倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的太子參 組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為320. 32 y g/g組培苗干重。
實(shí)施例6:
先按實(shí)施例l的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢 生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物 學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAAO. 6mg/L+IAA0.5mg/L +6-BA0. lmg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的培養(yǎng)架中 光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99%。培養(yǎng) 60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重為0. 38g 是接種量的38倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的太子參 組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為372. 30 u g/g組培苗干重。
實(shí)施例7:
先按實(shí)施例1的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢
生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物學(xué) 下端插入特制MS固體培養(yǎng)基中(MS+NAA0.5mg/L+IBA0.5mg/L+ IAAO. 5mg/L+KT0. 5mg/L)，'每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm的 培養(yǎng)架中光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7 d時外植體開始生根，其生根率大于99 %。培養(yǎng)60 d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干 重為0. 41g是接種量的41倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 的太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為695. 23 P g/g組培苗干重。 實(shí)施例8:
先按實(shí)施例1的方法步驟(1)獲得叢生芽，然后用解剖刀將叢生 芽近頂端部分切成1cm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生物學(xué)下端插入 特制MS固體培養(yǎng)基中(MS十NAAO. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+IAA0. 5mg/L +KTO. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L)，每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm 的培養(yǎng)架中光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99 %。培養(yǎng)60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重 為0. 45g是接種量的45倍。經(jīng)HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的 太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量為850. 31 u g/g組培苗干重。 實(shí)施例9:
取太子參幼枝，用自來水清洗3—5遍，置于肥皂液中浸泡1小 時后再用流水沖洗1一2小時。取出用無菌濾紙吸干表面水分，用75 %的乙醇浸泡消毒20—40秒，然后用無菌水沖洗3次，吸干表面水 分后置于10%的過氧化氫溶液中浸泡13分鐘，取出后用無菌蒸餾水 沖洗6次，吸干表面水分并在無菌顯微條件下進(jìn)行莖尖剝離。無菌顯 微條件下剝離莖尖的葉片.，取帶有生長點(diǎn)的莖尖置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 基MS+6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 1.5mg/L中培養(yǎng)得叢生芽。用解剖刀
將叢生芽近頂端部分切成0. 8-1. Ocm帶節(jié)間的外植體，將外植體的生 物學(xué)下端插入特制MS固體培養(yǎng)基(MS+NAAO. 5mg/L+IBA0. 5mg/L+ IAAO. 5mg/L+KT0. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L，滅菌前培養(yǎng)基PH值精密調(diào) 至6. 5)中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。每瓶插5苗，置于距30W日光燈35cm 的培養(yǎng)架中光照培養(yǎng)。培養(yǎng)7d時外植體開始生根，其生根率大于99 %。培養(yǎng)60d時對該組培苗進(jìn)行收獲，平均每瓶太子參組培苗的干重 為0. 45g是接種量的45倍，經(jīng)檢測其太子參環(huán)肽B含量為850. 31 u g/g組培苗干重。
按上述叢生芽直接誘導(dǎo)不定根的方法誘導(dǎo)出太子參不定根，誘 導(dǎo)出根后5天，將太子參不定根從組培苗中小心切下，洗去培養(yǎng)基后 精密稱量0.5g接種到液體培養(yǎng)基中(l/2MS + NAA0.5mg/L + IBAO. 5mg/L+6-BAO. 2mg/L，滅菌前培養(yǎng)基PH值精密調(diào)至6. 5)，以 轉(zhuǎn)速為120r/min的速度懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)20d時對該組培苗進(jìn)行 收獲，平均每瓶太子參不定根的干重為0.79g是接種量的74倍。經(jīng) HPLC分析，得出該條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)的太子參不定根中太子參環(huán)肽B 的含量為209.85"g/g組培苗干重。液體培養(yǎng)基中太子參環(huán)肽B的 含量為7.2ug /ml培養(yǎng)液。
