專利名稱：：紅樹植物根際促生固氮菌(dzy-hs14)及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種對紅樹林植物具有良好促生效果紅樹林根際固氮菌及其制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：紅樹林為自然分布于熱帶、亞熱帶海岸潮間帶的木本植物群落，覆蓋大約60-75%熱帶和亞熱帶海岸，對維護海灣河口的生態(tài)平衡起重要作用，是海洋生產(chǎn)力的重要組成部分(Holguineta1.,2001),被認(rèn)為是具有較高生產(chǎn)力的生態(tài)系統(tǒng)。該生態(tài)系統(tǒng)具有較高的有機質(zhì)水平(全球每年凋落物為100TgC)，為毗連的沿岸水域和相關(guān)的生物群落生境提供有機物(Holguinetal.,2001;LugomelaandBergm叫2002)。然而紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的無機營養(yǎng)較貧乏，尤其是無機氮水平較低(Holguinetal.,1992;Vazquezetal.,2000)，固氮生物的生物固氮被證明是紅樹林生態(tài)系統(tǒng)無機氮的主要來源(HicksandSylvester,1985;Kyaruzietal2003)。生物固氮作為紅樹林生態(tài)系統(tǒng)和生源元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要環(huán)節(jié)，對紅樹林生態(tài)系統(tǒng)及生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生極大的影響。由于人類的過度開發(fā)、圍海造地和都市化等行為，使全球的紅樹林正以驚人的速度減少，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織保守的數(shù)據(jù)估算，紅樹林正以每年平均減少1-2%的速度消失，其速度甚至超過了珊瑚礁和熱帶森林的消失速度。在發(fā)展中國家中，消失的速度更快，而紅樹林的90%以上位于發(fā)展中國家。美國紅樹林行動項目組負(fù)責(zé)人Aheredo(1999)認(rèn)為，熱帶亞熱帶國家曾在3/4的海岸線上分布有紅樹林，現(xiàn)在僅剩下不到一半，而且大部分紅樹林為嚴(yán)重退化的生態(tài)系統(tǒng)?？茖W(xué)家預(yù)言，如果任其發(fā)展，在未來的近100年內(nèi)，人類將徹底失去紅樹林(Duke，2007)。近年來，紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的維護和紅樹林植株的保育等研究成為熱門研究領(lǐng)域，也有多個國際組織和團體發(fā)起的旨在保護紅樹林的國際會議?！吨袊?1世紀(jì)議程》(1994)優(yōu)先項目計劃中把紅樹林恢復(fù)與重建技術(shù)納入了議事日程。ITT0組織，2002-2006年的計劃目標(biāo)亦把紅樹林生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)列為首要資助目標(biāo)之一(廖寶文，2005)。可見紅樹林濕地生態(tài)系統(tǒng)的恢復(fù)工作亟需我們大力開展，但無論理論的研究還是實際恢復(fù)工作的開展都面臨較大困難。紅樹林的恢復(fù)建設(shè)工作一直比較緩慢，這主要是由于紅樹林造林成活率極低(廖寶文，1999)。墨西哥和印度等國家的科學(xué)家利用植物生長促生菌(PGPB，plantgrowth-promotingbacteria)對紅樹林進行促生，取得了一定階段性進展，但發(fā)現(xiàn)的適合紅樹林促生的菌種仍為少數(shù)，此類菌種依舊缺少且多數(shù)被保密收藏。目前中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所正與墨西哥西北生物研究中心合作，引進相關(guān)菌種對我國主要紅樹植物進行接種測試和相關(guān)菌劑研究，以期解決我國灘涂地段紅樹林造林成活率極低的棘手問題。然而，引進菌種在我們國家紅樹林中的成活率小，并且也存在外種入侵所會產(chǎn)生的各種隱患。
