專利名稱：一種具有殺線蟲功能的菌劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的菌劑及其應用，屬微生物農(nóng)藥技術領域。
背景技術：
植物寄生線蟲是一種世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生的植物病害，僅根結(jié)線蟲已知種類達70多種，為害3000多種植物，每年造成的損失巨大。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，每年因線蟲造成損失全球高達1000億美元。在我國，線蟲主要危害煙草、花卉、蔬菜、棉花、大豆、花生、三七、西洋參等主要經(jīng)濟作物，成為發(fā)展這些作物的重要限制因子。據(jù)全國煙草病蟲害防治信息中心不完全統(tǒng)計，僅云南省發(fā)病面積就達2.7萬公傾，直接經(jīng)濟損失1.2億元，間接損失更為嚴重。黑龍江省僅大豆胞囊線蟲每年造成的損失達8億元之多。松材線蟲被稱為無煙森林火災，在江蘇、浙江、廣東、山東、安徽、湖北、上海、臺灣、香港等部份地區(qū)嚴重發(fā)生，有向全國漫延的趨勢。在山東、廣東、海南和云南等蔬菜主產(chǎn)區(qū)，蔬菜根結(jié)線蟲呈上升趨勢。更嚴重的是由于根結(jié)線蟲侵染后，造成作物傷口，致使作物根部病害嚴重發(fā)生。云南的三七根腐就是典型例子?；瘜W殺線蟲劑自上個世紀40年代發(fā)現(xiàn)以來，在線蟲防治中發(fā)揮了重要作用。但是隨著科學技術的進步，發(fā)現(xiàn)許多化學殺線蟲劑均有副作用，造成環(huán)境污染，危害人體健康。相繼有不少被禁用或即將禁用。特別是植物寄生線蟲發(fā)生于作物根部，由于土壤環(huán)境的特殊性，必須大劑量施用才能保證其防效。而大劑量化學農(nóng)藥對地下水污染非常嚴重。因此，研究開發(fā)高效低毒低殘留殺線蟲劑已經(jīng)是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中的重要課題。
經(jīng)文獻檢索，未見與本發(fā)明相同的公開報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過對一株具有產(chǎn)生酶而分解線蟲功能的嗜麥芽窄食單胞菌研究，開發(fā)生物殺線蟲劑。
本發(fā)明篩選到的一株對植物寄生線蟲具有很好殺蟲功能的嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，G6菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登記入冊的編號CGMCC No1522。
本發(fā)明stenotrophomonas maltiphilia G6菌株形態(tài)特征為微彎或直桿狀，典型的細胞長2μm，寬0.5μm。在MBA平板上菌落灰色到綠色，圓形，隆起，濕潤有光澤。G6菌株的殺線蟲機制理為先形成粗蛋白分解線蟲體壁，通過體壁侵入線蟲體內(nèi)，最終將線蟲全部分解。在整個殺線蟲過程中，伴隨著產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶對線蟲的作用。
stenotrophomonas maltophilia G6是發(fā)明人在開展的食線蟲菌物研究中，從大量樣品中分離獲得，發(fā)現(xiàn)其對線蟲具極高的殺蟲活性。將菌株純化并進行多批次殺線蟲活性試驗后，委托云南大學微生物研究所對菌株進行鑒定，確定為嗜麥芽寡食(窄食)單胞菌stenotrophomonas maltophilia G6。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的擴大培養(yǎng)G6菌株，提取殺線蟲有效成分，進行殺線蟲藥效試驗，確定其對線蟲的作用。
G6培養(yǎng)方法(以下為重量百分比)1、試管種培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％瓊脂、余下為水，pH7。將G6菌絲體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
2、液體擴大培養(yǎng)液體培養(yǎng)基配方為1-3％酵母粉、10-20％大豆餅粉、0.5-2％魚粉、1-4葡萄糖、余下為水，pH7。將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
3、提取殺線蟲活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用10mM的tris-HCl緩沖液(PH8.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-HCl緩沖液(PH8.0)中透析4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。將藥液保存于4℃冰箱中待用。
G6殺線蟲活性試驗1、制備試驗用藥劑按前述液體擴大培養(yǎng)方法培養(yǎng)G6菌株，按前述提取殺線蟲活性成份的方法制備試驗用藥劑。
2、制備對照用藥劑對照1前述1制備試驗用藥劑方法制備對照用藥劑，但培養(yǎng)基中不接入G6菌株。
對照2以清水作為對照。
對照3為了證明殺線蟲有效成份是蛋白，將制備的供試藥劑煮沸滅活后作為對照。
2、制備試驗用線蟲(1)制備Panagrellus redivivus線蟲將P.redivivus線蟲接種于燕麥片培養(yǎng)基上，于28℃下培養(yǎng)6天，凍于4℃冰箱備用。將所需線蟲用貝曼漏斗法洗出，置于5ml離心管內(nèi)，加5ml無菌水洗滌，瞬時離心，棄上清，重復5次得到潔凈供試線蟲。用無菌水將線蟲稀釋為含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
(2)制備松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)在100ml三角瓶中放入15g經(jīng)水浸泡2天的玉米粒，加水10ml，高壓滅菌，接入灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。25℃培養(yǎng)5天。待菌絲鋪滿三角瓶后，接種經(jīng)0.25％次氯酸鈉表面消毒的松材線蟲，28℃培養(yǎng)15至20天。用無菌水將線蟲洗下，制成含量為15條/μl的線蟲懸浮液。
3、試驗方法(1)藥效試驗方法取試驗用藥劑200μl于1.5ml離心管中，加入活線蟲150條，離心管平放，置于25℃下，Panagrellus redivivus線蟲分別于12小時、24小時、48小時；松材線蟲分別于24小時、48小時、60小時檢查計算線蟲的死亡率。并在光學顯微鏡下觀察，觀察線蟲體壁變化情況鑒定死亡的方法為在處理離心管中加入1-5滴5％Nacl溶液，2分鐘后觀察，死蟲僵直，活蟲則卷曲或扭動。
分別用3種對照藥劑，每處理重復三次。

