專利名稱：：繁殖去除構(gòu)筑體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及繁殖發(fā)育的調(diào)控。具體說來，本發(fā)明涉及被子植物和裸子植物中繁殖組織的基因去除。本發(fā)明提供繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子(Reproductive-preferredpromoter)、調(diào)控元件和細(xì)胞毒素核苷酸序列。本發(fā)明中還包括基因去除的構(gòu)筑體和方法。
背景技術(shù)：
：隨著植物基因工程技術(shù)的發(fā)展，基因修飾作物的生態(tài)學(xué)含義關(guān)系極其重大，尤其當(dāng)不存在固有屏障通過有性繁殖散布轉(zhuǎn)基因時(shí)更是這樣。尤其，在可通過雜交將轉(zhuǎn)基因從轉(zhuǎn)基因植物散布到雜草物種或作物本身以雜草形式存在的情況下已出現(xiàn)問題。Bergelson等人，Nature395:25(1998)。一種解決所述問題的方式是通過完全去除繁殖結(jié)構(gòu)以基因工程設(shè)計(jì)使植物不育。近來，使用去除系統(tǒng)控制植物的繁殖發(fā)育已引起廣泛關(guān)注。已通過基因去除在多種植物中達(dá)成繁殖控制，所述基因去除使繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子與細(xì)胞毒素基因連接以去除繁殖細(xì)胞。舉例來說，己使用一種來自解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquifacien)的胞外核糖核酸酶barmase誘導(dǎo)雄性不育。Paddon等人，J.Bacteriol.171:1185-1187(1989)。歐洲專利第344,029號(hào)描述在絨氈層特異性啟動(dòng)子控制下通過用DNA編碼的baraase轉(zhuǎn)化植物產(chǎn)生雄性不育植物的系統(tǒng)。用所述啟動(dòng)子-基因構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化煙草和油菜植物以防止所述植物產(chǎn)生可育花粉。Mariani等人，Nature347:737-741(1990)。表達(dá)APETALA3(AP3)啟動(dòng)子和白喉毒素A鏈(DTA)基因的融合構(gòu)筑體的轉(zhuǎn)基因擬南芥(Arabidopsisthaliana)植物的花缺乏花瓣和雄蕊，表明轉(zhuǎn)基因表達(dá)已去除花瓣和雄蕊細(xì)胞。在LEAFY啟動(dòng)子控制下表達(dá)DTA基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥不開花。經(jīng)驅(qū)動(dòng)baraase基因的煙草柱頭特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的煙草植物缺乏柱頭分泌區(qū)且為雌性不育。盡管已有效實(shí)施基因去除，但一般用于去除的啟動(dòng)子并不適于組織特異性表達(dá)。因此，漏出基因的表達(dá)可顯著降低并破壞植物的營養(yǎng)生長(zhǎng)。視植物的種類而定，去除可使?fàn)I養(yǎng)生長(zhǎng)降低80%。Strauss,S.H.禾口Meilan，R.TGERCAnnualReport(1998)。就對(duì)林業(yè)經(jīng)濟(jì)有益的基因去除來說，破壞營養(yǎng)組織的量必須最小化至標(biāo)稱水平。盡管多項(xiàng)專利和專利申請(qǐng)公開案中公開使用多種啟動(dòng)子和細(xì)胞毒素基因進(jìn)行基因去除，但極少有公開內(nèi)容解決去除對(duì)植物營養(yǎng)生長(zhǎng)和發(fā)育的影響。己將在花分生組織中強(qiáng)烈表達(dá)而在葉發(fā)育時(shí)微弱表達(dá)的擬南芥LFY啟動(dòng)子用于制造己去除花的植物。Nilsson等人，PlantJ.15:799-804(1998)。然而，經(jīng)LFY轉(zhuǎn)化的極少數(shù)植物己去除花而未危及營養(yǎng)發(fā)育。由于制造許多轉(zhuǎn)基因樹、使其生長(zhǎng)并進(jìn)行測(cè)試以鑒別具有不育性和正常營養(yǎng)生長(zhǎng)的少數(shù)樹將耗費(fèi)數(shù)年時(shí)間，所以對(duì)樹種使用類似繁殖去除方法將是不切實(shí)際的?；蛉コ敝称鞴傩枰獑?dòng)子活性與去除基因毒性之間的微妙平衡。盡管barnase基因廣泛用于植物的去除，但barnase誘導(dǎo)的毒性常常會(huì)對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育造成有害影響。因此，可能需要降低barnase的毒性，從而在對(duì)植物營養(yǎng)生長(zhǎng)不造成有害和不可恢復(fù)的損害的情況下發(fā)生繁殖去除。制造具有降低的毒性的突變體bamase的同時(shí)，也可能需要使植物營養(yǎng)組織中繁殖去除構(gòu)筑體的漏出表達(dá)減至最少。通過使植物中繁殖去除構(gòu)筑體的漏出或異常表達(dá)減至最少，所述植物歸因于減弱的去除而可能較好地耐受營養(yǎng)組織中突變體barnase基因的表達(dá)，此視barnase突變體中啟動(dòng)子活性和RNA酶活性而定。因此，需要在植物營養(yǎng)組織中具有降低的barnase誘導(dǎo)毒性和最小漏出表達(dá)的繁殖去除系統(tǒng)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種選自由SEQIDNO:1-8和13-17組成的群組的經(jīng)分離聚核苷酸，以及包含SEQIDNO:18-27中任一者中所述的序列的質(zhì)粒。本發(fā)明還提供一種質(zhì)粒，其包含圖1(即，SEQIDNO:18)、圖2(即，SEQIDNO:19)、圖3(即，SEQIDNO:20)、圖4(即，SEQIDNO:21)、圖5(即，SEQIDNO:22)、圖6(即，SEQIDNO:23)、圖7(即，SEQIDNO:24)、圖8(即，SEQIDNO:25)、圖9(即，SEQIDNO:26)或圖19(即，SEQIDNO:27)中任一者中所述的序列。還提供一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其使得植物細(xì)胞中的繁殖優(yōu)選基因能夠表達(dá)，其中所述聚核苷酸包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一實(shí)施例中，所述聚核苷酸使植物細(xì)胞中雄性優(yōu)選的基因能夠表達(dá)。還提供一種啟動(dòng)子，其包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一實(shí)施例中，SEQIDNO:1-8的聚核苷酸在成熟前雄性(pre-male)繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)或具活性。還提供一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其與SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。在另一實(shí)施例中，提供一種聚核苷酸，其具有選自由以下序列組成的群組的序列(i)與SEQIDNO:1-8禾卩16-17中任一者的聚核苷酸互補(bǔ)的序列；(ii)作為SEQIDNO:1-8禾n16-17中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作為SEQIDNO:1-8禾口16-17中任一者的聚核苷酸的反向補(bǔ)體的序列。還提供一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其與根據(jù)權(quán)利要求1所述的聚核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，其中所述經(jīng)分離的聚核苷酸在其全長(zhǎng)序列范圍內(nèi)與SEQIDNO:1-26中任一者的聚核苷酸雜交。還提供一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其包含SEQIDNO:17中所述的序列。在一實(shí)施例中，提供一種具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能夠?qū)崿F(xiàn)(i)與核酸分子結(jié)合或(ii)調(diào)控雙子葉植物中可操作地連接的基因的表達(dá)的至少一者。在另一實(shí)施例中，提供一種具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能夠?qū)崿F(xiàn)(i)與核酸分子結(jié)合或(ii)調(diào)控裸子植物中可操作地連接的基因的表達(dá)的至少一者。在一實(shí)施例中，提供一種具有SEQIDNO:1-4和16中任一者的序列的聚核苷酸，其能夠上調(diào)或下調(diào)植物中可操作地連接的基因的表達(dá)。在本發(fā)明的一方面中，提供一種構(gòu)筑體，其包含可操作地連接到所需核酸的選自SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的經(jīng)分離聚核苷酸和其功能性變異體，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控經(jīng)所述構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中所述所需核酸的表達(dá)。在一實(shí)施例中，聚核苷酸上調(diào)或下調(diào)所述所需核酸的表達(dá)。在另一實(shí)施例中，所需核酸編碼能夠破壞植物繁殖發(fā)育的表達(dá)產(chǎn)物。本發(fā)明提供一種經(jīng)本文所公開的任何構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物。在一實(shí)施例中，所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型表達(dá)與未經(jīng)所述構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的相同種類植物相比的繁殖發(fā)育差異。在一實(shí)施例中，繁殖發(fā)育差異出現(xiàn)在雄性繁殖結(jié)構(gòu)中。在另一實(shí)施例中，繁殖發(fā)育差異出現(xiàn)在花藥、花絲、絨氈層、花粉、小孢子葉或雄球花中的任一者中。在替代性實(shí)施例中，繁殖發(fā)育差異出現(xiàn)在雌性繁殖結(jié)構(gòu)中。在這一情況下，在一實(shí)施例中，繁殖發(fā)育的差異出現(xiàn)在柱頭、花柱、子房、大孢子、胚珠中的任一者中。在又一實(shí)施例中，繁殖發(fā)育差異出現(xiàn)在成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中。-方面，所需核酸可產(chǎn)生RNA轉(zhuǎn)錄本，在一實(shí)施例中，其可包含植物細(xì)胞內(nèi)源基因的反義序列。在一實(shí)施例中，RNA轉(zhuǎn)錄本誘導(dǎo)在植物細(xì)胞中正常表達(dá)的基因的RNA干預(yù)。還提供一種包含構(gòu)筑體的植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性變異體；和(ii)所需核酸；其中所述聚核苷酸可操作地連接到所述所需核酸。還提供一種包含所述植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因植物。一方面，本發(fā)明提供一種用于制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含(a)用構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)至少一種具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性變異體，和(ii)所需核酸，其中所述聚核苷酸調(diào)控所述所需序列的活性；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物。在一實(shí)施例中，與不含有構(gòu)筑體的相同種類植物相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型的特征在于繁殖發(fā)育的差異。在另一實(shí)施例中，與不含有構(gòu)筑體的相同種類植物相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型的特征在于雄性繁殖發(fā)育的差異。或者，與不含有構(gòu)筑體的相同種類植物相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型的特征在于雌性繁殖發(fā)育的差異。在另一實(shí)施例中，與不含有構(gòu)筑體的相同種類植物相比，經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型的特征在于成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)的差異。另一方面，提供一種賦予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，和(ii)編碼能夠去除繁殖發(fā)育的基因的核酸，其中所述核酸相對(duì)于所述啟動(dòng)子有義，且其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述基因的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇繁殖不育的植物。另一方面為一種去除植物中的繁殖結(jié)構(gòu)的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，和(ii)編碼能夠去除繁殖發(fā)育的基因的核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述基因的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇具有已去除的繁殖結(jié)構(gòu)的植物。在一實(shí)施例中，所述植物是選自被子植物或裸子植物種類。還提供一種變化花粉育性的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入木本植物的植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，和(ii)和所需核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述所需核酸的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(c)獲得具有變化的花粉育性的植物。在一實(shí)施例中，木本植物是選自桉樹屬或松屬。本文還提供一種選自SEQIDNO:5-8中任一者的經(jīng)分離聚核苷酸和其變異體。在一實(shí)施例中，這些聚核苷酸中的任一者編碼突變體barnase酶。在一實(shí)施例中，所述聚核苷酸編碼相比野生型barnase酶具有減弱的活性的突變體barnase酶。在一實(shí)施例中，變異體與SEQIDNO:5-8中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。還提供一種經(jīng)分離的聚核苷酸，其具有選自以下序列的序列(i)與SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸互補(bǔ)的序列；(ii)作為SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸的反向序列的序列；和(iii)作為SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸的反向補(bǔ)體的序列。在另一實(shí)施例中，經(jīng)分離的聚核苷酸與SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，其中所述經(jīng)分離的聚核苷酸在其全長(zhǎng)序列范圍內(nèi)與SEQIDNO:5-8中任一者的聚核苷酸雜交。