專利名稱：綠色木霉耐藥性菌株及其與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及綠色木霉耐藥性菌株及其與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用的方法，具體涉及一種綠色木霉耐藥性菌株的誘發(fā)及其篩選技術(shù)，及綠色木霉耐藥性菌株與殺菌劑(速克靈、醚菌酯)的相協(xié)同的復(fù)合制劑及其施用技術(shù)。
背景技術(shù)：
木霉是自然界中普遍存在的一類真菌，在土壤、植物根圍、葉圍及種子、球莖表面經(jīng)?？梢苑蛛x到。近些年人們發(fā)現(xiàn)某些木霉是植物病原真菌的寄生菌或拮抗菌，如哈茨木霉(T.harzianum)、鉤狀木霉(T.hamatum)、綠色木霉(T.viride)可以防治真菌病害。迄今為止有關(guān)木霉在生防方面的研究已開(kāi)展近70年，在國(guó)外已經(jīng)出現(xiàn)了商品化的木霉制劑。如以防治李屬果樹銀葉病(Chondrostereum purpureum)的木霉制劑在西歐已商品化生產(chǎn)；以色列的Makhteshim Agan公司開(kāi)發(fā)的以哈茨木霉T39菌株為發(fā)酵液的生防制劑，商品名Trichodex，劑型為25％可濕粉，它可以用于防治灰霉病菌(Botrytis cinerea)、菌核病菌(Scleratina sclerotiorum)、葉霉病(Cladosporium fulvum)、霜霉病(Pseudoperonasplra cubensis)和白粉病(Sphaerotheca fuliginea)等葉部病害，在國(guó)內(nèi)也有研究利用木霉菌控制植物病害。
從公開(kāi)報(bào)道的文獻(xiàn)中可以看到人們對(duì)生防木霉菌的研究，大多集中在菌株的篩選、鑒定、發(fā)酵培養(yǎng)及其利用等方面。其中，我們所篩選的綠色木霉(Trichoderma viride)是一種具有廣譜抑病能力的真菌，可以通過(guò)拮抗、競(jìng)爭(zhēng)、寄生、誘導(dǎo)抗性、促生等作用方式，對(duì)多種植物病害具有明顯的防治作用。但是由于木霉菌制劑為活孢子制劑，單獨(dú)使用控制作物病害會(huì)受到作用方式等的影響，造成施用效果欠佳，具一定遲效性，且存在活性不穩(wěn)問(wèn)題，因此阻礙了生物制劑的規(guī)?；a(chǎn)應(yīng)用。
目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中仍以使用化學(xué)藥劑為主，且生物農(nóng)藥還不能解決生產(chǎn)中存在的所有問(wèn)題，在使用過(guò)程中化學(xué)藥劑會(huì)對(duì)生物制劑產(chǎn)生抑制作用，因此造成生物制劑與化學(xué)藥劑兩者之間成為一對(duì)矛盾體。因而為解決生防制劑應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題，同時(shí)減少化學(xué)農(nóng)藥的施用劑量，提出利用綠色木霉的耐藥性菌株，將耐藥性綠色木霉與化學(xué)藥劑混合使用，通過(guò)施用對(duì)植物病原菌有特異性的殺菌劑并引進(jìn)耐藥性拮抗木霉菌株，實(shí)現(xiàn)控制植物病害的有益互作。對(duì)于提高生防制劑的防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量及農(nóng)藥殘留將有一定的幫助。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在研究一種利用綠色木霉耐藥性菌株及其與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的的。
主要包括將綠色木霉耐藥性菌株與殺菌劑的混合施用的方法，包括由綠色木霉(Trichodermaviride)耐藥性菌株的誘發(fā)及其篩選，殺菌劑(速克靈、醚菌酯等)與綠色木霉耐藥性菌株的協(xié)同作用，及通過(guò)綠色木霉耐藥性菌株發(fā)酵孢子、殺菌劑相協(xié)同的復(fù)合制劑及其施用技術(shù)，本發(fā)明的特征在于誘發(fā)具防治植物病害活性綠色木霉的耐藥性，生物制劑中加入殺菌劑、孢子保護(hù)劑等的協(xié)同制劑配方和施用技術(shù)。