發(fā)明內(nèi)容-本發(fā)明的目的是提出一株從中國熱帶紅樹植物根系中篩選出的，具有較高的生物固氮活性的紅樹植物根際促生固氮菌新種。本發(fā)明的另一目的是提出所述的紅樹植物根際促生固氮菌在制備生物固氮菌肥的應(yīng)用。本發(fā)明所提出的紅樹植物根際促生固氮菌，是從海南省三亞市的熱帶紅樹林區(qū)紅樹植物根際沉積物樣品中篩選出來的固氮菌新種。其分類命名為芽胞桿菌屬30"7/^5.02^1^14。該菌于2007年4月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址中國武漢市武漢大學(xué))，保藏編號CCTCCNO:M207043。本發(fā)明所述菌種的菌學(xué)特性描述如下-革蘭氏陽性，桿狀，產(chǎn)生橢圓形芽孢(圖1--圖4),有周生鞭毛。0.1X4-9Wn，個體差異很大(如圖6)。氧化酶陽性，接觸酶陽性，好氧或者兼性厭氧。在Ashby、LB以及BUG培養(yǎng)基上生長良好。在Ashby培養(yǎng)基上經(jīng)過5d左右培養(yǎng)可以長為直徑4-5cm左右，白色、圓形、邊緣整齊的扁平菌落(如圖1)。對抗生素多數(shù)敏感，抗藥性較小。芽孢桿菌是常見固氮菌種。該屬細(xì)菌在紅樹林中也有發(fā)現(xiàn)過,并報道過有固氮作用。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下，其固氮活性25-80umolC2H2h"mg"鮮重。從菌株fec^7wssp.DZY-HS14的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，運用固氮基因特定的引物PolF/PolR(參考Polyeta1.,2001)和細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(參考Weisenburgetal.，1998)進行PCR擴增，均擴增到理想的目的條帶，證明該菌株具有固氮基因(圖5)。通過測序分析得到固氮基因"i//序列和16SrDNA序歹U,通過GenBank中的BLAST軟件將"!;/H序列和16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，在數(shù)據(jù)庫中沒有找到完全相似的序列，表明這2條基因序列為首次發(fā)現(xiàn)的新基因序列。向基因庫成功遞交新基因序列得到登錄號為EU707337和EU707338。在GenBank數(shù)據(jù)庫中選取了部分與測定的16SrDNA序列相似性較高的代表性基因序列，通過ClustalW軟件和Mega軟件以Ndbor-joining方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(見圖7)，進行系統(tǒng)發(fā)育分析。從系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)可以看出與菌株5ac///^sp.DZY-HS14的16SrDNA序列具有較近親緣關(guān)系的序列均來自芽孢桿菌屬(5"c///wj)，并且與已知菌株及tefew/ww/j的16SrDNA序列具有98°/。的相似性，與該屬中的已知菌株及"^^氾"具有97%的同源性。生理生化結(jié)果表明，該菌和與它親緣關(guān)系最相近的兩株已知菌株明顯不同(表l)，這表明菌株5acW7ussp.DZY-HS14為一株新種。表15.Wc力e/^7b/7w's、和fec/7A/5"sp.DZY-HS14指標(biāo)比較(+:表示陽性反應(yīng)；-:表示陰性反應(yīng))<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>氧化酶厭氧生長V.P.葡萄糖產(chǎn)氣D-葡萄糖D-阿拉伯糖D-木糖D-甘露醇明膠淀粉檸檬酸鹽B引哚2%NaCL+++5%NaCL+++7%NaCL+-+票NaCL+-+乳糖--脲酶++硝酸鹽還原++-注及/;c/je加/orm"數(shù)據(jù)參考東愛珠《常見細(xì)菌鑒定手冊》。及"/a&"w's數(shù)據(jù)來自Bac!7/zww!a6e"化sp.nov.，isolatedfromcotton-wastecompostsformushroomcultivationInt.J.Syst.Evol.Microbiol.57(8)，1卯9-1913(2007)用含fe""〃ssp.DZY-HS14的菌液處理兩種紅樹木欖(5rt/gwz'eragy附"o"Wza)和紅海欖(及Wzo//wra)，結(jié)果如表2所示。表2SaciJ7i/ssp.DZY-HS14對木欖和紅海欖肝處理45天后的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注表中值均為IO組平行樣平均值。生物量中重量指濕重；剩下重量均指干重。從表2中我們可以看出該菌對于木欖和紅海欖有著良好的促生作用。和對照組相比，光合色素含量平均值明均明顯高于對照組?？?cè)~綠素含量平均值高于木欖對照組139.7%，高于紅海欖對照組34.01%。胡蘿卜素含量也分別比木欖和紅海欖對照組高183.4%和20.6%。對于葉面積的生長促進作用也比較明顯，分別促進木欖和紅海欖葉面積180.7%和72.6%。