另一方面，提供一種賦予植物繁殖不育性而不干擾營養(yǎng)生長(zhǎng)的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有繁殖優(yōu)選活性的啟動(dòng)子，(ii)編碼能夠去除繁殖發(fā)育的基因的核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述基因的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇具有繁殖不育性和未受干擾的營養(yǎng)生長(zhǎng)的植物。還提供一種去除植物的繁殖發(fā)育而不干擾營養(yǎng)生長(zhǎng)的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDN0:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，(ii)編碼能夠去除繁殖發(fā)育的基因的核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述基因的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇具有己去除的繁殖發(fā)育和未受干擾的營養(yǎng)生長(zhǎng)的植物。還提供一種賦予植物雄性不育性而不干擾營養(yǎng)生長(zhǎng)的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有繁殖優(yōu)選表達(dá)的啟動(dòng)子，(ii)編碼突變體barnase的核酸，其中所述突變體barnase與野生型barnase相比具有減弱的活性；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的繁殖表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇具有雄性不育性和未受干擾的營養(yǎng)生長(zhǎng)的植物。在一實(shí)施例中，啟動(dòng)子具有選自由SEQIDNO:1、2、3、4和16組成的群組的序列。在另一實(shí)施例中，啟動(dòng)子為選自由SEQIDNO:1、2、3、4和16組成的群組的序列中任一者的功能性變異體。在一實(shí)施例中，上述(ii)中的核酸具有SEQIDNO:5-8中任一者的序列。在一實(shí)施例中，本發(fā)明還提供一種具有已去除的繁殖發(fā)育和未受影響的營養(yǎng)生長(zhǎng)的植物。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明還提供一種具有己去除的繁殖發(fā)育和正常營養(yǎng)生長(zhǎng)的木本植物。另一方面，提供一種獲得木材的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入木本植物的植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:l、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，和(ii)和所需核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述所需核酸的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(c)從所述植物獲得木材。另一方面為一種獲得木漿的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入木本植物的植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列或其功能性變異體的啟動(dòng)子，和(ii)和所需核酸，其中所述啟動(dòng)子調(diào)控所述所需核酸的表達(dá)；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(c)從所述植物獲得木漿。還提供一種去除植物中的繁殖結(jié)構(gòu)的方法，其包含(a)將選自由SEQIDNO:13-15組成的群組的質(zhì)粒引入植物細(xì)胞中；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述質(zhì)粒的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；和(c)選擇具有已去除的繁殖結(jié)構(gòu)的植物。在另一實(shí)施例中，可將選自由SEQIDNO:18-26組成的群組的質(zhì)粒引入上述步驟(a)中的植物細(xì)胞中。還提供一種賦予植物繁殖不育性的方法，其包含(a)將選自由SEQIDNO:13-15組成的群組的質(zhì)粒引入植物細(xì)胞中；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述質(zhì)粒的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物；禾Q(c)選擇具有已去除的繁殖結(jié)構(gòu)的植物。在另一實(shí)施例中，可將選自由SEQIDNO:18-26組成的群組的質(zhì)粒引入上述步驟(a)中的植物細(xì)胞中。在另一實(shí)施例中，提供一種經(jīng)本文所公開的任何質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的植物。在一實(shí)施例中，己穩(wěn)定引入植物中的質(zhì)粒具有SEQIDNO:13-15或18-26中任一者的序列。本發(fā)明還提供一種賦予轉(zhuǎn)基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體具有繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子和非繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子，所述繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可操作地連接到細(xì)胞毒素基因，所述非繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可操作地連接到編碼抑制所述細(xì)胞毒素基因的蛋白質(zhì)的基因；其中所述繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子在被子植物或裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)中具活性，且所述非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子在被子植物或裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)中不具活性；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞；和(c)選擇具有已去除的繁殖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物。在一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子是選自由SEQIDNO:1、2、3、4或16組成的群組。在另一實(shí)施例中，非繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子是選自由SEQIDNO:3和SEQIDNO:17組成的群組。還提供一種多肽，其包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的氨基酸序列或其變異體。在一實(shí)施例中，所述多肽變異體與SEQIDNO:9-12中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、％%、95%、94%、93%、92%、91%、卯％、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。本發(fā)明還涵蓋一種包含啟動(dòng)子的構(gòu)筑體，所述啟動(dòng)子包含可操作地連接到包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列的聚核苷酸的SEQIDNO:1或2中任一者的序列。在一實(shí)施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:5中所述的序列。在一實(shí)施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:6中所述的序列。在另一實(shí)施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:7中所述的序列。在另一實(shí)施例中，聚核苷酸包含SEQIDNO:8中所述的序列。還提供一種經(jīng)這一構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物。還提供一種包含啟動(dòng)子的構(gòu)筑體，所述啟動(dòng)子包含可操作地連接到編碼多肽的聚核苷酸的SEQIDNO:1或2中任一者的序列，所述多肽包含SEQIDNO:9-12中任一者中所述的氨基酸序列。還提供一種經(jīng)這一構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物。在一實(shí)施例中，這些構(gòu)筑體中的一者也可包含可操作地連接到barstar基因的非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子。本文所公開的非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可包含SEQIDNO:3或SEQIDNO:17中所述的序列。還提供一種誘導(dǎo)松屬中球花形成的方法，其包含(a)從剛松松屬(Rrigida)北美油松(pitchpine)與火炬松松屬(P.taeda)火炬松(loblollypine)雜交獲得雜交后代植物；(b)用所需可操作地連接到繁殖組織優(yōu)選的啟動(dòng)子的聚核苷酸轉(zhuǎn)化雜交植物；(c)由經(jīng)轉(zhuǎn)化的雜交植物再生轉(zhuǎn)基因雜交植物；和(d)回收球花。在一實(shí)施例中，繁殖組織優(yōu)選的啟動(dòng)子包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在另一實(shí)施例中，雜交植物是通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium)或基因槍(biolistics)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在一實(shí)施例中，球花為雄性或雌性。在另一實(shí)施例中，球花是由轉(zhuǎn)基因雜交植物在1至3年的轉(zhuǎn)化期內(nèi)產(chǎn)生。另一方面，提供一種測(cè)試裸子植物繁殖組織中候選啟動(dòng)子的活性的方法，其包含(a)獲得候選啟動(dòng)子序列；(b)使所述候選啟動(dòng)子可操作地連接到報(bào)告基因；(c)將所述可操作地連接到報(bào)告基因的候選啟動(dòng)子引入植物材料中；和(d)鑒別植物材料中報(bào)告基因的表達(dá)。在本方法中，報(bào)告基因?yàn)镚US。在一實(shí)施例中，植物材料為植物外植體或植物細(xì)胞。在另一實(shí)施例中，報(bào)告基因的表達(dá)己經(jīng)鑒別的植物材料是選自由花瓣、雄蕊、心皮、莖尖、花藥、絨氈層、胼胝體和胚組成的群組。本發(fā)明還提供一種雜交后代植物，其包含可操作地連接到所需聚核苷酸的繁殖組織優(yōu)選啟動(dòng)子，其中所述雜交后代植物是由剛松松屬北美油松與火炬松松屬火炬松雜交獲得。在一實(shí)施例中，繁殖組織優(yōu)選的啟動(dòng)子包含SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者所述的序列。在一實(shí)施例中，所需聚核苷酸包含SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列。在另一實(shí)施例中，所需聚核苷酸編碼包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的氨基酸序列的多肽。還提供一種經(jīng)包含SEQIDNO:13-15中任一者的序列的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的雜交后代植物，其中所述雜交后代植物是由剛松松屬北美油松與火炬松松屬火炬松雜交獲得。本發(fā)明還提供一種測(cè)試假定的開花控制構(gòu)筑體延遲裸子植物繁殖的活性的方法，其包含(i)用可操作地連接到所需聚核苷酸的啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化剛松松屬與火炬松松屬雜交體的體細(xì)胞胚培養(yǎng)物(somaticembryogenicculture);(ii)從經(jīng)轉(zhuǎn)化的培養(yǎng)物中選擇轉(zhuǎn)基因細(xì)胞；(iii)培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因細(xì)胞以獲得至少一種體細(xì)胞胚；(iv)使所述胚發(fā)芽以獲得轉(zhuǎn)基因植物；(v)使植物生長(zhǎng)；和(vi)檢查植物球花的形成。在一實(shí)施例中，啟動(dòng)子為選擇用于測(cè)試植物繁殖組織中啟動(dòng)子活性的聚核苷酸。在另一實(shí)施例中，所述培養(yǎng)是通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化或基因槍轉(zhuǎn)化進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在另一實(shí)施例中，所需聚核苷酸為報(bào)告基因或去除構(gòu)筑體。就這一點(diǎn)來說，在一實(shí)施例中，去除構(gòu)筑體具有SEQIDNO:13-15中任一者所述的核酸序列。在另一實(shí)施例中，構(gòu)筑體可包含SEQIDNO:18-26中任一者所述的序列。在一實(shí)施例中，上述步驟(v)的植物生長(zhǎng)1至3年。一般說來，可操作地連接到啟動(dòng)子或并入本文所公開的質(zhì)粒或構(gòu)筑體中的本發(fā)明的所需核酸或所需聚核苷酸可包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。在一實(shí)施例中，所需核酸或所需聚核苷酸為己突變的barnase基因序列。在優(yōu)選實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可操作地連接到促進(jìn)被子植物和裸子植物中繁殖組織基因去除的聚核苷酸。在優(yōu)選實(shí)施例中，聚核苷酸為突變體barnase基因。在一實(shí)施例中，啟動(dòng)子包含SEQIDNO:1-4或16中任一者所述的序列。在另一實(shí)施例中，barnase基因具有SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列，或編碼包含SEQIDNO:9-12中任一者所述的序列的多肽。任何構(gòu)筑體都可包含所述啟動(dòng)子-所需聚核苷酸表達(dá)盒。圖1-pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](SEQIDNO.18)。圖2-pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(內(nèi)含子)](SEQIDNO.19)。圖3-pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.20)。圖4—pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.21)。圖5-pARB599B[PrMC2::bamaseH102E](SEQIDNO.22)。已公開的短核苷酸序列按出現(xiàn)的次序分別為SEQIDNO:22的殘基10431-10442、10261-10271、9885-9896和9569-9581。圖6-pARB639B[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](SEQIDNO.23)。圖7-pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](SEQIDNO.24)。圖8-pABDPO10[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互補(bǔ)拷貝](SEQIDNO.25)。圖9-pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互補(bǔ)拷貝](SEQIDNO.26)。圖10-pWVR220的質(zhì)粒圖譜。