具體實(shí)施例方式
下面進(jìn)一步詳述本發(fā)明。
1、綠色木霉對(duì)速克靈、醚菌酯耐藥性菌株的篩選及誘導(dǎo)綠色木霉菌株耐藥性的研究經(jīng)對(duì)具強(qiáng)拮抗灰葡萄孢霉活性的綠色木霉菌，采用射線照射(30W、直線距離30cm、照射30min)和藥劑亞致死劑量(500μg/ml)方法，進(jìn)行綠色木霉耐藥性菌株的人工誘發(fā)，并進(jìn)行耐藥性菌株的篩選，獲得高耐藥性菌株3株、中等耐藥性菌株28株、敏感性菌株3株。其中高耐藥性菌株分別為Tr9701、Tr2008、Tr2009，具有較強(qiáng)的耐受速克靈、醚菌酯藥劑活性。
對(duì)篩選的高耐藥菌株孢子懸液于藥劑選擇壓力高的條件下(500μg/ml)培養(yǎng)，3天內(nèi)即可長(zhǎng)出較為旺盛的菌落。
經(jīng)亞致死劑量藥劑馴化法對(duì)篩選的高耐藥性綠色木霉菌株進(jìn)行誘導(dǎo)綠色木霉菌對(duì)速克靈、醚菌酯耐藥性試驗(yàn)，由試驗(yàn)結(jié)果可知速克靈、醚菌酯對(duì)綠色木霉耐藥菌株不同培養(yǎng)世代的藥劑敏感性影響較少，差異不顯著，速克靈和醚菌酯對(duì)綠色木霉菌在藥劑亞致死劑量的不同培養(yǎng)世代抑菌活性無(wú)顯著差異。
2、速克靈、醚菌酯與綠色木霉對(duì)病菌協(xié)同作用的影響采用紙碟法進(jìn)行速克靈與綠色木霉協(xié)同對(duì)灰葡萄孢霉抑菌率進(jìn)行試驗(yàn)，速克靈和綠色木霉分別設(shè)有效含量不等的4種配比組合，速克靈有效成分與綠色木霉菌劑(孢子數(shù)為5×108個(gè)孢子/g)的配比分別為1％和98％、5％和90％、10％和80％、20％和60％，以50％速克靈WP與綠色木霉菌劑(活孢子數(shù)5×108個(gè)/g)處理為對(duì)照，分別配制成1000倍、2000倍液濃度進(jìn)行試驗(yàn)。由結(jié)果可知(見(jiàn)表1)，速克靈和綠色木霉協(xié)同作用對(duì)黃瓜灰霉病菌的抑菌作用明顯提高，速克靈與綠色木霉菌可濕性粉劑的四種配比1000倍液下，協(xié)同作用抑菌率為67.5～85.0％，較單獨(dú)采用綠色木霉菌可濕性粉劑及50％速克靈可濕性粉劑為高，單獨(dú)作用平均抑菌率分別為68.8％、45.0％。其中速克靈與綠色木霉(1∶8)1000倍液協(xié)同作用抑菌率為85.0％，2000倍液的協(xié)同作用抑菌率為54.4％，增效明顯，皆較綠色木霉菌和速克靈可濕性粉劑單獨(dú)使用的抑菌率明顯增加。
表1、速克靈濃度與綠色木霉菌可濕性粉劑對(duì)黃瓜灰霉病菌的協(xié)同作用 附2％、10％等表示添加速克靈粉劑有效成分含量分別為2％、10％等。綠色木霉制成木霉孢子粉可濕性粉劑劑型，活孢子數(shù)為5×108個(gè)/克，98％、90％等表示添加的綠色木霉粉劑比例。
通過(guò)對(duì)高拮抗灰葡萄孢霉并天然抗耐速克靈的綠色木霉耐藥性菌株進(jìn)行協(xié)同作用研究，試驗(yàn)表明，綠色木霉菌劑與速克靈結(jié)合施用對(duì)黃瓜灰霉病具有明顯的協(xié)同作用。菌和藥處理下，病原菌菌絲伸長(zhǎng)速度緩慢，致病率降低，表明被速克靈抑制的病原菌可能較易被綠色木霉菌侵染。
通過(guò)速克靈濃度對(duì)協(xié)同作用影響試驗(yàn)，獲得藥和菌之間的最佳配比(1∶8)，經(jīng)藥菌復(fù)合研制出其協(xié)同制劑木·速可濕性粉劑。
表2、醚菌酯濃度與綠色木霉菌對(duì)黃瓜白粉病菌的協(xié)同作用 附4％、6％等表示添加醚菌酯有效成分含量分別為4％、6％等。綠色木霉制成木霉孢子粉可濕性粉劑劑型，活孢子數(shù)為5×108個(gè)/克，92％、88％等表示添加的綠色木霉粉劑比例。