而對于不同樹種的地上和地下的促進則不相同，對于木欖促進地下部分效果好些，對于紅海欖促進地上部分效果好些。這些結(jié)果表明，用含有該菌的菌劑接種海欖、紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此，該菌可以作為制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。本發(fā)明將在以下方面產(chǎn)生有益效果該菌種是從中國熱帶紅樹植物根系中篩選分離出來的，適合本地各種環(huán)境條件，對于紅樹林植物的促生效果較好，可用于自然紅樹林生態(tài)系統(tǒng)菌肥的生產(chǎn)工程菌，提髙紅樹林生態(tài)系統(tǒng)的生產(chǎn)力，有望用于紅樹林恢復(fù)、造林的艱巨任務(wù)中。圖1、圖2、圖3和圖4分別是5flc///^sp.DZY-HS1菌落不同放大倍數(shù)的透射電鏡照片；圖5是菌株50"7/^5.02丫-1181的電泳圖，圖中，1:基因組DNA，2:16SrDNA，3:擴增到的固氮基因附y(tǒng)H，Ml:ADNA/EcoRI+HindIII,M2:DL2000;)的基因組DNA、16S、以及擴增到的固氮基因wyf;圖6顯示菌株5sd77Msp.DZY-HS14透射電鏡測定大??；圖7是菌株5a"7/船sp.DZY-HS1在16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育樹中位置。具體實施方式一、材料與方法1、材料l.l土樣采集樣品采自海南省三亞市紅沙河沿岸紅樹林區(qū)紅樹植物根際沉積物，樣品采集后裝入滅菌的封口聚乙烯袋中，帶回實驗室低溫保存。1.2培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基甘露醇10.0g，KH2P04H200.2g，MgS047H200.2g，NaCl0.2g，CaS04O,lg，CaCO35.0g，去離子水lOOOmL,pH7.0。Ashby固體培養(yǎng)基Ashby液體培養(yǎng)基+2.2%瓊脂。改良D6bereiner無氮液體培養(yǎng)基蔗糖10g，蘋果酸5.0g,K2HP04H20O.lg，KH2P04.H200.4g，MgS047H200.2g，NaClO.lg,Na2M004'H200.002g，F(xiàn)eCl30.01g,去離子水1000ml,pH7.0。LB培養(yǎng)基酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCllOg，瓊脂1-2%,去離子水1000ml,pH7.0。2、方法2.1菌種分離將樣品混勻后取約lg于200mlAshby、D(3bereiner或者Ashby+DObereiner無氮液體培養(yǎng)基(Ashby培養(yǎng)基與De)bereiner培養(yǎng)基以1:1比例混合)中，30'C恒溫48h進行加富培養(yǎng)。然后將菌液分別稀釋至10-4、10-5、10-6三個稀釋度,各稀釋度的菌懸液以涂布法接種于Ashby固體培養(yǎng)基上，30°C48h培養(yǎng)后選擇典型的單一菌落進一步純化。2.2菌種純化將分離出的菌落，用接種針挑取典型的單一菌落，經(jīng)涂片染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，如所分離的菌落不純，應(yīng)做系列稀釋后再次用平板涂布法分離，直至獲得純種。將純化后的菌株接種于無氮Ashby固體培養(yǎng)基和LB全培養(yǎng)基甘油保存。2.3液體培養(yǎng)中固氮酶活力測定采用乙炔還原法測定固氮活性(參考Capone1993),將斜面保存的純菌株接種于10ml液體改良D6bereiner培養(yǎng)基內(nèi)，于30。C搖床振蕩培養(yǎng)72h，分別取1ml于滅菌的5ml小瓶中，蓋上橡皮塞。用注射器從容器中抽走5%空氣，然后加入相同體積的乙炔氣體。每個樣品設(shè)3個重復(fù)，l個空白對照，對照容器中不加入乙炔氣體。所有樣品于3(TC孵育12h，用SQ-204氣相色譜檢測乙烯的生成量。乙炔還原法(ARA)表明該菌可以利用N2作為氮源，且具有較高的生物固氮活性，純培養(yǎng)條件下平均固氮活性為25-80pmolC2H2h"mg"鮮重。2.4DNA的提取與純化方法參考東秀珠《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》P409。2.5"1y^基因的擴增采用固氮細(xì)菌的"(//基因通用引物PolF/PolR(參考Polyetal.，2001)進行PCR擴增PolF:5'-TGCGA(C/T)CC(G/C)AA(A/G)GC(C/G/T)GACTC-3'，PolR:5,-AT(G/C)GCCATCAT(C/T)TC(A/G)CCGGA-3'。