4、試驗結(jié)果表1 G6菌株對Panagrellus redivivus作用效果

表2 對松材線蟲作用效果

結(jié)果表明，從G6菌株液體發(fā)酵產(chǎn)物中提取的試驗用藥劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲均具較好的殺蟲效果，線蟲的平均死亡率在95％以上。從處理線蟲的變化來看，經(jīng)歷了從部份體壁溶解(圖2)到蟲體全部溶解的過程(圖3)，說明活性成份主要為分解線蟲的酶類。而將同批提取的試驗用藥劑經(jīng)過煮沸，導致蛋白質(zhì)變性后，其殺線蟲活性非常小，且線蟲體壁不出現(xiàn)溶解現(xiàn)象，這也證明了G6對線蟲的活性成份主要為酶類。
本發(fā)明G6菌株主要作用成份是酶，對線蟲特別是松材線蟲具有顯著的毒殺作用。同時G6菌株在本發(fā)明培養(yǎng)條件下生長極快，具備了很好的應用開發(fā)前景。


圖1顯示處理線蟲12小時被固定情況。
圖2顯示處理線蟲24小時分解情況。
圖3顯示處理線蟲36小時分解情況。
圖4顯示蟲體保持完好的對照線蟲。
具體實施例方式以下是本發(fā)明的實施例，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此。
實施例一將stenotrophomonas maltophilia G6菌體接種到試管瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)基配方為2％酵母浸膏、1.5％蛋白胨、2％葡萄糖、1.8％瓊脂、余下為水，pH為7。將G6菌絲體接種到培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種。
將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中(每瓶裝100ml)，液體培養(yǎng)基配方為2％酵母粉、15％大豆餅粉、1％魚粉、3％葡萄糖、余下為水，pH7。于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm。
將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清。用10mM的tris-hcl(pH8.0)重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋(MW8,000-14400KDa)于20倍的10mMtris-hcl(pH8.0)中透析4次，即得殺線蟲藥液。
實施例二基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為3％酵母粉、10％大豆餅粉、2％魚粉、1％葡萄糖、余下為水。
實施例三基本同實施例一，不同之處是液體培養(yǎng)基配方，其配方為1％酵母粉、20％大豆餅粉、0.5％魚粉、4％葡萄糖、余下為水。
權(quán)利要求
1.一種具有殺線蟲功能的菌劑，由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成份工序后得到，其特征在于該菌劑由如下步驟得到a.生產(chǎn)菌株為嗜麥芽窄食單胞菌(stenotrophomonas maltophilia)G6，該菌株已于2005年10月31日保藏在中國微生物菌種管理委員會普通微生物中心，保藏登記入冊的編號CGMCC No1522；b.試管種培養(yǎng)將G6菌絲體接種到配方為1-3％酵母浸膏、0.5-2％蛋白胨、1-4％葡萄糖、1.8-2％瓊脂、余下為水，pH7的培養(yǎng)基上，30℃下培養(yǎng)2天，獲得試管種；c.液體培養(yǎng)將試管種接種到250ml三角瓶液體培養(yǎng)基中，每瓶裝100ml，于30℃下?lián)u床培養(yǎng)培養(yǎng)時間2天，轉(zhuǎn)速為220rpm；液體培養(yǎng)基配為1-3％酵母粉、10-20％大豆餅粉、0.5-2％魚粉、1-4％葡萄糖、余下為水，pH7；d.提取殺線蟲活性成份將發(fā)酵培養(yǎng)物于8000rpm/min離心20分鐘，取上清液，按1∶0.85的比例加入硫酸銨，于4℃靜置2小時，然后8000rpm/min離心30分鐘，棄上清，用10mM的tris-HCl緩沖液重新溶解，將重新溶解所獲溶液裝入21mm透析袋于20倍的10mMtris-HCl緩沖液中透析4次，每次3小時，即得殺線蟲藥液。
2.權(quán)利要求1所述的菌劑的應用，其特征在于該菌劑對Panagrellus redivivus線蟲和松材線蟲具有毒殺作用，可應用于植物寄生線蟲的生物防治。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種具有殺線蟲功能的菌劑及其應用，屬微生物農(nóng)藥技術領域。本發(fā)明菌劑由生產(chǎn)菌株經(jīng)試管種培養(yǎng)、液體擴大培養(yǎng)及提取殺線蟲活性成分工序后得到，其生產(chǎn)菌株為嗜麥芽窄食單胞菌stenotrophomonas maltophilia G6，G6菌株已保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期2005年10月31日；保藏登記入冊的編號CGMCC No1522。G6菌株的主要作用機理是通過產(chǎn)生酶，分解線蟲體壁，從而對線蟲特別是松材線蟲產(chǎn)生顯著的毒殺作用，可制備為生物殺線劑。本發(fā)明產(chǎn)品對松材線蟲具有毒力高的突出優(yōu)點，具有較好的潛在應用前景。
文檔編號A01P5/00GK1806554SQ20061001068
公開日2006年7月26日 申請日期2006年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2006年2月14日
發(fā)明者張克勤, 劉軍偉, 周薇 申請人:云南大學