圖11-pWVCZ20的質(zhì)粒圖譜。圖12-pWVCZ23的質(zhì)粒圖譜。圖13-pWVCZ24的質(zhì)粒圖譜。圖14-pARB599B的質(zhì)粒圖譜。圖15-pARB639B的質(zhì)粒圖譜。圖16-pAGF243的質(zhì)粒圖譜。圖17-pABDPO10的質(zhì)粒圖譜。圖18-pABDP04的質(zhì)粒圖譜。圖19-pARB1005L[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G]。具體實(shí)施例方式本發(fā)明涉及一種經(jīng)分離的核酸分子，其包含與選自由下文所述的聚核苷酸序列(即，SEQIDNO:1-26以及圖1至9中所述的那些序列和其部分)中的任一者組成的群組的序列具有至少95%序列同一性的聚核苷酸。本發(fā)明還提供本文所公開的聚核苷酸序列的功能性片段。本發(fā)明另外提供與本文所揭示的任何聚核苷酸序列互補(bǔ)的核酸或其片段；以及包含至少15個(gè)相鄰堿基的核酸，其與本文所公開的任何聚核苷酸序列雜交。本發(fā)明還涉及一種經(jīng)分離的聚核苷酸序列，其包含具有選自本文所述序列(諸如SEQIDN09至12中所述的那些序列)的序列的多肽。本發(fā)明使用所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的術(shù)語和短語。除非另作定義，否則本文所使用的所有科技術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員通常了解的含義相同的含義。一般說來，本文所使用的命名法和本文所述的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)和核酸化學(xué)反應(yīng)與雜交反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室程序?yàn)楸娝苤痛隧?xiàng)技術(shù)中常用者。重組核酸方法、聚核苷酸合成、微生物培養(yǎng)、細(xì)胞培養(yǎng)、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)、分析化學(xué)、有機(jī)合成化學(xué)、化學(xué)合成、化學(xué)分析和醫(yī)藥調(diào)配和傳遞中都使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般說來，酶反應(yīng)和純化和/或分離步驟是根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行。技術(shù)和程序一般是根據(jù)常規(guī)方法進(jìn)行。例如參看Sambrook&Russel,MolecularCloning:ALaboratoryManual,第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,2001。農(nóng)桿菌如所屬領(lǐng)域眾所周知，用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的農(nóng)桿菌為通常含有載體的根癌農(nóng)豐干菌(Agrobacteriumtumefacien)或發(fā)木艮農(nóng)桿菌(Agrobacteriumrhizogene)的隹卩甲(disarmed)和劇毒衍生物。載體通常含有位于T-DNA邊界之間的所需聚核苷酸。被子植物子房中封閉有種子的維管植物。被子植物是能夠開花結(jié)果的種子植物。被子植物可細(xì)分成雙子葉植物和單子葉植物。被子植物繁殖結(jié)構(gòu)包括包含花的雄性和雌性組織。通常，被子植物的花具有四種不同的花器官萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群(androcecium))和雌蘊(yùn)(雌蕊群)。被子植物繁殖結(jié)構(gòu)也包含成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)包含在雄性組織和雌性組織發(fā)育和分化前形成的細(xì)胞和組織。所需聚核苷酸本發(fā)明的所需聚核苷酸為基因元件，諸如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子或終止子；或基因組中包含所需聚核苷酸的經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞中待轉(zhuǎn)錄和/或待翻譯的基因或聚核苷酸。如果所需聚核苷酸包含編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物的序列，那么可使編碼區(qū)可操作地連接到引起相關(guān)信使RNA轉(zhuǎn)錄本和/或由所需聚核苷酸編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物表達(dá)的調(diào)控元件，諸如啟動(dòng)子和終止子。因此，"所需聚核苷酸"可包含以5'-至3'-方向可操作地連接的基因、啟動(dòng)子、編碼蛋白質(zhì)的基因和終止子。另外，所需聚核苷酸可包含"反義(antisense)"方向的基因或其片段，所述基因或其片段的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生可形成影響植物細(xì)胞中內(nèi)源基因表達(dá)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的核酸。轉(zhuǎn)錄后所需聚核苷酸還可得到起始與所需聚核苷酸有關(guān)的基因的RNA干預(yù)的雙鏈RNA產(chǎn)物。本發(fā)明的所需聚核苷酸可定位于T-DNA內(nèi)，從而使左側(cè)與右側(cè)的T-DNA邊界序列側(cè)面相接，或位于所需聚核苷酸的任一側(cè)上。本發(fā)明預(yù)期將一種或一種以上所需聚核苷酸穩(wěn)定整合到至少一種植物細(xì)胞的基因組中。所需聚核苷酸可經(jīng)突變或可為其野生型序列的變異體。應(yīng)了解，可將所有或部分所需聚核苷酸整合到植物基因組中。還應(yīng)了解，術(shù)語"所需聚核苷酸"涵蓋一種或一種以上所述聚核苷酸。因此，本發(fā)明的T-DNA可包含一種、兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種、九種、十種或十種以上所需聚核苷酸。雙子葉植物(dicot):胚中具有兩半種子或子葉、分枝葉脈和四朵或五朵的花部分的有花植物。雙子葉植物的實(shí)例包括(但不限于)桉樹、楊樹、楓香屬、金合歡、柚木、桃花心木、棉、煙草、擬南芥、番茄、馬鈴薯、甜菜、椰菜、木薯、甘薯、胡椒、猩猩木、菜豆、紫花苜蓿、大豆、胡蘿卜、草莓、萵苣、櫟樹、槭樹、胡桃、薔薇、薄荷、南瓜、雛菊、老獾草、鱷梨、仙人掌和馬蹄金屬。內(nèi)源是指植物基因組的天然基因。雌性繁殖組織包括(例如)柱頭、花柱、子房、大孢子、雌球花(胚珠)、雌配子、雌合子、大孢子母細(xì)胞和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。雌性不育性基因是指編碼破壞雌配子體、雌配子、雌合子、種子、胚珠或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)的生長(zhǎng)和發(fā)育的RNA、蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子。表達(dá)雌性不育性基因的植物產(chǎn)生不具生育力的種子。存在許多可導(dǎo)致雌性不育性的不同突變，涉及雌性繁殖器官或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)的特定組織發(fā)育的所有階段。雌性不育性基因的實(shí)例包括(但不以任何方式限制)編碼催化植物激素合成的酶，諸如異戊烯基轉(zhuǎn)化酶，其為一種催化細(xì)胞分裂素生物合成的第一步驟且由農(nóng)桿菌T-DNA的基因4編碼的酶；或一種或兩種涉及生長(zhǎng)素合成且由農(nóng)桿菌T-DNA的基因1和基因2編碼的酶。雌性不育性基因的其他實(shí)例編碼葡聚糖酶；脂酶，諸如磷脂酶A2(Verheij等人，Rev.Blochem.Pharmacol.91:92-203(1981));脂質(zhì)過氧化物酶；或植物細(xì)胞壁抑制劑。雌性不育性基因的其它實(shí)例編碼對(duì)植物細(xì)胞有毒的蛋白質(zhì)，諸如細(xì)菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒桿菌毒素的A片段)。雌性不育性基因的另一實(shí)例為反義核酸，或RNA干預(yù)(RNAi)中涉及的RNA(諸如小干預(yù)RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)。舉例來說，本發(fā)明的反義或RNAi分子編碼與植物繁殖細(xì)胞中在內(nèi)源啟動(dòng)子控制下天然轉(zhuǎn)錄的鏈互補(bǔ)的核酸鏈，舉例來說，所述內(nèi)源啟動(dòng)子如歐洲專利公開案0,223,399中所述。所述反義核酸或RNAi分子能夠與繁殖細(xì)胞中天然產(chǎn)生的RNA的編碼和/或非編碼部分結(jié)合，從而抑制天然產(chǎn)生的RNA的翻譯。在一實(shí)施例中，可在植物的花、胚珠、種子、胚、雌配子、雌配子體、大孢子母細(xì)胞和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中于植物的互補(bǔ)內(nèi)源DNA鏈(或基因)的內(nèi)源啟動(dòng)子控制下表達(dá)本發(fā)明的反義核酸和RNAi分子。所述反義核酸的實(shí)例為以下基因的反義DNA序列STMG型基因，諸如STMG07、STMG08、STMG4B12和STMG3C9基因。Jofuku和Goldberg.ThePlantCell1:1079-1093(1989)。使用RNAi抑制基因表達(dá)一般描述于Paddison等人，Genes&Dev.16:948-958(2002)中，且使用RNAi抑制植物基因的表達(dá)特別描述于WO99/61631中，兩篇專利文獻(xiàn)都以引用的方式并入本文。雌性不育性基因的另一實(shí)例編碼特定RNA酶(即，"核糖酶")，其能夠高度特異性裂解給定目標(biāo)序列，如Haseloff和Gerlach等人.Nature334,585-591(1998)所述。纖維組成如本文所使用，纖維組成是指可經(jīng)修飾以改變纖維的結(jié)構(gòu)、外觀或用途的特質(zhì)。確定纖維組成的特質(zhì)包括(但不限于)纖維長(zhǎng)度、粗糙度、強(qiáng)度、顏色、橫截面、寬度和纖維密度。舉例來說，已知纖維長(zhǎng)度給予強(qiáng)度，而纖維粗糙度確定結(jié)構(gòu)和彈性。在被子植物中，花分生組織起始具有四種不同類型花器官的花結(jié)構(gòu)萼片(花萼)、花瓣(花冠)、雄蕊(雄蕊群)和雌蕊(雌蕊群)。每一花器官都是以輪生體起始，包含圍繞花分生組織側(cè)翼的同心環(huán)?；ńY(jié)構(gòu)是由花柄或花梗支撐。有花植物產(chǎn)生為小孢子(雄性)或大孢子(雌性)的減數(shù)孢子。外來就核酸來說，"外來"的意思是所述核酸是得自非植物有機(jī)體，或得自與待轉(zhuǎn)化的植物種類不同的植物，或得自與待轉(zhuǎn)化的植物混種繁殖的植物，或不屬于目標(biāo)植物種類。根據(jù)本發(fā)明，外來DNA或RNA可包括天然存在于真菌、細(xì)菌、病毒、哺乳動(dòng)物、魚或鳥類的基因組成中但并非天然存在于待轉(zhuǎn)化的植物中的核酸。因此，外來核酸為編碼(例如)不是由經(jīng)轉(zhuǎn)化植物天然產(chǎn)生的多肽的核酸。外來核酸無需編碼蛋白質(zhì)產(chǎn)物。基因基因?yàn)楹泻铣僧a(chǎn)物、多肽鏈或RNA分子所需的所有信息且包括編碼與非編碼序列的DNA分子的區(qū)段?；蛟?基因元件"為任何不連續(xù)的核苷酸序列，包括(但不限于)啟動(dòng)子、基因、終止子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、間隔子、5'-未翻譯區(qū)、3'-未翻譯區(qū)或重組酶識(shí)別位點(diǎn)?；蛐揎椡ㄟ^應(yīng)用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)方法將DNA穩(wěn)定引入某些有機(jī)體的基因組中。裸子植物如本文所使用，其是指具有種子而無子房的種子植物。裸子植物的實(shí)例包括松類、蘇鐵類、銀杏屬和麻黃屬。在裸子植物中，繁殖芽原體(reproductiveshootprimordia)發(fā)育成雄球花(malecone/staminatecone)或雌球花(femalecone/ovulatecone)。裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)包括包含雄性花粉球(雄球花)的雄性組織和包含雌球花(femalecone/ovulatecone)的雌性組織。裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)還包含成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)包含在雄性組織和雌性組織發(fā)育和分化前形成的細(xì)胞和組織。引入如本文所使用，其是指通過包括感染、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法將核酸序列插入細(xì)胞中。木質(zhì)素如本文所使用，其是指由類苯丙醇(phenylpr叩anoid)單元構(gòu)成的聚合組合物，包括單木質(zhì)醇松柏醇、香豆醇和芥子醇的聚合衍生物。木質(zhì)素的品質(zhì)是指木質(zhì)素組合物給予細(xì)胞壁基質(zhì)強(qiáng)度、輔助水運(yùn)輸和/或阻止細(xì)胞壁多醣降解的能力?？赏ㄟ^變化每一單木質(zhì)醇(monolignol)的相對(duì)量或變化木質(zhì)素類型來改變木質(zhì)素組成或木質(zhì)素結(jié)構(gòu)。舉例來說，愈創(chuàng)木基木質(zhì)素(衍生自阿魏酸)在軟木種類中占優(yōu)勢(shì)，而愈創(chuàng)木基-紫丁香基木質(zhì)素(衍生自阿魏酸和芥子酸)為硬木種類的特性。與移除硬木中的木質(zhì)素相比，降解軟木(諸如松樹)中的木質(zhì)素實(shí)質(zhì)上需要較多的堿和較長(zhǎng)的培育時(shí)間?？赏ㄟ^上調(diào)或下調(diào)木質(zhì)素生物合成中所涉及的酶來調(diào)控木質(zhì)素組成。舉例來說，木質(zhì)素生物合成的關(guān)鍵酶包括(但不限于)4-香豆酸:輔酶A連接酶(4CL)、苯丙烯醇脫氫酶(CinnamylAlcoholdehydrogenase,CAD)禾口芥子醇脫氫酶(SinapylAlcoholDehydrogenase,SAD)。在被子植物中，雄性配子體或花粉粒在花藥中發(fā)育，且由雄蕊產(chǎn)生花藥?；ㄋ幍陌l(fā)育出現(xiàn)于兩個(gè)與花粉發(fā)育相關(guān)的階段。第I階段，花藥中的造孢細(xì)胞經(jīng)歷小孢子發(fā)生；非造孢細(xì)胞形成表皮和絨氈層。絨氈層為包圍造孢細(xì)胞并向花粉發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)的組織。此外，絨氈層分泌酶過氧化氫酶。第II階段，花藥擴(kuò)大且花絲伸長(zhǎng)。此時(shí)，花粉粒形成，出現(xiàn)開裂，并釋放出花粉粒。在裸子植物(諸如松類)中，雄性花粉球是由具有一連串鱗苞的莖軸和每一鱗苞下表面上的兩個(gè)花粉囊組成。雄球花是由在能育枝莖軸(fertileshootaxis)上以螺旋排列緊密叢集的大量小孢子葉組成。每一小孢子葉在其底部、離莖側(cè)都具有兩個(gè)小孢子囊，也稱為花粉囊。每一小孢子囊內(nèi)都存在造孢組織。造孢組織是由大量經(jīng)歷減數(shù)分裂的二倍體細(xì)胞(稱為小孢子母細(xì)胞)組成。每一小孢子囊的周圍都存在絨氈層。在小孢子囊內(nèi)，小孢子都經(jīng)歷有絲分裂，且在兩次有絲分裂后，產(chǎn)生四室雄性配子體?；ǚ哿０℃咦颖诤退男坌耘渥芋w。在裸子植物中，雌球花是由大量經(jīng)高度修飾的能育枝融合形成。舉例來說，在松樹中，雌球花包含連接到單一、中央莖軸的個(gè)體單元。個(gè)體單元是由珠鱗(ovuliferousscale)(具有胚珠)和幾乎完全融合至珠鱗的苞片(subtendingbract)組成。每一珠鱗都是由大孢子葉與其它能育枝組件融合形成。在頂部，每一珠鱗的離莖表面都具有兩個(gè)胚珠。胚珠以其珠孔朝向中央錐形莖軸(coneaxis)定向且部分埋入珠鱗組織中。每一胚珠都具有完全包圍除珠孔外的大孢子囊的珠被(一種多細(xì)胞層)。珠被或珠心起到營養(yǎng)組織的作用，且每一珠心都具有單一大孢子母細(xì)胞。