經(jīng)過多次實驗后建立了適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。PCR反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)程序是:<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>取2^1PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序。得到的niffl序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號為EU70733S。2.616SrDNA全序列的擴增采用細(xì)菌16SrDNA全序列通用引物16SF/16SR(Weisenburgetal.，1998)，16SF:5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，，16SR:5,-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3，，進行PCR擴增。經(jīng)過多次實驗后建立了適宜的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下PCR反應(yīng)體系包括PCR反應(yīng)程序是提取的模板(未稀釋)1^1預(yù)變性95°C5min上、下游引物(lmM)各lpl變性95°C30s10xPCR緩沖液5^1退火55°C30sMgCl2(25mM)4nl延伸72°C1mindNTP混合液(各10mM)1^1后延伸72°C10min牛血清白蛋白(5mgml")1piEx-Taq酶(5，")0.4pi無菌水34pl總計50pl取2^1PCR反應(yīng)產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余的PCR產(chǎn)物直接交與Invitrogen生物技術(shù)有限公司用ABIPrism3730XLDNA分析系統(tǒng)測序。得到的16SrDNA序列直接遞交Genbank數(shù)據(jù)庫，序列號為EU707337。利用DNAMAN軟件對測序結(jié)果進行同源性比較，利用BLAST軟件將測定得到的基因序列與GenBank(www.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫進行序列比對分析，獲取相近典型菌株的16SrDNA基因序列，然后利用BIOEDIT中的ClustalW對序列進行排列，利用Mega中的鄰接法(Neighbor-Joining)建立16SrDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中的遺傳距離用Tamura-Nei公式計算，枝長代表了分歧程度，各枝上的數(shù)字是1000次bootstrap重抽樣分析的支持百分比。2.7菌株制劑在土壤中的有效性試驗將該菌Backussp.DZY-HS1接種到無氮Ashby液體培養(yǎng)基中，直至濃度為10scell/ml，待用。采用2種紅樹植物-木欖和紅海欖進行盆栽實驗。每種紅樹10個平行樣。外加對照。塑料盆放在露天條件下，用已準(zhǔn)備好的菌液浸泡紅樹根部3-4h后栽種入塑料盆。45天后測量各個指標(biāo)。對比實驗指標(biāo)為植物根、葉面積、植株重量、光合色素等。結(jié)果如表2所示。權(quán)利要求1、一種紅樹植物根際促生固氮菌，該菌是從熱帶紅樹林區(qū)紅樹植物根際沉積物樣品中篩選出來的芽胞桿菌屬Bacillussp.DZY-HS14，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM207043。2、權(quán)利要求1所述的紅樹植物根際促生固氮菌在制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明提供一種紅樹植物根際促生固氮菌(DZY-HS14)及其應(yīng)用，該菌是從熱帶紅樹植物根際沉積物中篩選出來的芽胞桿菌屬Bacillussp.DZY-HS14，含有16SrDNA序列和固氮基因nifH，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCNOM207043。該菌種具有較高的生物固氮活性，用含有該菌的菌劑接種紅海欖和木欖等紅樹植物可以明顯促進植株生長，因此可以作為制備促進紅樹林植物生長的生物固氮菌肥的應(yīng)用。文檔編號C05F11/08GK101298600SQ200810028970公開日2008年11月5日申請日期2008年6月23日優(yōu)先權(quán)日2008年6月23日發(fā)明者娟凌,吳梅林,偲張,張燕英,楊志浩,王友紹,董俊德申請人:中國科學(xué)院南海海洋研究所