采用葉片漂浮法進(jìn)行醚菌酯與綠色木霉協(xié)同對(duì)黃瓜白粉病菌抑菌試驗(yàn)，結(jié)果可知(見(jiàn)表2)，醚菌酯和綠色木霉協(xié)同作用對(duì)黃瓜白粉病菌的抑菌作用明顯提高，醚菌酯與綠色木霉菌劑的四種配比1000倍液下，協(xié)同作用抑菌率為72.4～81.7％，綠色木霉菌可濕性粉劑及50％醚菌酯干懸浮劑單獨(dú)作用平均抑菌率分別為72.3％、78.8％，協(xié)同作用后明顯較單獨(dú)施用抑制效果為高。其中醚菌酯干懸浮劑與綠色木霉菌可濕性粉劑(8∶84)1000倍液協(xié)同作用抑菌率為81.7％，增效明顯，較綠色木霉菌和醚菌酯單獨(dú)使用的抑菌效果有明顯增加。
通過(guò)醚菌酯濃度對(duì)協(xié)同作用影響試驗(yàn)，獲得藥和菌之間的最佳配比(1∶10)，經(jīng)藥菌復(fù)合研制出其協(xié)同制劑木·醚可濕性粉劑。
3、速克靈、醚菌酯與綠色木霉對(duì)病菌協(xié)同制劑的配制綠色木霉活菌制劑對(duì)蔬菜灰霉、白粉病等均有良好的防治效果，但田間施用過(guò)程中，由于生物菌劑自身作用方式的差異以及環(huán)境、施用技術(shù)等因素，均會(huì)影響其防治效果。我們通過(guò)人工誘發(fā)綠色木霉耐藥性菌株，利用其耐藥活性，同時(shí)加入孢子保護(hù)劑，配制成速克靈、醚菌酯與綠色木霉的復(fù)配制劑。
45％木·速可濕性粉劑配方耐藥綠色木霉孢子、速克靈原藥、硅藻土、可溶性淀粉、黃原膠和SDS和幾丁質(zhì)分別按照40％、5％、46.7％、5％和3.3％的比例混合均勻，并進(jìn)行細(xì)化細(xì)度95％以上可通過(guò)100目篩，制成品外觀松散、流動(dòng)性好。
45％木·速WP品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為有效成分含量≥45％，(孢子數(shù)＞2×108孢子/克，速克靈≥5％)；水分＜5％；細(xì)度(過(guò)100目篩，％)≥95％。
44％木·醚可濕性粉劑配方耐藥綠色木霉孢子、醚菌酯原藥、硅藻土、可溶性淀粉、黃原膠和SDS和幾丁質(zhì)分別按照40％、4％、47.7％、5％和3.3％的比例混合均勻，并進(jìn)行細(xì)化細(xì)度95％以上可通過(guò)100目篩，制成品外觀松散、流動(dòng)性好。
44％木·醚WP品質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)為有效成分含量≥44％，(孢子數(shù)＞2×108孢子/克，醚菌酯≥4％)；水分＜5％；細(xì)度(過(guò)100目篩，％)≥95％。
4、45％木·速WP與44％木·醚WP防治蔬菜灰霉病、黃瓜白粉病的使用效果于室內(nèi)采用瓜條進(jìn)行協(xié)同制劑45％木·速WP防治黃瓜灰霉病試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表3。由試驗(yàn)結(jié)果可知，45％木·速WP、50％綠色木霉WP、50％速克靈WP1000倍液防治效果分別為67.6％、51.5％和62.5％，表明速克靈對(duì)綠色木霉防治黃瓜灰霉病具有增效作用，菌+藥處理較單獨(dú)用菌、藥能進(jìn)一步提高防效。
表3.45％木·速WP協(xié)同防治黃瓜灰霉病藥效試驗(yàn)(室內(nèi))

于室內(nèi)采用葉片漂浮法進(jìn)行進(jìn)行協(xié)同制劑44％木·醚WP防治試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。由試驗(yàn)結(jié)果可知，44％木·醚WP500倍、50％綠色木霉WP50倍、50％醚菌酯干懸浮劑3000倍的防治效果分別為82.7％、74.9％和78.4％，表明醚菌酯對(duì)綠色木霉防治黃瓜白粉病具有增效作用，菌+藥處理較單獨(dú)用菌、藥能進(jìn)一步提高防效。
表4.45％木·醚WP協(xié)同防治黃瓜白粉病藥效試驗(yàn)(室內(nèi))

由田間藥效試驗(yàn)結(jié)果可知(見(jiàn)表5、6)，45％木·速WP和44％木·醚WP對(duì)黃瓜灰霉病、白粉病均有較好的防治效果，3次藥后調(diào)查其防治效果優(yōu)于或與兩對(duì)照藥劑50％速克靈WP和50％醚菌酯干懸浮劑的防效無(wú)顯著差異，同等施用劑量的防治效果明顯優(yōu)于50％綠色木霉WP的防效，因此認(rèn)為45％木·速WP和44％木·醚WP可以在生產(chǎn)上推廣應(yīng)用，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。