大孢子母細(xì)胞為經(jīng)歷減數(shù)分裂的二倍體細(xì)胞。珠孔室是位于每一胚珠內(nèi)珠心與珠孔之間。雄性繁殖組織包括(例如)花粉粒、絨氈層、花藥、花絲、花粉母細(xì)胞、小孢子、小孢子母細(xì)胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前繁殖結(jié)構(gòu)。雄性不育性基因是指編碼干擾表達(dá)雄性不育性基因的任何繁殖細(xì)胞中適當(dāng)代謝、功能和/或發(fā)育且由此導(dǎo)致任何所述繁殖細(xì)胞死亡和/或破壞的RNA、蛋白質(zhì)或多肽的核酸分子。存在許多可導(dǎo)致雄性不育性的不同突變，涉及雄性繁殖器官或成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)特定組織發(fā)育的所有階段。舉例來說，雄性不育性基因的表達(dá)使植物無法產(chǎn)生可育花粉。經(jīng)轉(zhuǎn)化植物中雄性不育性基因的表達(dá)可導(dǎo)致植物產(chǎn)生花粉，但花粉可能對(duì)于傳粉來說為異常且無功能的。舉例來說，非功能性花粉可能無法使花粉管發(fā)芽。并非出于限制，雄性不育性基因的實(shí)例編碼RNA酶，諸如RNA酶T1(其通過水解任何鳥嘌呤殘基后的鍵降解RNA分子)和Barnase;DNA酶，諸如核酸內(nèi)切酶(例如，EcoRI);或蛋白酶，諸如木瓜蛋白酶(例如，木瓜蛋白酶酶原和木瓜蛋白酶活性蛋白)。其它雄性不育性基因編碼催化植物激素合成的酶。舉例來說，可使用異戊烯基轉(zhuǎn)移酶(一種催化細(xì)胞分裂素生物合成的第一步驟的酶)，且生長(zhǎng)素合成所涉及的酶可用于誘導(dǎo)雄性不育性。其它雄性不育性基因編碼葡聚糖酶；脂酶，諸如磷脂酶A2(Verheij等人.Rev.Biochem.Pharmacol.91:92-203(1981));脂質(zhì)過氧化物酶；或植物細(xì)胞壁抑制劑。雄性不育性基因的其它實(shí)例編碼對(duì)植物細(xì)胞有毒的蛋白質(zhì)，諸如細(xì)菌毒素(例如，白喉毒素或肉毒桿菌毒素的B片段)。雄性不育性基因的另一實(shí)例為反義核酸，或RNA干預(yù)(RNAi)中涉及的RNA(諸如小干預(yù)RNA(siRNA))，其可用于抑制或完全阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)。舉例來說，本發(fā)明的反義或RNAi分子編碼與植物繁殖細(xì)胞中在內(nèi)源啟動(dòng)子控制下天然轉(zhuǎn)錄的鏈互補(bǔ)的核酸鏈，舉例來說，所述內(nèi)源啟動(dòng)子如歐洲專利公開案0，223，399中所述。所述反義核酸或RNAi分子能夠與繁殖細(xì)胞中天然產(chǎn)生的RNA的編碼和/或非編碼部分結(jié)合，從而抑制天然產(chǎn)生的RNA的翻譯。在一實(shí)施例中，可在花粉粒、絨氈層、花粉囊、花絲、花粉母細(xì)胞、小孢子、小孢子母細(xì)胞、雄性花粉球(雄球花)、花粉囊和成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)本發(fā)明的反義核酸和RNAi分子。小孢子發(fā)生是二倍體細(xì)胞、即小孢子母細(xì)胞經(jīng)歷減數(shù)分裂分離而產(chǎn)生四個(gè)單倍體小孢子(小孢子四分體)的過程。小孢子四分體是封閉于胼胝質(zhì)細(xì)胞壁中。在被子植物中，小孢子發(fā)生出現(xiàn)于雄蕊(即花的雄性繁殖組織)中。每一雄蕊都具有花絲和花藥。每一花藥都具有一到四個(gè)室，稱為花粉囊或花藥囊。每一花藥囊產(chǎn)生多個(gè)小孢子母細(xì)胞，也稱為花粉母細(xì)胞。在裸子植物中，小孢子發(fā)生出現(xiàn)于小孢子葉的小孢子囊或花粉囊中。在小孢子囊內(nèi)，小孢子經(jīng)歷有絲分裂并產(chǎn)生四室雄性配子體。裸子植物的花粉粒包含小孢子壁和所含的雄性配子體。單子葉植物(monocot):具有含一個(gè)子葉(cotyledon或seedleaf)的胚、平行葉脈和三朵花部分的有花植物。單子葉植物的實(shí)例包括(但不限于)草坪草、玉米、稻子、燕麥、小麥、大麥、高粱、蘭花、鳶尾屬植物、百合花、洋蔥和棕櫚。草坪草的實(shí)例包括(但不限于)翦股穎屬(Agrostisspp.)(包括細(xì)弱翦股穎(colonialbentgrass)和匍蔔翦股穎(creepingbentgrasses)的剪股穎屬)、草地早熟禾(Poapratensis/kentuckybluegrass)、黑麥草屬(Loliumspp.)(包括一年生黑麥草(annualryegrass)和多年生黑麥草(perennialryegrass)白勺黑麥草屬)、高羊茅(Festucaarundinacea/tallfescue)、叢生型紫羊茅(Festucarubracommutata)(細(xì)羊茅(finefescue))、狗牙根(Cynodondactylon)(包括Tifgreen、TifwayII禾卩SantaAna的常見狗牙根品種和其雜交體)、東非狼尾草(Pennisetumclandestinum)(克育草(kikuyugrass))、鈍口十草(Stenotaphrumsecundatum)(圣奧古斯丁草(St.augustinegrass))、纟吉縷草(Zoysiajaponica/zoysiagrass)禾口馬蹄金(Dichondramicrantha)。可操作地連接以使兩個(gè)或兩個(gè)以上分子的組合在植物細(xì)胞中適當(dāng)起作用的方式組合所述兩種或兩種以上分子。舉例來說，當(dāng)啟動(dòng)子控制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)，啟動(dòng)子可操作地連接到結(jié)構(gòu)基因。表型表型為植物可辨識(shí)的特征或特性，可根據(jù)本發(fā)明通過將一種或一種以上"所需聚核苷酸"和/或可篩選/可選擇的標(biāo)記整合到經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的至少一個(gè)植物細(xì)胞的基因組中來變化所述特征或特性。"所需聚核苷酸"和/或標(biāo)記可通過改變經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或植物整體的多個(gè)遺傳、分子、生物化學(xué)、生理學(xué)、形態(tài)學(xué)或農(nóng)藝學(xué)特性或性質(zhì)中的任一個(gè)來使經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型改變。因此，植物基因組中一個(gè)或一個(gè)以上穩(wěn)定整合的所需聚核苷酸的表達(dá)可得到選自由(例如)以下表型組成的群組的表型增加的耐旱性、增強(qiáng)的耐寒和耐凍性、改良的活力、增強(qiáng)的顏色、增強(qiáng)的健康和營養(yǎng)特性、改良的儲(chǔ)存、增強(qiáng)的產(chǎn)量、增強(qiáng)的耐鹽性、增強(qiáng)的對(duì)重金屬的耐受性、增加的對(duì)疾病的耐受性、增加的對(duì)昆蟲的耐受性、增加的對(duì)水壓的耐受性、增強(qiáng)的甜味、改良的活力、改良的味道、改良的結(jié)構(gòu)、降低的磷酸鹽含量、增加的發(fā)芽率、增加的微量營養(yǎng)素?cái)z取、改良的淀粉組成和改良的花期。植物組織"植物"是特性上產(chǎn)生胚、含有葉綠體且具有纖維素細(xì)胞壁的植物界王國中多種光合成、真核、多細(xì)胞有機(jī)體中的任一種?？筛鶕?jù)本發(fā)明的方法轉(zhuǎn)化植物的一部分(即"植物組織")以制造轉(zhuǎn)基因植物。許多適當(dāng)?shù)闹参锝M織可根據(jù)本發(fā)明加以轉(zhuǎn)化，且包括(但不限于)體細(xì)胞胚、花粉、葉、桿、胼胝體、匍匐莖、微管和枝條。因此，本發(fā)明預(yù)期被子植物和裸子植物的轉(zhuǎn)化，所述植物諸如草坪草、小麥、玉米、稻子、大麥、燕麥、甜菜、馬鈴薯、番茄、煙草、紫花苜蓿、萵苣、胡蘿卜、草莓、木薯、甘薯、老獾草、大豆、櫟樹、蘋果、葡萄樹、松樹、冷杉、金合歡、桉樹、胡桃和棕櫚。根據(jù)本發(fā)明，"植物組織"也涵蓋植物細(xì)胞。植物細(xì)胞包括懸浮培養(yǎng)物、胼胝體、胚、分生組織區(qū)、胼胝體、葉、根、枝條、配子體、孢子體、花粉、種子和小孢子。植物組織可處于成熟期的各個(gè)階段，且可生長(zhǎng)于罐、溫室或田間的液體或固體培養(yǎng)物中或土壤中或適當(dāng)培養(yǎng)基中。植物組織也是指無性繁殖或有性繁殖產(chǎn)生的所述植物、種子、后代、繁殖體的任何克隆，和任何所述植物組織的子孫后代，諸如插枝或種子。特別引人關(guān)注的為松類，諸如松樹、冷杉和云杉；單子葉植物，諸如草地早熟禾、匍匐翦股穎、玉米和小麥和雙子葉植物，諸如棉、番茄、萵苣、擬南芥、煙草、蘋果和老獾草。植物轉(zhuǎn)化和細(xì)胞培養(yǎng)廣義上是指基因修飾植物細(xì)胞并將其轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)闹参锱囵B(yǎng)基中以供維持、進(jìn)一步生長(zhǎng)和/或進(jìn)一步發(fā)育的方法。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知所述方法?；ǚ凼侵阜N子植物的小孢子且小孢子的粉末狀塊是從花藥和雄球花中流出的。成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)是指在被子植物和裸子植物種類中的雌性組織發(fā)育和分化前形成的細(xì)胞和組織。成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)是指在被子植物和裸子植物種類中的雄性組織發(fā)育和分化前形成的細(xì)胞和組織。后代本發(fā)明的"后代"(諸如轉(zhuǎn)基因植物的后代)為出自植物或轉(zhuǎn)基因植物、由植物或轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)生或源自植物或轉(zhuǎn)基因植物的物質(zhì)。因此，"后代"植物，即"F1"代植物是由本發(fā)明的方法制造的轉(zhuǎn)基因植物的苗種或子孫后代。轉(zhuǎn)基因植物的后代可含有至少一種、部分或全部的其細(xì)胞基因組，即已通過本文所述的方法整合到親代轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞中的所需聚核苷酸。因此，后代植物得以"傳遞"或"繼承"所需聚核苷酸。后代植物由此繼承的所需聚核苷酸可存在于T-DNA構(gòu)筑體內(nèi)，所述T-DNA構(gòu)筑體也是由后代植物從其親代繼承得到。也可認(rèn)為如本文所使用的術(shù)語"后代"為一組植物的苗種或子孫后代。啟動(dòng)子旨在意謂結(jié)合RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的核酸、優(yōu)選DNA。與任何啟動(dòng)子一樣，本發(fā)明的啟動(dòng)子序列將促進(jìn)或控制DNA或RNA轉(zhuǎn)錄而由可操作地連接到所述啟動(dòng)子的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。如上文所述，所產(chǎn)生的RNA可編碼蛋白質(zhì)或多肽，或可編碼RNA干預(yù)或反義分子。如本文所使用的啟動(dòng)子也可包括調(diào)控元件。相反，調(diào)控元件也可與啟動(dòng)子分離。調(diào)控元件賦予啟動(dòng)子區(qū)多種重要特性。一些元件與增強(qiáng)可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄速率的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。其它元件與抑制轉(zhuǎn)錄活性的阻遏物結(jié)合。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子活性的作用可確定啟動(dòng)子活性為高或低的，即啟動(dòng)子為"強(qiáng)"或"弱"。植物啟動(dòng)子是能夠起始植物細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，無論其起點(diǎn)是否在植物細(xì)胞內(nèi)。示范性植物啟動(dòng)子包括(但不限于)從植物、植物病毒和細(xì)菌(諸如農(nóng)桿菌或根瘤菌)獲得的啟動(dòng)子，其包含植物細(xì)胞中所表達(dá)的基因。發(fā)育控制下的啟動(dòng)子的實(shí)例包括優(yōu)先起始某些組織的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，所述組織諸如絨氈層、木質(zhì)部、葉、根或種子。所述啟動(dòng)子稱為組織優(yōu)選的啟動(dòng)子。僅起始某些組織的轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子稱為組織特異性啟動(dòng)子。細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子主要驅(qū)動(dòng)一種或一種以上器官(例如根或葉中的脈管細(xì)胞)中某些細(xì)胞類型的表達(dá)?？烧T導(dǎo)或可阻遏的啟動(dòng)子為環(huán)境控制下的啟動(dòng)子?？赏ㄟ^可誘導(dǎo)啟動(dòng)子影響轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件的實(shí)例包括厭氧條件、熱或存在光。組織特異性、組織優(yōu)選、細(xì)胞類型特異性和可誘導(dǎo)啟動(dòng)子將組成非組成性啟動(dòng)子類。組成性啟動(dòng)子為在大部分環(huán)境條件下且在大部分植物部分中具活性的啟動(dòng)子。聚核苷酸是包含基因編碼序列或其片段(包含至少15個(gè)連續(xù)核苷酸、至少30個(gè)連續(xù)核苷酸或至少50個(gè)連續(xù)核苷酸)、啟動(dòng)子、內(nèi)含子、增強(qiáng)子區(qū)、多聚腺苷酸化位點(diǎn)、翻譯起始位點(diǎn)、5'或3'未翻譯區(qū)、報(bào)告基因、可選擇標(biāo)記等的核苷酸序列。聚核苷酸可包含單鏈或雙鏈DNA或RNA。聚核苷酸可包含經(jīng)修飾堿基或經(jīng)修飾骨架。聚核苷酸可為基因組、RNA轉(zhuǎn)錄本(諸如mRNA)或經(jīng)加工核苷酸序列(諸如cDNA)。聚核苷酸可包含有義或反義方向的序列。經(jīng)分離聚核苷酸為非天然狀態(tài)的聚核苷酸序列，例如，聚核苷酸包含未見于自然界中的核苷酸序列，或聚核苷酸與其通常接近的核苷酸序列分離，或聚核苷酸與其通常不接近的核苷酸序列接近?？稍偕匀绫疚乃褂茫涫侵钢参镉擅摲只M織再分化的能力。繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子是指優(yōu)先在植物繁殖組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。繁殖植物組織包括繁殖結(jié)構(gòu)的雄性與雌性部分，以及成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)與成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。雄性繁殖組織包括(例如)花粉粒、絨氈層、花藥、花絲、花粉母細(xì)胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)。雌性繁殖組織包括(例如)柱頭、花柱、子房、大孢子、珠鱗、苞葉、雌球花(胚珠)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。因此，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可優(yōu)先在任何被子植物繁殖結(jié)構(gòu)或裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)。種子可認(rèn)為"種子"是含有胚的成熟植物胚珠和植物的繁殖部分(如塊莖或孢子)?？稍谶M(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之前，例如于暗室中培育種子以促進(jìn)發(fā)芽。也可在培育之前諸如通過用漂白法進(jìn)行簡(jiǎn)單處理使種子滅菌。隨后，可將所得籽苗暴露至所需的農(nóng)桿菌菌株?？蛇x擇/可篩選標(biāo)記如果在植物或植物組織中表達(dá)時(shí)可能使該等組織與其他植物或植物組織相區(qū)別的基因，其中所述其他植物或植物組織并不表達(dá)所述基因。