太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量用高效液相色譜(HPLC)測 定，條件如下:安捷倫生產(chǎn)的Agilent 1100 series;色譜柱為Agilent Z0RBAXSB-C18， 5um， 4.6X 150mm;柱溫30°C;流動相為水 乙腈=73: 27;流動相流速lml/min;檢測波長192nm。 HB的保 留時間(RT)為14.003分鐘?？偔h(huán)肽溶液進(jìn)樣后收取14分鐘的吸收 峰進(jìn)行FAB-質(zhì)譜分析，得到分子量為777的[M-l]-峰，證明為 HB[M=778]。
權(quán)利要求
1、含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法，包括以下步驟(1)太子參叢生芽的誘導(dǎo)、培養(yǎng)取太子參幼枝，經(jīng)洗滌消毒后，無菌顯微條件下剝離莖尖的葉片，取帶有生長點(diǎn)的莖尖置于叢生芽培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)太子參組培苗培養(yǎng)系的建立及太子參環(huán)肽B含量測定將步驟(1)所得叢生芽近頂端部分切成0.8-1.0cm帶節(jié)間的外植體置于生根培養(yǎng)基內(nèi)，20-25℃條件下光照培養(yǎng)誘導(dǎo)生根，生根后繼續(xù)培養(yǎng)，并對太子參環(huán)肽B的含量進(jìn)行測定。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的方法，其特 征是經(jīng)過步驟(1)和(2)之后，可進(jìn)一步進(jìn)行下述第(3)步驟(3) 太子參不定根的液體培養(yǎng)與太子參環(huán)肽B含量測定將步 驟(1)和(2)太子參組培苗中誘導(dǎo)出的不定根用解剖刀切下，用無 菌蒸餾水洗去不定根表面的培養(yǎng)基，在無菌條件下稱取0. 5g置于液 體培養(yǎng)基中，在100-130r/min的旋轉(zhuǎn)震蕩器中懸浮培養(yǎng)；同時進(jìn)行 太子參環(huán)肽B的含量測定。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法， 其特征是步驟(1)中所采用的消毒方法為太子參幼枝用自來水清 洗3-5遍，置于肥皂液中浸泡1小時后再用流水沖洗1-2小時，取出 用無菌濾紙吸干表面水分，用75%的乙醇浸泡消毒20-40秒，然后 用無菌水沖洗3次，吸干表面水分后置于10%的過氧化氫溶液中浸泡 13分鐘，取出后用無菌蒸餾水沖洗6次，吸干表面水分并在無菌顯 微條件下進(jìn)行莖尖剝離后置于叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 6-卞基氨基嘌1002 96.71呤(6-BA) 1. 5mg/L中培養(yǎng)。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法， 其特征是步驟(2)是將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養(yǎng) 基中分別加入奈乙酸(NAA) 0. 1-2.0mg/L、吲哚乙酸(IAA ) 0. l-3.0fflg/L、 B引哚丁酸(IBA) 0. 1-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2.0mg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1. Omg/L、脫落酸(ABA) 0. l-1.0mg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0. 5-1. 5mg/L中的一種 或幾種植物激素所配制的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)；滅菌前培養(yǎng)基 TO值精密調(diào)至6. 5;太子參組培苗中太子參環(huán)肽B的含量用高效液相 色譜(HPLC)測定，條件如下安捷倫生產(chǎn)的Agilent 1100 series;色 譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18, 5 u m， 4.6X150mm;柱溫30°C;流動相為水乙腈=73: 27;流動相流速lml/min;檢測波長192nrn; HB的保留時間(RT)為14.003min;總環(huán)肽溶液進(jìn)樣后收 取14min的吸收峰進(jìn)行FAB-質(zhì)譜分析，得到分子量為777的[M-l]' 峰，證明為太子參環(huán)肽B[M-778]。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方 法，其特征是將步驟(1)中所得的叢生芽置于MS固體培養(yǎng)基中分別 加入奈乙酸(醒)0. 1-2. Omg/L、吼哚乙酸(IAA) 0. 1-3. Omg/L、吲 哚丁酸(IBA) 0. l-4.0mg/L、 6-糠基氨基嘌呤(KT) 0. 1-2. Omg/L、 6-卞基氨基嘌呤(6-BA) 0. 1-1.0mg/L、脫落酸(ABA) 0. 1-1. Omg/L、 2， 4-二氯苯氧乙酸(2，4-D) 0.5-1.5mg/L中的一種和幾種植物激素 所配制的培養(yǎng)基NAA或NAA+IBA或NAA + IBA+2. 4D或NAA+IBA + ABA或NAA+IBA+6-BA或NAA+IAA+6-BA或NAA+IBA+IAA+KT或 NAA+IBA + IAA+KT+6-BA中進(jìn)行不定根的誘導(dǎo)。
6、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法， 其特征是步驟(3)是將步驟(2)中叢生芽直接誘導(dǎo)出的太子參環(huán)肽 B含量較高即不低于850. 31 P g/g組培苗干重的不定根從組培苗中切 下，洗去培養(yǎng)基后精密稱量0.5g接種到含有奈乙酸0. 1-2.0mg/L、 吲哚丁酸0. 1-4. 0mg/L、卞基氨基嘌呤0. 1-1, 0 mg/L的1/2MS液體 培養(yǎng)基中，懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)，其含量測定方法同權(quán)利要求4的步驟(2)。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法， 其特征是太子參環(huán)肽B含量分析采用Exel軟件進(jìn)行分析評價。
全文摘要
本發(fā)明基于太子參環(huán)肽B在植物體內(nèi)分布的特點(diǎn)及其在藥理方面的活性，提供一種含有效成分太子參環(huán)肽B組培苗的培養(yǎng)方法，包括太子參叢生芽的誘導(dǎo)、培養(yǎng)和太子參組培苗培養(yǎng)系的建立及太子參環(huán)肽B含量測定，還可進(jìn)一步包括太子參不定根的液體培養(yǎng)與太子參環(huán)肽B含量測定。本方法簡便易行，太子參組培苗、不定根生物量生長快，太子參環(huán)肽B含量高，是獲取大量高含量太子參環(huán)肽B的太子參材料的有效途徑。
文檔編號A01H4/00GK101352147SQ200810058900
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月11日
發(fā)明者軍 唐, 張穎君, 朱宏濤, 許文彥, 譚寧華 申請人:中國科學(xué)院昆明植物研究所