建議使用45％木·速WP防治黃瓜灰霉病，施用劑量為500～1500倍液，44％木·醚WP防治黃瓜白粉病，施用劑量為500～1500倍液，于發(fā)病前或發(fā)病初期開(kāi)始應(yīng)用，噴藥時(shí)要使植株莖桿、瓜條、枝葉、葉片正反兩面各部位均勻著藥。
表5.45％木·速WP協(xié)同防治黃瓜灰霉病藥效試驗(yàn)(田間)

表6.44％木·醚WP協(xié)同防治黃瓜白粉病藥效試驗(yàn)(田間)

在田間自然條件下，病菌與寄主植株、果實(shí)接觸，綠色木霉、特異性化學(xué)藥劑與病原菌孢子菌絲的接觸都是隨機(jī)的。某些特異性藥劑與綠色木霉混合使用，特異性化學(xué)藥劑對(duì)植物病原菌有針對(duì)性的抑制作用，較單獨(dú)施用生防菌能更有利于生防菌定殖于植株表面，且對(duì)植物病原菌的控制機(jī)率較單獨(dú)使用綠色木霉作用大。相信在植物病害的防治中，實(shí)現(xiàn)化學(xué)藥劑與綠色木霉菌制劑混合使用，不但可以提高生防制劑的防治效果，且可部分解決綠色木霉在施用過(guò)程中容易出現(xiàn)的遲效性問(wèn)題，提高綠色木霉活菌制劑的防治效果，同時(shí)減少化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量及農(nóng)藥的殘留，并可望取得穩(wěn)定而持久的防治效果，將是當(dāng)前植物病害防治的一條新途徑。
權(quán)利要求
1.一種將綠色木霉耐藥性菌株與殺菌劑的混合施用的方法，包括由綠色木霉耐藥性菌株的誘發(fā)及其篩選，殺菌劑(速克靈、醚菌酯等)與綠色木霉耐藥性菌株的協(xié)同作用，及通過(guò)綠色木霉耐藥性菌株發(fā)酵孢子、殺菌劑相協(xié)同的復(fù)合制劑及其施用技術(shù)，本發(fā)明的特征在于誘發(fā)具生物防治植物病害活性綠色木霉(Trichoderma viride)的耐藥性，生物制劑中加入殺菌劑、孢子保護(hù)劑等的協(xié)同制劑配方和施用技術(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用綠色木霉耐藥性菌株及其與殺菌劑的協(xié)同應(yīng)用的方法。本發(fā)明以綠色木霉耐藥性菌株(Trichoderma viride)進(jìn)行人工發(fā)酵生產(chǎn)綠色木霉耐藥性菌株孢子，將其與特異性殺菌劑相混合利用，提高綠色木霉的生防活性及田間化學(xué)藥劑的施用劑量，主要包括由綠色木霉(Trichoderma viride)耐藥性菌株的誘發(fā)及其篩選，殺菌劑(速克靈、醚菌酯等)與綠色木霉耐藥性菌株的協(xié)同作用，及通過(guò)綠色木霉耐藥性菌株發(fā)酵孢子、殺菌劑相協(xié)同的復(fù)合制劑及其施用技術(shù)，本發(fā)明的特征在于誘發(fā)具防治植物病害活性綠色木霉的耐藥性，生物制劑中加入殺菌劑、孢子保護(hù)劑等的協(xié)同制劑配方和施用技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)可解決生防制劑應(yīng)用中所面臨的問(wèn)題，同時(shí)減少化學(xué)農(nóng)藥的施用劑量，實(shí)現(xiàn)控制植物病害的有益互作，對(duì)提高生防制劑的防治效果，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用劑量及農(nóng)藥殘留有一定的幫助。
文檔編號(hào)A01N43/34GK101061806SQ200710057188
公開(kāi)日2007年10月31日 申請(qǐng)日期2007年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月24日
發(fā)明者王勇, 王萬(wàn)立, 劉春艷, 郝永娟, 楊秀榮, 劉曉琳 申請(qǐng)人:天津市植物保護(hù)研究所