篩選程序可能需要對(duì)可篩選標(biāo)記基因編碼的蛋白質(zhì)表達(dá)進(jìn)行分析。所述標(biāo)記的實(shí)例包括卩葡糖苷酸酶(GUS)基因和熒光素酶(LUX)基因?？蛇x擇的標(biāo)記的實(shí)例包括編碼卡那霉素(kanamycin)和遺傳霉素(geneticin)抗性的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(neomycinphosphotransferase,NPTII)基因；編碼對(duì)潮霉素(hygromycin)的抗性的潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HPT或APHIV)基因；編碼對(duì)磺酰脲型除草劑抗性的乙酰乳酸合成酶(als)基因；編碼對(duì)除草劑的抗性的基因(BAR和/或PAT)，所述除草劑起到抑制谷氨酰胺合成酶作用的作用，諸如草銨膦(phosphinothricin)(Liberty或Basta);或其它此項(xiàng)技術(shù)中已知的類似基因。序列同一性如本文關(guān)于兩種核酸或多肽序列的內(nèi)容中所使用，"序列同一性"或"同一性"包括當(dāng)在特定區(qū)域內(nèi)對(duì)準(zhǔn)以達(dá)成最大對(duì)應(yīng)時(shí)兩個(gè)序列中相同的殘基的相關(guān)物。如本文所使用，序列同一性百分?jǐn)?shù)意指通過比較比較窗(comparisonwindow)內(nèi)兩個(gè)最佳對(duì)準(zhǔn)的序列所測(cè)定的值，其中當(dāng)與兩個(gè)序列的最佳對(duì)準(zhǔn)的參考序列(不包含加入或缺失)相比較時(shí)，所述比較窗中聚核苷酸序列的部分可包含加入或缺失(即，間隙)。通過測(cè)定相同核酸堿基出現(xiàn)于兩個(gè)序列中的位置的數(shù)量得到匹配位置的數(shù)量，以匹配位置的數(shù)量除以比較窗中的位置總數(shù)并將結(jié)果乘以100以得到序列同一性的百分?jǐn)?shù)，從而來計(jì)算所述百分?jǐn)?shù)。雄蕊是指產(chǎn)生雄配子的花器官且包括花藥和花絲。絨氈層是指包圍被子植物花藥的小造孢細(xì)胞(microsporogenouscell)或裸子植物雄球花內(nèi)的微造孢細(xì)胞的細(xì)胞層。已知其極其接近正在發(fā)育的小孢子，絨氈層可能向正在發(fā)育的小孢子提供養(yǎng)分，諸如還原糖、氨基酸和脂質(zhì)。Reznickova，C.R.，Acad.Bulg.Sci.31:1067(1978).Nave等人，J.PlantPhysiol.125:451(1986).Sawhney等人，J.PlantPhysiol125:467(1986)。絨氈層細(xì)胞也產(chǎn)生(3(1，3)葡聚糖酶(過氧化氫酶)，其通過消化胼胝質(zhì)細(xì)胞壁促進(jìn)小孢子釋放。因此，絨氈層與小造孢細(xì)胞之間存在脆弱的關(guān)系，且對(duì)于絨氈層的任何破壞都可能導(dǎo)致無功能的花粉粒。舉例來說，己展示，絨氈層生物發(fā)生的損傷會(huì)導(dǎo)致雄性不育性突變體(Kaul，"MaleSterilityinHigherPlants"inMonographsonTheoreticalandAppliedGenetics;Frankel等人編輯；SpringerVerlag;Vol.10;第15-95頁；(1988))。因此，編碼過氧化氫酶的基因可用于破壞雄性繁殖發(fā)育。由此，可使用例如重組DNA分子來誘導(dǎo)使小孢子無法發(fā)育成成熟花粉粒，所述重組DNA分子包含能夠在絨氈層特異性調(diào)控序列控制下破壞絨氈層功能的基因。轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子是指通過與一種或一種以上與基因編碼序列有關(guān)的核苷酸序列直接結(jié)合或間接影響與一種或一種以上與基因編碼序列有關(guān)的核苷酸序列直接結(jié)合的另一聚核苷酸的活性來調(diào)控基因表達(dá)的多肽序列。轉(zhuǎn)錄因子可活化(上調(diào))或阻遏(下調(diào))基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子可含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、活化結(jié)構(gòu)域或蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)域。在本發(fā)明中，轉(zhuǎn)錄因子能夠進(jìn)行(1)與核酸序列結(jié)合或(2)調(diào)控植物細(xì)胞中基因的表達(dá)的至少一種。轉(zhuǎn)錄和翻譯終止子本發(fā)明的表達(dá)DNA構(gòu)筑體通常在轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控元件對(duì)立端具有轉(zhuǎn)錄終止區(qū)?？筛鶕?jù)mRNA的穩(wěn)定性來選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)以增強(qiáng)表達(dá)，和/或可根據(jù)加入到基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的多聚腺苷酸化尾的加入來選擇轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。轉(zhuǎn)移DNA(T-DNA):農(nóng)桿菌T-DNA是一種基因元件，眾所周知，其為一種能夠?qū)⑵溥吔鐑?nèi)所含的核苷酸序列整合到另一基因組中的元件。就這方面來說，T-DNA通常通過兩個(gè)"邊界"序列側(cè)面相接。本發(fā)明的所需聚核苷酸和可選擇標(biāo)記可定位于T-DNA的左邊界樣序列(leftborder-likesequence)與右邊界樣序列之間?？蓪-DNA內(nèi)所含的所需聚核苷酸和可選擇標(biāo)記可操作地連接到促進(jìn)其表達(dá)(即，由所需聚核苷酸或可選擇標(biāo)記編碼的DNA序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯)的多種不同、植物特異性(即，天然)或外來核酸，如啟動(dòng)子和終止子調(diào)控元件。植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化一種將核酸穩(wěn)定插入到植物細(xì)胞基因組中的方法。轉(zhuǎn)化可在天然或人工條件下使用多種此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的方法發(fā)生。轉(zhuǎn)化可取決于將核酸序列插入到原核或真核宿主細(xì)胞中的任何已知方法，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方案、病毒感染、噬菌體晶須(whisker)、電穿孔、微注射、聚乙二醇處理、熱休克(heatshock)、脂轉(zhuǎn)染(lipofection)禾口粒子轟擊。轉(zhuǎn)基因植物本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物是包含至少一種已穩(wěn)定整合外源核酸的細(xì)胞基因組的植物。根據(jù)本發(fā)明，轉(zhuǎn)基因植物是一種可僅包含一種經(jīng)基因修飾的細(xì)胞和細(xì)胞基因組的植物，或其可包含若干種或許多經(jīng)基因修飾的細(xì)胞，或所有所述細(xì)胞都可經(jīng)基因修飾。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因植物可為一種所需聚核苷酸(即，外源核酸)的表達(dá)僅發(fā)生于植物的某些部分中的植物。因此，轉(zhuǎn)基因植物可僅在其結(jié)構(gòu)的某些部分中含有經(jīng)基因修飾的細(xì)胞。變異體如本文所使用的"變異體"應(yīng)理解為意指源自特定基因的參考(即，天然、標(biāo)準(zhǔn)或已知)核苷酸序列的核苷酸序列。術(shù)語"同工型(isoform)"、"同種型(isotype)"和"類似物"也是指核苷酸序列的"變異體"形式。變異體也可指"改組基因(shuffledgene)"，諸如頒予Maxygen的專利中所述的那些基因。舉例來說，本發(fā)明的變異體可包括根據(jù)美國專利第6,132,970號(hào)中所公開的方法和基本原理修飾的序列和所需聚核苷酸的變異體，所述專利是以引用的方式并入本文。營養(yǎng)生長(zhǎng)這一為此項(xiàng)技術(shù)廣泛接受的術(shù)語是指植物的常規(guī)、總體發(fā)育。詳細(xì)說來，例如，繁殖后，分生組織細(xì)胞分化成最終發(fā)育成根和枝條且之后發(fā)育成葉和花的頂端分生組織和側(cè)分生組織。枝條和根構(gòu)型、分枝模式、發(fā)育成葉、花瓣、花和果實(shí)的桿、腋芽和原基細(xì)胞等都被認(rèn)為是植物的"營養(yǎng)期"和"營養(yǎng)生長(zhǎng)"循環(huán)的一部分。所述特征的發(fā)育速率視多種因素而定，諸如植物種類、光合作用、養(yǎng)分的可用性和植物生長(zhǎng)的一般環(huán)境。遺傳學(xué)也在成形植物發(fā)育中起到重要的文字和比喻作用。舉例來說，可通過基因表達(dá)推斷"單葉"或"復(fù)葉"的形狀，即其以周邊光滑、深葉片(deeplobe)、個(gè)別小葉或巻須為特征。例如，"LEAFY"基因?qū)τ趶?fù)葉發(fā)育起到作用且對(duì)于從營養(yǎng)生長(zhǎng)至繁殖發(fā)育的過渡至關(guān)重要。已在擬南芥和金魚草中鑒別出LEAFY,且其與其他被子植物中的基因相同。豌豆的同源物Unifoliata具有復(fù)葉變?yōu)閱稳~的突變體表型，其可表明枝條與復(fù)葉之間的調(diào)控關(guān)系。類似地，金合歡突變體"tl"將巻須轉(zhuǎn)變成小葉，同時(shí)突變afilia("af")將小葉轉(zhuǎn)變成巻須。"aftl"雙突變體具有復(fù)雜構(gòu)型，類似于歐芹葉。同樣，始終在所述"營養(yǎng)"植物細(xì)胞和組織中表達(dá)的其它基因也是這樣，且包含植物其它細(xì)微部分的發(fā)育、生理學(xué)和結(jié)構(gòu)特性。因此，存在許多特定或主要在所有營養(yǎng)組織(諸如，根、枝條、桿和葉)中表達(dá)的"營養(yǎng)特異性"基因，或其為營養(yǎng)組織特異性。因此，所述基因的啟動(dòng)子可用于引導(dǎo)所需的內(nèi)源或外來基因表達(dá)特定的營養(yǎng)組織。由此，可能優(yōu)先在一種或一種以上營養(yǎng)組織中表達(dá)基因產(chǎn)物，同時(shí)避免在諸如繁殖組織細(xì)胞的非營養(yǎng)組織中表達(dá)相同產(chǎn)物。木材組成是指可經(jīng)修飾以改變木材的結(jié)構(gòu)、外觀或用途的特質(zhì)。并非出于限制，確定木材組成的特質(zhì)包括細(xì)胞壁厚度、細(xì)胞長(zhǎng)度、細(xì)胞尺寸、內(nèi)腔尺寸、細(xì)胞密度、微纖維角度、拉伸強(qiáng)度、撕裂強(qiáng)度、木材顏色和細(xì)胞分裂的長(zhǎng)度和頻率。木漿是指由具有不同純度的樹木產(chǎn)生的纖維。木漿可用于造紙、紙板和化學(xué)制品。應(yīng)了解，由于本文所述的特定方法、方案、載體和試劑等可變化，所以本發(fā)明不限于此。還應(yīng)了解，本文所使用的術(shù)語只是出于描述特定實(shí)施例的目的使用，且不打算限制本發(fā)明的范疇。必須注意，除非本文另作清楚指示，否則如本文和隨附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一種"和"所述"包括多種參考物。因此，舉例來說，"基因"的相關(guān)物為一種或一種以上基因的相關(guān)物，且包括其所屬領(lǐng)域技術(shù)人員己知的等效物。當(dāng)然，所屬領(lǐng)域技術(shù)人可使用本文所述的方法來表達(dá)植物宿主系統(tǒng)中的任何天然基因(當(dāng)前或后來已知)。微"經(jīng)分離"核酸分子預(yù)期表示己從天然環(huán)境中移除的核酸分子、DNA或RNA。舉例來說，認(rèn)為載體中所含的重組DNA分子是出于本發(fā)明的目的而分離的。經(jīng)分離的DNA分子的其它實(shí)例包括異源宿主細(xì)胞中維持的重組DNA分子，或溶液中的經(jīng)純化(部分或大體全部)DNA分子。經(jīng)分離的RNA分子包括本發(fā)明的DNA分子的體外RNA轉(zhuǎn)錄本。根據(jù)本發(fā)明，經(jīng)分離核酸分子另外包括合成制得的所述分子。本發(fā)明的核酸分子可為RNA的形式，諸如mRNA;或DNA的形式，包括(例如)通過克隆獲得或合成制得的cDNA和基因組DNA。DNA或RNA可為雙鏈或單鏈。單鏈DNA可為編碼鏈，也稱為有義鏈；或其可為非編碼鏈，也稱為反義鏈。除非另外指出，否則通過對(duì)本文中的DNA分子測(cè)序所測(cè)定的所有核苷酸序列都是使用自動(dòng)化DNA測(cè)序儀(諸如來自AppliedBiosystems，Inc.的3700型)測(cè)定，且由本文所測(cè)定的DNA分子編碼的多肽的所有氨基酸序列都是通過翻譯如上文所測(cè)定的DNA序列進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于此項(xiàng)技術(shù)中己知通過此自動(dòng)化方法測(cè)定的任何DNA序列，所以本文所測(cè)定的任何核苷酸序列都可能含有一些錯(cuò)誤。通過自動(dòng)操作測(cè)定的核苷酸序列與經(jīng)測(cè)序DNA分子的實(shí)際核苷酸序列具有通常至少約95%、更通常至少約％%直至至少約99%同一性?？赏ㄟ^其它方法(包括此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的人工DNA測(cè)序方法)更精確地測(cè)定實(shí)際序列。也如此項(xiàng)技術(shù)中已知，與實(shí)際序列相比，已測(cè)定的核苷酸序列中的單一插入或缺失將引起核苷酸序列翻譯時(shí)框架移位(frameshift),從而使所預(yù)測(cè)的由已測(cè)定的核苷酸序列編碼的氨基酸序列可能從所述插入或缺失點(diǎn)開始與由經(jīng)測(cè)序的DNA分子實(shí)際編碼的氨基酸序列完全不同。除非另作指示，否則本文所述的每一"核苷酸序列"都是以脫氧核糖核苷酸序列(簡(jiǎn)寫為A、G、C和T)呈現(xiàn)。然而，預(yù)期核酸分子或聚核苷酸的"核苷酸序列"為DNA分子或聚核苷酸，即脫氧核糖核苷酸；和RNA分子或聚核苷酸，即特定脫氧核苷酸序列中的每一胸苷脫氧核苷酸(T)都經(jīng)核糖核苷酸尿苷(U)置換的核糖核苷酸(A、G、C和U)的對(duì)應(yīng)序列。舉例來說，預(yù)期具有使用脫氧核糖核苷酸簡(jiǎn)寫陳述的SEQIDNO:l序列的RNA分子的相關(guān)物表明具有其中SEQIDNO:l的每一脫氧核糖核苷酸A、G或C都已經(jīng)相應(yīng)核糖核苷酸A、G或C置換且每一脫氧核糖核苷酸T都已經(jīng)核糖核苷酸U置換的序列的RNA分子。本發(fā)明還涉及本文所述的經(jīng)分離核酸分子的片段。預(yù)期具有本文所公開的核苷酸序列的經(jīng)分離DNA分子的片段為至少15個(gè)核苷酸、至少20個(gè)核苷酸、至少30個(gè)核苷酸長(zhǎng)的DNA片段，其可用作診斷探針，且引物將于下文中更詳細(xì)地討論。當(dāng)然，根據(jù)常規(guī)雜交技術(shù)，長(zhǎng)達(dá)本發(fā)明核酸分子的全長(zhǎng)的較長(zhǎng)核酸片段也可在診斷上用作探針，或用作引物以通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)序列，舉例來說，如MolecularCloning,ALaboratoryManual,第3版，Sambrook，J禾口Russel，D.W.編輯，(2001)，ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork中所述，所述文獻(xiàn)的整個(gè)公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。預(yù)期(例如)至少20個(gè)核苷酸長(zhǎng)的片段為包括20個(gè)或20個(gè)以上來自如本文所公開的核苷酸序列(即，SEQIDNO1-26)的相鄰堿基的片段?？墒褂脤?duì)于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說為例行程序的常規(guī)DNA合成方法來產(chǎn)生包含本文所公開的核苷酸序列的核酸。舉例來說，可簡(jiǎn)單地使用限制性核酸內(nèi)切酶裂解或超音波處理剪切來產(chǎn)生各種尺寸的片段。或者，可根據(jù)己知技術(shù)合成性產(chǎn)生本發(fā)明的DNA片段。另一方面，本發(fā)明提供一種經(jīng)分離的核酸分子，其包含在嚴(yán)格雜交條件下與上述本發(fā)明核酸分子中的一部分聚核苷酸雜交的聚核苷酸。預(yù)期與"一部分"聚核苷酸雜交的聚核苷酸為與參考聚核苷酸中至少約15個(gè)核苷酸、至少約20個(gè)核苷酸、至少約30個(gè)核苷酸和30個(gè)以上核苷酸雜交的聚核苷酸(DNA或RNA)。與參考片段雜交的這些片段可用作診斷探針和引物。如本文所使用，探針是定義為一個(gè)本文所公開的核酸(即，SEQIDNOl-S和13-26)中的至少約50個(gè)相鄰堿基。出于本發(fā)明的目的，當(dāng)兩個(gè)序列在6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt氏溶液和100非特異性DNA載體的雜交溶液中形成雙鏈復(fù)合物時(shí)，其雜交。參看Ausubel等人，第2.9節(jié)，第27增補(bǔ)版(1994)。序列可在"中等嚴(yán)格度"下雜交，所述"中等嚴(yán)格度"定義為在6xSSC、0.5%SDS、5xDenhardt氏溶液和100嗎非特異性載體DNA的雜交溶液中、在6(TC的溫度下。就"高嚴(yán)格度"雜交來說，溫度增加至68'C。在中等嚴(yán)格度雜交反應(yīng)后，室溫下，在2xSSC和0.05呢SDS溶液中洗滌核苷酸5次，隨后在60'C下用0.1xSSC和0.05呢SDS溶液洗滌lh。對(duì)于高嚴(yán)格度來說，洗滌溫度增加至6S'C。出于本發(fā)明的目的，雜交核苷酸為使用具有10,000cpm/ng的比放射性的1ng經(jīng)放射標(biāo)記的探針檢測(cè)的核苷酸，其中雜交核苷酸在-7(TC下曝露于X射線膠片僅72小時(shí)后即清晰可見。如前文所提及，本申請(qǐng)案涉及與上述核酸序列具有至少90%、95%、％%、97%、98%、99%或100%同一性的所述核酸分子。一個(gè)實(shí)施例涵蓋與SEQIDNO1-8和13-26中所示的核酸序列具有至少95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核酸分子。具有與參考核苷酸序列具有至少(例如)95%同一性的核苷酸序列的聚核苷酸意味著聚核苷酸的核苷酸序列與參考序列相同，但對(duì)于每100個(gè)參考核苷酸序列的核苷酸來說，聚核苷酸序列可包括多達(dá)五個(gè)突變點(diǎn)。換句話說，為獲得具有與參考核苷酸序列具有至少95%同一性的核苷酸序列的聚核苷酸，參考序列中多達(dá)5%核苷酸可缺失或經(jīng)另一核苷酸取代，或可將占參考序列中總核苷酸多達(dá)5%的數(shù)量的核苷酸插入到參考序列中。參考序列的這些突變可出現(xiàn)于參考核苷酸序列的5'或3'末端位置處，或所述末端位置之間的任何位置處，獨(dú)立地散布于參考序列中的核苷酸之間或散布于參考序列內(nèi)一個(gè)或一個(gè)以上相鄰基團(tuán)中。實(shí)際上，任何特定核酸分子是否與參考核苷酸片段具有至少95%、96%、97%、98%或99%同一性是指使用此項(xiàng)技術(shù)中眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)算法在兩個(gè)分子之間作出的比較。盡管可使用任何序列算法來定義序列的同一性，但為清楚起見，本發(fā)明參考基本局部比對(duì)搜尋工具(BasisLocalAlignmentSearchTool，BLAST)算法(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-410(1990))來定義同一性，其中將
發(fā)明內(nèi)容中所述的啟動(dòng)子序列用作參考序列以在其長(zhǎng)度范圍內(nèi)定義聚核苷酸同源物的同一性百分?jǐn)?shù)。匹配、錯(cuò)配和插入或缺失的參數(shù)值的選擇是任意的，但已經(jīng)發(fā)現(xiàn)某些參數(shù)值以得到在生物學(xué)上比其它值切合實(shí)際的結(jié)果。當(dāng)使用BLAST或任何其它序列比對(duì)程序來確定特定序列(例如)是否與本發(fā)明的參考序列具有95%同一性時(shí)，當(dāng)然設(shè)置參數(shù)，從而能夠在參考核苷酸序列的全長(zhǎng)范圍內(nèi)計(jì)算同一性百分?jǐn)?shù)，且能夠允許同源性的間隙占參考序列中總核苷酸數(shù)量多達(dá)5%。也可參考兩種聚核苷酸通過形成互補(bǔ)堿基對(duì)而雜交形成雙鏈復(fù)合物的能力來描述其間關(guān)聯(lián)。本文先前已描述雜交條件。可使用增加溫度來分裂這些復(fù)合物。在結(jié)構(gòu)上更相同的兩個(gè)序列為需要較高溫度使其分裂或?qū)⑵?熔解"的序列。熔解雙鏈復(fù)合物所需的溫度稱為"Tm"。Tm與其它雜交參數(shù)之間的關(guān)系為Tm(°C)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(分率G+C)-0.63(甲酰胺％)-(600〃)其中Tm為由探針和其目標(biāo)組成的DNA雙鏈體的熔解溫度；且1=堿基對(duì)中雜合物的長(zhǎng)度，限制條件為1〉100個(gè)堿基對(duì)。Bolton等人，Proc.Natl.Acad.Sci.48:1390(1962)。一般說來，熔點(diǎn)改變r(jià)C表示DNA序列相似度存在0.7%至3.2%的差異。Bonner等人，JournalofMolecularBiology81:123-35(1973);McCarthy等人,InEvolutionofGeneticSystems,H.H.Smith(編車茸),BrookhavenSymposiuminBiologyNo.23，GordonandBreach,NewYork,第1-43頁(1972)。在6(TC下形成穩(wěn)定的DNA雙鏈體通常需要序列之間存在至少80%的序列同一性。Sibley等人，ACTA1:83-121(第18屆國際鳥類學(xué)大會(huì)的會(huì)議記錄(Proceedingsofthe18thInternationalOrnithologicalCongress)，Moscow,1982年8月16-24日，AcademyofSciencesoftheUSSR)。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸使被子植物和裸子植物的繁殖組織中的多肽或蛋白質(zhì)能夠優(yōu)先表達(dá)。本發(fā)明的核酸也可優(yōu)先引導(dǎo)植物繁殖組織中反義RNA或RNA干預(yù)(RNAi)中涉及的RNA(諸如，小干預(yù)RNA(siRNA))的表達(dá)，其可用于抑制或完全阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)。繁殖植物組織包括繁殖器官的雄性與雌性部分。雄性組織包括(例如)花粉、絨氈層、花藥、花絲、花粉母細(xì)胞、小孢子、雄性花粉球(雄球花)和成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)。雌性繁殖組織包括(例如)柱頭、花柱、子房、大孢子、雌球果(胚珠)和成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)。繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子是指優(yōu)先在植物繁殖組織中表達(dá)的啟動(dòng)子。繁殖植物組織包括繁殖結(jié)構(gòu)的雄性與雌性部分，以及成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)與成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)的啟動(dòng)子。雄性繁殖組織包括(例如)花粉粒、絨氈層、花藥、花絲、花粉母細(xì)胞、小孢子和花粉球。雌性繁殖組織包括(例如)柱頭、花柱、子房、大孢子和胚珠。因此，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子除在裸子植物和被子植物的任何成熟前雄性組織或成熟前雌性組織中表達(dá)外，還可優(yōu)先在任何被子植物或裸子植物種類的任何繁殖結(jié)構(gòu)中表達(dá)。在一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使雄性繁殖組織中的基因得以表達(dá)。在一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使被子植物種類的花藥、花粉或花絲細(xì)胞中能夠基因表達(dá)。在另一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使絨氈層或花藥表皮細(xì)胞中能夠基因表達(dá)。在另一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使雄性花粉球、絨氈層、小孢子葉或裸子植物中存在的任何其它雄性繁殖組織中能夠基因表達(dá)。對(duì)于被子植物和裸子植物來說，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中能夠基因表達(dá)。繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可用于(例如)使植物雄性不育。舉例來說，可使繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可操作地連接到細(xì)胞毒素基因，從而使雄性繁殖組織中細(xì)胞毒素基因的表達(dá)使植物無法產(chǎn)生可育雄配子。在另一實(shí)施例中，可選擇并分離繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子，從而使所述啟動(dòng)子不表達(dá)非繁殖組織(諸如營養(yǎng)組織)中可操作地連接的基因。在一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使雌性繁殖組織中的基因能夠表達(dá)。在一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使被子植物的柱頭、花柱或子房中的基因能夠表達(dá)。在另一實(shí)施例中，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使雌球花(胚珠)、大孢子葉或裸子植物中存在的任何其它雌性繁殖組織中能夠基因表達(dá)。對(duì)于被子植物和裸子植物來說，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子使成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中能夠基因表達(dá)。繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可用于(例如)使植物雌性不育。在一實(shí)施例中，可使繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到細(xì)胞毒素基因，從而使雌性繁殖組織中細(xì)胞毒素基因的表達(dá)使植物無法產(chǎn)生可育雌配子、雌合子和/或種子。在另一實(shí)施例中，可選擇并分離繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子，從而使啟動(dòng)子不表達(dá)非繁殖組織(諸如營養(yǎng)組織)中可操作地連接的基因。舉例來說，可通過搜尋僅在繁殖發(fā)育過程中存在的mRNA來鑒別繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子。另外，繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子可存在于成熟前雄性繁殖組織和成熟前雌性繁殖組織中。在一實(shí)施例中，由植物雄性繁殖組織發(fā)育過程中存在的mRNA鑒別繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子，所述雄性繁殖組織包括(例如)花藥、花粉、花絲、雄球花和成熟前雄性繁殖組織。在一實(shí)施例中，由植物雌性繁殖組織發(fā)育過程中存在的mRNA鑒別繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子，所述雌性繁殖組織包括(例如)柱頭、花柱、子房、胚珠和成熟前雌性繁殖組織。鑒別并分離繁殖優(yōu)選mRNA后，由這一繁殖優(yōu)選mRNA制備cDNA。可將所得cDNA用作探針以鑒別植物基因組中含有編碼繁殖優(yōu)選mRNA的DNA的區(qū)域。已鑒別DNA后，可分離編碼繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子的DNA上游(即，5')的序列。如本文所使用，預(yù)期啟動(dòng)子意指結(jié)合RNA聚合酶和/或其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的核酸、優(yōu)選DNA。與任何啟動(dòng)子一樣，本發(fā)明的啟動(dòng)子將促進(jìn)或控制DNA或RNA轉(zhuǎn)錄，從而由可操作地連接到所述啟動(dòng)子的核酸分子產(chǎn)生mRNA分子。如上文所述，所產(chǎn)生的RNA可編碼蛋白質(zhì)或多肽，或可編碼RNA干預(yù)或反義分子。如本文所使用，"可操作地連接"是指DNA的化學(xué)融合、接合或合成，從而以適當(dāng)?shù)姆较蛐纬蓡?dòng)子-核酸序列組合以使核酸序列轉(zhuǎn)錄成RNA區(qū)段。本發(fā)明的啟動(dòng)子也可含有所得mRNA轉(zhuǎn)錄本的部分或所有5'未翻譯區(qū)(5'UTR)。另一方面，本發(fā)明的啟動(dòng)子不需具有任何5'UTR。如本文所使用的啟動(dòng)子也可包括調(diào)控元件。相反，調(diào)控元件也可與啟動(dòng)子分離。調(diào)控元件賦予啟動(dòng)子區(qū)多種重要特性。一些元件與增強(qiáng)可操作地連接的核酸的轉(zhuǎn)錄速率的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合。其它元件與抑制轉(zhuǎn)錄活性的阻遏物結(jié)合。轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子活性的綜合作用可確定啟動(dòng)子活性為高或低的，即啟動(dòng)子為"強(qiáng)"或"弱"。結(jié)合調(diào)控元件的轉(zhuǎn)錄因子本身可通過對(duì)胞外刺激物起反應(yīng)而與其它已結(jié)合的蛋白質(zhì)相互作用或通過共價(jià)修飾(例如，磷酸化)得到調(diào)控。通過與細(xì)胞核聯(lián)系的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子(諸如，有機(jī)體的胞內(nèi)代謝物或外源化學(xué)物質(zhì))來調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性。不受細(xì)胞環(huán)境改變影響的啟動(dòng)子稱為組成性啟動(dòng)子。在另一實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸編碼破壞表達(dá)核酸的細(xì)胞的代謝、功能和/或發(fā)育的表達(dá)產(chǎn)物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸編碼細(xì)胞毒素表達(dá)產(chǎn)物。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的核酸包含barnase。在另一實(shí)施例中，可通過此項(xiàng)技術(shù)中已知的增加和/或降低barnase活性的方法使barnase突變。在一實(shí)施例中，突變barnase可具有減弱的細(xì)胞毒素活性。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的經(jīng)分離的核酸分子和多肽的載體。在一實(shí)施例中，本發(fā)明的載體為得自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒。在研究本發(fā)明的構(gòu)筑體時(shí)，通常將所述構(gòu)筑體或其片段的各種組件插入到常規(guī)克隆載體中，例如，能夠在細(xì)菌宿主(例如大腸桿菌(E.coli))中復(fù)制的質(zhì)粒。存在多種已在文獻(xiàn)中描述的載體，許多載體市面有售。每次克隆后，可分離具有所需插入物的克隆載體，并使其經(jīng)歷進(jìn)一步處理以定制具有所需序列的組件，所需處理諸如限制性消化、插入新片段或核苷酸、接合、缺失、突變、切除等。已完成構(gòu)筑體后，隨后可將其轉(zhuǎn)移至適當(dāng)?shù)妮d體中以供根據(jù)宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化方式進(jìn)行的進(jìn)一歩處理。本發(fā)明的重組DNA分子通常包括可選擇的標(biāo)記，從而可能從未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中輕易地鑒別經(jīng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞并加以選擇。所述標(biāo)記的實(shí)例包括(但不限于)新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(叩tll)基因，其賦予卡那霉素抗性。Potrykus等人，Mol.Gen.Genet.199:183-188(1985)。可使用諸如卡那霉素或G418的適當(dāng)抗生素來選擇表達(dá)叩tll基因的細(xì)胞。其它常用的可選擇標(biāo)記包括bar基因，其賦予雙丙氨膦(bialaphos)抗性；突變體EPSP合成酶基因(Hinchee等人，Bio/Technology6:915-922(1988))，其賦予草甘膦抗性；腈水解酶基因，其賦予對(duì)溴苯腈的抗性(Stalker等人，J.Biol，Chem.263:6310-6314(1988));突變體乙酰乳酸合成酶基因(ALS)，其賦予咪唑啉酮或磺酰脲抗性(歐洲專利申請(qǐng)案154,204,1985);和抗甲胺喋呤(methotrexate)的DHFR基因(Thillet等人，J.Biol.Chem.263:12500-12508(1988))。另外，載體可包括特定宿主細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)(復(fù)制子)。所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知多種原核復(fù)制子，且其起到引導(dǎo)原核宿主細(xì)胞自主復(fù)制和維持重組分子的作用。載體將優(yōu)選含有可選擇的標(biāo)記。用于選擇經(jīng)轉(zhuǎn)染植物細(xì)胞的多種可選擇標(biāo)記包括(但不限于)在大腸桿菌、根癌農(nóng)桿菌和其它細(xì)菌中培養(yǎng)的抗卡那霉素基因、抗草甘膦基因和四環(huán)素或氨比西林(ampicillin)抗性基因。適于使用微彈轟擊(microprojectilebombardment)將本發(fā)明的核酸引入單子葉植物中的質(zhì)粒載體是由以下元件構(gòu)成選擇性啟動(dòng)子；提供剪接位點(diǎn)以促進(jìn)基因表達(dá)的內(nèi)含子，諸如Hsp70內(nèi)含子(PCT公開案WO93/19189);和3'多聚腺苷酸化序列，諸如胭脂堿合成酶(nopalinesynthase)3'序歹iJ(NOS3')。Fraley等人，ProcNatlAcadSciUSA80:4803-4807(1983)。這一表達(dá)盒可組裝于適于產(chǎn)生大量DNA的高拷貝復(fù)制子上。用于轉(zhuǎn)化雙子葉植物的特別有益的基于農(nóng)桿菌的植物轉(zhuǎn)化載體為質(zhì)粒載體pMON530(Rogers等人，(1987)Improvedvectorsforplanttransformation:expressioncassettevectorsandnewselectablemarkers.InMethodsinEnzymology.R.Wu禾口L.Grossman編輯，第253-277頁，SanDiego:AcademicPress)。質(zhì)粒pMON530是通過將pMON316的2.3kbStuI-HindII片段(Rogers等人，(1987)Improvedvectorsforplanttransformation:expressioncassettevectorsandnewselectablemarkers.InMethodsinEnzymology.R.Wu禾卩L.Grossman編輯.第253-277頁.SanDiego:AcademicPress)轉(zhuǎn)移至pMON526中而制備的pMON505衍生物。質(zhì)粒pMON526是其中Smal位點(diǎn)因Xmal消化、Klenow聚合酶處理和接合而移除的pMON505的簡(jiǎn)單衍生物。質(zhì)粒pMON530保留pMON505和CaMV35S-NOS表達(dá)盒的所有特性，且現(xiàn)在啟動(dòng)子與多聚腺苷酸化信號(hào)之間含有獨(dú)特的Smal切割位點(diǎn)。二元載體pMON505是Ti質(zhì)粒同源區(qū)LIH己經(jīng)小RK2質(zhì)粒(miniRK2plasmid)pTJS75的3.8kbHindIII至ijSmal區(qū)段置換的pMON200(Rogers等人，1987)的衍生物(Schmidhauser和Helinski.J.Bacteriol.164-155(1985))。這一區(qū)段含有使用三親交配程序(tri-parentalmatingprocedure)結(jié)合到農(nóng)桿菌中的RK2復(fù)制起點(diǎn)oriV和轉(zhuǎn)移起點(diǎn)oriT(Horsch禾卩KleeProc.Natl.Acad.Sci.USA83:4428-4432(1986))。質(zhì)粒pMON505保留pMON200的所有重要特征，包括用于插入所需DNA片段中的合成多連接子(syntheticmulti-linker);用于植物細(xì)胞抗卡那霉素的嵌合NOS/NPTII/NOS基因；用于大腸桿菌和根癌農(nóng)桿菌選擇的抗奇放線菌素(spectinomycin)/抗鏈霉素(streptomycin)決定子；便于對(duì)轉(zhuǎn)化體和后代遺傳記分的完整胭脂堿合成酶基因；和便于在大腸桿菌中制得大量載體的pBR322復(fù)制起點(diǎn)。質(zhì)粒pMON505含有得自pTiT37胭脂堿型T-DNA的右端的單一T-DNA邊界。Southern印記分析己展示，質(zhì)粒pMON505和其所攜帶的任何DNA都已整合到植物基因組中，也就是說，完整的質(zhì)粒為已插入到植物基因組中的T-DNA。整合DNA的一端位于右邊界序列與胭脂堿合成酶基因之間，且另一端是介于邊界序列與pBR322序列之間。另一特別有用的Ti質(zhì)粒盒載體為pMON17227。這一載體在PCT公開案WO92/04449中得以描述，且含有編碼賦予草甘膦抗性的酶的基因(命名為CP4)，其是許多植物優(yōu)良的選擇性標(biāo)記，包括馬鈴薯和番茄。使基因與擬南芥EPSPS葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽(CTP2)融合，且通過所選擇的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)。為將經(jīng)翻譯蛋白質(zhì)分泌到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、周質(zhì)空間或胞外環(huán)境中，可將適當(dāng)?shù)姆置谛盘?hào)并入所表達(dá)的多肽中。所述信號(hào)對(duì)于所述多肽來說可為內(nèi)源信號(hào)，或其可為異源信號(hào)。在一實(shí)施例中，以使本文所述的核酸為組織特異性啟動(dòng)子的方式設(shè)計(jì)本發(fā)明的載體，所述啟動(dòng)子可操作地連接到編碼所關(guān)注的多肽的DNA。在另一實(shí)施例中，所關(guān)注的多肽為繁殖發(fā)育或調(diào)控繁殖發(fā)育方面所涉及的蛋白質(zhì)。編碼繁殖發(fā)育中所涉及的許多蛋白質(zhì)的多肽包括(但不限于)AGAMOUS(AG)、APETALA1(AP1)、APETAL3(AP3)、PISTILLATA(PI)、LEAFY(LFY)禾口LEUNIG(LUG)。在另一實(shí)施例中，可操作地連接到啟動(dòng)子的編碼序列可編碼抑制繁殖發(fā)育所涉及的蛋白質(zhì)的表達(dá)或活性的基因產(chǎn)物。舉例來說，可將編碼消化包圍正在發(fā)育的花粉粒的胼胝質(zhì)細(xì)胞壁的酶過氧化氫酶的基因可操作地連接到絨氈層優(yōu)選的啟動(dòng)子，并在花粉成熟前表達(dá)，由此破壞花粉的發(fā)育。在另一實(shí)施例中，可操作地連接到啟動(dòng)子的編碼序列可編碼細(xì)胞毒素基因產(chǎn)物。舉例來說，可使編碼baraase的基因可操作地連接到繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子，并使其在繁殖組織中表達(dá)。在另一實(shí)施例中，可使用標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)方法使baraase活性突變。在一實(shí)施例中，經(jīng)突變的barnase與野生型baraase蛋白質(zhì)相比具有降低的RNA酶活性。在另一實(shí)施例中，使具有降低的RNA酶活性的突變barnase可操作地連接到繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子，并使其在繁殖組織中表達(dá)。在又一實(shí)施例中，繁殖組織中具有降低的RNA酶活性的突變barnase的表達(dá)并不危及營養(yǎng)生長(zhǎng)和發(fā)育。在另一實(shí)施例中，設(shè)計(jì)本發(fā)明的載體從而使本發(fā)明的核酸可操作地連接到編碼反義RNA或干預(yù)RNA且與編碼所關(guān)注的多肽的基因?qū)?yīng)的核酸，引起目標(biāo)基因產(chǎn)物的表達(dá)減少。在一實(shí)施例中，旨在抑制的基因產(chǎn)物為繁殖發(fā)育所涉及的蛋白質(zhì)。使用RNAi抑制基因表達(dá)一般在Paddison等人，Genes&Dev.16:948-958(2002)中得以描述，且使用RNAi抑制植物基因的表達(dá)特別描述在WO99/61631中，所述兩種專利文獻(xiàn)都以引用的方式并入本文中。使用反義核酸技術(shù)(antisensetechnology)來降低或抑制特定植物基因的表達(dá)已描述在(例如)歐洲專利公開案第271,988號(hào)中?；虮磉_(dá)的降低導(dǎo)致植物表型改變，在總可見表型差異水平上，例如導(dǎo)致番茄果實(shí)中番茄紅素合成的缺乏，引起產(chǎn)生黃色而非紅色果實(shí)；或在更細(xì)微的生物化學(xué)水平上，例如導(dǎo)致番茄果實(shí)成熟期間多聚半乳糖醛酸酶的量改變和膠質(zhì)解聚合減少。Smith等人,Nature,334:724-726(1988)。Smith等人，PlantMol.Biol.,14:369-379(1990)。因此，已證實(shí)反義RNA可用于達(dá)成植物中基因表達(dá)的減少。在制造本發(fā)明的植物的方法的一個(gè)實(shí)施例中，將能夠在植物內(nèi)轉(zhuǎn)錄得到反義RNA轉(zhuǎn)錄本的外源DNA引入植物中，例如引入植物細(xì)胞中。舉例來說，可通過關(guān)于基因序列的啟動(dòng)子倒轉(zhuǎn)基因序列方向來制備外源DNA。植物細(xì)胞中外源DNA轉(zhuǎn)錄會(huì)產(chǎn)生關(guān)于所述基因?yàn)?反義"的胞內(nèi)RNA轉(zhuǎn)錄本。本發(fā)明還提供包含本發(fā)明的載體的宿主細(xì)胞。如本文所使用，宿主細(xì)胞是指最終表達(dá)編碼產(chǎn)物的細(xì)胞。因此，宿主細(xì)胞可為個(gè)體細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)物或作為有機(jī)體的部分的細(xì)胞。宿主細(xì)胞也可為胚、胚乳、精子或卵細(xì)胞或受精卵的一部分?？赏ㄟ^此項(xiàng)技術(shù)中已知的將重組載體DNA引入目標(biāo)宿主細(xì)胞中的標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⒈景l(fā)明的載體引入宿主細(xì)胞中。所述程序包括(但不限于)轉(zhuǎn)染、感染、轉(zhuǎn)化、正常攝取、電穿孔、基因槍和農(nóng)桿菌。此項(xiàng)技術(shù)中已知將外來基因引入植物中的方法，且所述方法可用于將本發(fā)明的基因構(gòu)筑體插入植物宿主中，所述方法包括生物和物理植物轉(zhuǎn)化方案。例如，參看Miki等人，1993，"ProcedureforIntroducingForeignDNAIntoPlants",In:MethodsinPlantMolecularBiologyandBiotechnology,Glick禾口Thompson編輯，CRCPress,Inc.,BocaRaton，第67-88頁。所選擇的方法隨宿主植物而變化，且包括化學(xué)物質(zhì)轉(zhuǎn)染方法，諸如磷酸鈣；微生物介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移，諸如農(nóng)桿菌(Horsch等人，Science227:1229-31，(1985));電穿孔；微注射；和基因槍轟擊。因此，本發(fā)明還提供植物或植物細(xì)胞，其包含本發(fā)明的載體。在一實(shí)施例中，所述植物為被子植物或裸子植物。在另一實(shí)施例中，所述植物是選自桉樹屬和其雜交物，和松屬?；蛘?，所述植物可選自北美短葉松(Pinusbanksiana)、愛琴海松(Pinusbrutia)、力口勒比松(Pinuscaribaea)、砂地松(Pinusclausa)、小干松(Pinuscontorta)、力口州豐公(Pinuscoulteri)、萌芽松(Pinusechinata)、阿富汗松(Pinuseldarica)、(Pinusellioti)、黑材松(Pinusjeffreyi)、糖松(Pinuslambertiana)、馬尾松(Pinusmassoniana)、山白豐公(Pinusmonticola)、歐洲黑松(Pinusnigra)、長(zhǎng)葉松(Pinuspalustrus)、海岸松(pinuspinaster)、西黃松(Pinusponderosa)、輻射松(Pinusradiata)、美力口紅松(Pinusresinosa)、岡U松(Pinusrigida)、晚松(Pinusser。tina)、北美喬松(Pinusstrobus)、棒子松(Pinussylvestris)、火炬松(Pinustaeda)、北美二針?biāo)?Pinusvirginiana)、太平洋銀冷杉(Abiesamabilis)、香脂冷杉(Abiesbalsamea)、科羅拉多冷杉(Abiesconcolor)、北美冷杉(Abiesgrandis)、高山7令杉(Abieslasiocarpa)、力口州鄉(xiāng)I7令杉(Abiesmagnifica)、4士麗7令杉(Abiesprocera)、美國扁柏(Chamaecyparislawsoniona)、黃扁柏(Chamaecyparisnootkatensis)、美國尖口十扁柏(Chamaecyparisthyoides)、雪松(Juniperusvirginiana)、歐洲落葉松(Larixdecidua)、北姜藩葉松(Larixlaricina)、日本落葉松(Larixleptolepis)、美國西部落葉松(Larixoccidentalism西比禾lj亞落葉松(Larixsiberica)、美國西部肖捕(Libocedrasdecurrens)、歐洲云杉(Piceaabies)、恩氏云杉(Piceaengel腿nni)、白云杉(Piceaglauca)、黑云杉(Piceamariana)、北美云杉(Piceapungens)、紅云杉(Picearubens)、西力口云杉(Piceasitchensis)、花旗松(Pseudotsugamenziesii)、巨杉(Sequoiagigantea)、北美紅杉(Sequoiasempervirens)、落習(xí)習(xí)杉(Taxodiumdistichum)、力口拿大鐵杉(Tsugacanadensis)、西咅卩鐵杉(Tsugaheterophylla)、高山鐵杉(Tsugamertensiana)、北美香柏(Thujaoccidentalis)、北美喬柏(Thujaplicata)、白按(Eucalyptusalba)、澄枝(Eucalyptusbancroftii)、葡萄桉(Eucalyptusbotryoides)、蘋果桉(Eucalyptusbridgesiana)、尾口十桉(Eucalyptuscalophylla)、赤桉(Eucalyptuscamaldulensis)、檸檬桉(Eucalyptuscitriodora)、舌甘口十桉(Eucalyptuscladocalyx)、南澳雪桉(Eucalyptuscoccifera)、Eucalyptuscurtisii、豐桉(Eucalyptusdalrympleana)、錄lj皮桉(Eucalyptusdeghipta)、大桉(Eucalyptusdelagatensis)、會(huì)I^K(Eucalyptusdiversicolor)、又卩恩、按(Eucalyptusdunnii)、纟工花枝(Eucalyptusficifolia)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、藍(lán)桉(Eucalyptusglobulus)、棒頭桉(Eucalyptusgomphocephala)、力口禾U桉(Eucalyptusgunnii)、Eucalyptushenryi、銀頂纖皮桉(Eucalyptuslaevopinea)、毛皮桉(Eucalyptusmacarthurii)、大咀桉(Eucalyptusmacrorhyncha)、斑皮桉(Eucalyptusmaculata)、赤桉(Eucalyptusmarginata)、Eucalyptusmegacarpa、蜜味桉(Eucalyptusmdliodora)、Eucalyptusnicholii、亮果桉(Eucalyptusnitens)、Eucalyptusnova-angelica、斜-葉桉(Eucalyptusobliqua)、西方桉(Eucalyptusoccidentalis)、Eucalyptusobtusiflora、奧里桉(Eucalyptusoreades)、雪桉(Eucalyptuspauciflora)、多枝桉(Eucalyptuspolybractea)、王按(Eucalyptusregnans)、樹月旨按(Eucalyptusresinifera)、大口十枝(Eucalyptusrobusta)、野桉(Eucalyptusmdis)、賴P口十桉(Eucalyptussaligna)、紅皮鐵桉(Eucalyptussideroxylon)、Eucalyptusstuartiana、細(xì)葉桉(Eucalyptustereticornis)、毛口十桉(Eucalyptustorelliana)、麗桉(Eucalyptusurnigera)、尾葉桉(Eucalyptusurophylla)、多枝桉(Eucalyptusviminalis)、Eucalyptusviridis、Eucalyptuswandoo禾口Eucalyptusyoumanni。具體說來,轉(zhuǎn)基因植物可為以下種類巨桉、輻射松、火炬松(PinustaedaL)(火炬松)、鉆天楊(Populusnigra)、三角楊(Populusdeltoides)、柚木(Tectonag醒dis)或馬占相思(Acaciamangium)。除植物的一般含義之外，預(yù)期術(shù)語"植物"還意謂植物的果實(shí)、種子、花、球果等。本發(fā)明的植物可為直接轉(zhuǎn)染體，表明諸如通過農(nóng)桿菌將載體直接引入植物中；或所述植物可為經(jīng)轉(zhuǎn)染植物的后代。第二代或繼代植物可通過有性繁殖(即，傳粉)產(chǎn)生，或可不通過其產(chǎn)生。而且，植物可為配子體(單倍體階段)或孢子體(二倍體階段)。本發(fā)明還提供一種控制植物繁殖發(fā)育的方法，其包含栽培包含本發(fā)明的載體的植物或種子。誘導(dǎo)或維持本發(fā)明的植物或種子生長(zhǎng)或萌發(fā)的適當(dāng)栽培具有種屬特異性，且在此項(xiàng)技術(shù)中的普通技術(shù)范圍內(nèi)。關(guān)于栽培的環(huán)境可為促進(jìn)植物或種子生長(zhǎng)或萌發(fā)的任何地方。而且，栽培也可包括以下步驟，諸如(但不限于)提供脅迫處理(stresstreatment)(例如，脫氮、熱休克、低溫、蔗糖脫除)，其可誘導(dǎo)胚發(fā)生(embyrogenesis)。本發(fā)明另外提供經(jīng)分離的調(diào)控元件，其與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合并能夠調(diào)控組織優(yōu)選或組織特異性表達(dá)。通過調(diào)控元件所賦予的調(diào)控程度可為完全的，表明在無轉(zhuǎn)錄因子的情況下轉(zhuǎn)錄不可檢測(cè)；或可為部分的，表明在轉(zhuǎn)錄因子存在下轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)。在一實(shí)施例中，使至少一種調(diào)控元件可操作地連接到異源啟動(dòng)子以提供復(fù)合啟動(dòng)子。所述復(fù)合啟動(dòng)子優(yōu)先或特異性在繁殖組織中表達(dá)。如本文所使用，異源啟動(dòng)子是含義相對(duì)于調(diào)控元件來說的短語。如果在自然環(huán)境中調(diào)控元件和啟動(dòng)子彼此無關(guān)，那么認(rèn)為啟動(dòng)子相對(duì)于調(diào)控元件為異源的。通常，啟動(dòng)子區(qū)內(nèi)調(diào)控元件的確切定向?qū)⒉粫?huì)影響其活性。而且，當(dāng)將調(diào)控元件插入到異源啟動(dòng)子區(qū)中時(shí)，其可正常起作用。因此，舉例來說，可將繁殖優(yōu)選的調(diào)控元件從其內(nèi)源啟動(dòng)子移除，且可將其插入到異源啟動(dòng)子區(qū)中以賦予繁殖特異性或優(yōu)先選擇性。異源啟動(dòng)子可為(例如)最小CaMV35S啟動(dòng)子。在植物細(xì)胞中直接表達(dá)且適于修飾成最小啟動(dòng)子的啟動(dòng)子包括花椰菜病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子(Jefferson等人，EMBOJ.,6:3901-07(1987));稻子肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(riceactinpromoter)(McElroy等人，PlantCell,2:163-71(1990));玉米泛素-l啟動(dòng)子(maizeubiquitin-1promoter)(Christensen等人，TransgenicResearch,5:213-18(1996));和胭脂堿合成酶啟動(dòng)子(Kononowics等人，PlantCell4:17-27(1992))。為制備本發(fā)明的核酸，由輻射松和火炬松使用多種限制性核酸內(nèi)切酶將基因組消化成不連續(xù)片段來制造基因組文庫?；蚪M文庫可類似地由獲得組織選擇性啟動(dòng)子所需的任何植物種類構(gòu)筑。根據(jù)CIontech有關(guān)其GenomeWalkerTM系統(tǒng)(Clontech,PaloAlto,CA)的使用所提供的程序，使接頭與每一所述基因組序列接合。隨后，使用接頭特異性引物和"基因特異性引物"以PCR擴(kuò)增啟動(dòng)子序列?；蛘?，這一PCR擴(kuò)增步驟視情況可由以引用方式并入本文的美國專利第5,565,340號(hào)和第5,759,822號(hào)中所述的方法進(jìn)行，以得到具有較長(zhǎng)長(zhǎng)度和最小背景的反應(yīng)產(chǎn)物。使用這一通用PCR擴(kuò)增方法，通過選擇"基因特異性引物"來管理本發(fā)明的啟動(dòng)子的鑒定和其作為組織選擇性啟動(dòng)子的鑒定?；蛱禺愋砸餅樵谒P(guān)注的組織中以高水平表達(dá)的任何經(jīng)轉(zhuǎn)錄的序列。在本發(fā)明中，基因特異性引物.為在繁殖組織中以高水平表達(dá)的mRNA的片段，或其與在繁殖組織中以高水平表達(dá)的mRNA互補(bǔ)。在一實(shí)施例中，基因特異性引物是通過已知在特定繁殖組織類型中特異性表達(dá)的其同源基因選擇。特別關(guān)注的基因?yàn)樵谔囟ǚ敝辰M織中以高水平表達(dá)的基因，其通常指示對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子的繁殖優(yōu)選活性。表達(dá)序列標(biāo)簽(EST)提供另一基因特異性引物來源。EST是存在于給定文庫中的對(duì)應(yīng)mRNA的cDNA片段。可電子搜尋任何植物EST數(shù)據(jù)庫以發(fā)現(xiàn)與已知在所需組織類型中特異性表達(dá)的基因的區(qū)段相同的EST("計(jì)算機(jī)篩選(insilicoscreening)")。因此，這些EST將提供基因特異性引物以在給定基因組文庫中擴(kuò)增對(duì)應(yīng)基因的啟動(dòng)子。經(jīng)擴(kuò)增的基因啟動(dòng)子無需來自獲得EST數(shù)據(jù)庫的相同物種。所需要的只是EST與所關(guān)注的基因啟動(dòng)子具有足夠的序列相似性以充當(dāng)所述基因的目標(biāo)區(qū)段PCR擴(kuò)增的引物。另一鑒別組織特異性啟動(dòng)子的方法是檢測(cè)在一種組織類型中表達(dá)而在另一種中不表達(dá)的mRNA(暗示其是從組織特異性啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄)。舉例來說，可在此基礎(chǔ)上通過消減雜交(subtractivehybridization)來辨識(shí)mRNA群體。一種此類適當(dāng)消減雜交技術(shù)為Clontech所述的PCR-Select。另外，可通過具有放射性標(biāo)記探針的植物組織薄片的原位雜交來確定組織特異性mRNA的分布。隨后，使用對(duì)特定組織類型放射性染色的探針以通過基因組文庫的Southern分析使用下文所述的方法檢測(cè)與mRNA有關(guān)的啟動(dòng)子。所有上文所提及的技術(shù)都需要由所關(guān)注的組織(在這一情況下為繁殖組織)制備mRNA文庫。cDNA文庫可由從木本植物種類分離的繁殖組織制得。舉例來說，可從輻射松和火炬松分離雄芽(malebud)和雌芽。簡(jiǎn)單說來，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)分離全部RNA，且隨后分離poly(A)RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以構(gòu)筑繁殖優(yōu)選組織的cDNA文庫?？墒褂肧trategenecDNA合成和GigapakIIGoldTM包裝試劑盒在XZAP-XR載體中構(gòu)筑cDNA文庫。接著，可使用基因特異性探針和識(shí)別啟動(dòng)子5'端序列的引物通過PCR從所述cDNA文庫中分離繁殖特異性啟動(dòng)子?？赏ㄟ^上述計(jì)算機(jī)方法或(如果己知)基于mRNA序列通過設(shè)計(jì)特異性探針獲得基因特異性探針。而且，可合成與所需目標(biāo)基因的5'UTR互補(bǔ)的引物。或者，可由所編碼的蛋白質(zhì)的部分氨基酸序列設(shè)計(jì)引物，即所謂的簡(jiǎn)并引物。分離所關(guān)注的啟動(dòng)子后，可使用各種方法表征其組織特異性表達(dá)模式和啟動(dòng)子強(qiáng)度。一種常用方法是使啟動(dòng)子可操作地連接到易于分析的報(bào)告基因。舉例來說，已使繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到編碼P-葡糖苷酸酶(GUS)的基因。Lacombe等人，PlantJ.23:663-76(2000)?？墒褂帽娝苤姆椒ㄖ频眠m當(dāng)?shù)谋磉_(dá)構(gòu)筑體。植物的轉(zhuǎn)化可通過包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化的多種適當(dāng)技術(shù)中的任一種實(shí)現(xiàn)，如美國專利第6，051，757號(hào)中所述。此項(xiàng)技術(shù)中已知轉(zhuǎn)化樹的其它方法，如美國專利第5,681,730號(hào)中所例示，所述專利公開加速的裸子植物體細(xì)胞胚粒子轉(zhuǎn)化方法。其它轉(zhuǎn)化方法包括微彈轟擊(Klein等人，Biotechnology6:559-63(1988)):電穿孔(Dhalluin等人，PlantCell4:1495-1505(1992));和聚乙二醇處理(Golovkin等人，PlantSci.90:41-52(1993))。此外，美國專利第6,187,994號(hào)中公開重組酶輔助的將表達(dá)構(gòu)筑體插入到植物基因組內(nèi)的特異性、選擇性位點(diǎn)中。上文所提及的所有專利和公開案都以引用的方式并入本文中?？赏ㄟ^任何適當(dāng)?shù)姆椒▽⒈景l(fā)明的DNA分子插入到植物基因組中。適當(dāng)?shù)闹参镛D(zhuǎn)化載體包括得自根癌農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒的載體，以及例如Herrera-Estrella等人，Nature303:209(1983)、BevanNucleicAcidsRes.12(22):8711-8721(1984)、Klee等人，Bio/Technology3(7):637-642(1985)和歐洲專利公開案120,516所公開的載體。除得自農(nóng)桿菌的Ti或誘根(root-inducing)(Ri)質(zhì)粒的植物轉(zhuǎn)化載體外，還可使用其它方法將本發(fā)明的DNA構(gòu)筑體插入到植物細(xì)胞中。所述方法可涉及(例如)使用脂質(zhì)體、電穿孔、增加游離DNA攝取的化學(xué)制品、通過微彈轟擊傳遞游離DNA和使用病毒或花粉進(jìn)行轉(zhuǎn)化。也可將DNA插入到葉綠體基因組中(Daniell等人，NatureBiotechnology16:345-348(1998))。當(dāng)獲得適量含有所關(guān)注的核酸的細(xì)胞(或原生質(zhì)體)時(shí)，使所述細(xì)胞(或原生質(zhì)體)再生成為整個(gè)植物。有關(guān)再生步驟的方法的選擇并不嚴(yán)格，且適當(dāng)方案可用于來自下述物質(zhì)的宿主豆科(Leguminosae)(紫花苜蓿、大豆、苜蓿等)、傘形科(Umbelliferae)(胡蘿卜、芹菜、防風(fēng)草)、十字花科(Cmciferae)(甘藍(lán)、蘿卜、卡諾拉(canola)/油菜籽等)、葫戸科(Cucurbitaceae)(甜瓜和黃瓜)、禾本科(Gramineae)(小麥、大麥、稻子、玉米等)、茄科(Solanaceae)(馬鈴薯、煙草、蕃茄、胡椒)、各種繁殖作物(諸如向日葵)和堅(jiān)果樹(nut-bearingtree)(諸如杏樹、腰果樹、胡桃和美洲山核桃樹(pecan))。例如，參看Ammirato等人，(1984)HandbookofPlantCellCulture-CropSpecies.MacmillanPubl.Co.;Fromm，M.,(1990)UCLASymposiumonMolecularStrategiesforCropImprovement,1990年4月16-22曰，Keystone,CO.;Vasil等人，Bio/Technology8:429-434(1990);Vasil等人，Bio/Technology10:667-674(1992);Hayashimoto等人，PlantPhysiol.93:857-863(1990);禾QDatta等人，(1990)。包含啟動(dòng)子和報(bào)告基因的載體包括選擇經(jīng)所述載體成功轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞的機(jī)制，其可為(例如)卡那霉素抗性。轉(zhuǎn)化體中GUS基因的存在可使用GUS特異性PCR引物(Clontech,PaloAlto)通過PCR方法確認(rèn)。經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞后代中卡那霉素抗性的隔離可與Southern分析組合使用以測(cè)定停泊己穩(wěn)定插入的載體的位點(diǎn)數(shù)。隨后，由報(bào)告基因表達(dá)的數(shù)量推斷啟動(dòng)子表達(dá)的時(shí)間和空間模式，如Jefferson等人，EMBOJ.6:3卯1-07(1987)中所述。一般說來，GUS的表達(dá)是以組織化學(xué)方法在植物組織薄片中測(cè)定，所述植物組織薄片首先在90%丙酮中且隨后在含有GUS底物5-溴-4-氯-3-吲哚基-(3-d-葡糖醛酸(X-Gluc)的緩沖溶液中固定。GUS表達(dá)產(chǎn)物的存在是通過與X-Gluc的比色反應(yīng)指示。舉例來說，可通過特異性結(jié)合繁殖組織中的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件的存在使繁殖特異性表達(dá)能夠進(jìn)行。繁殖特異性調(diào)控元件與繁殖優(yōu)選轉(zhuǎn)錄因子之間的相互作用視調(diào)控元件堿基對(duì)分組與轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基之間的對(duì)準(zhǔn)而定。同樣，例如，可通過特異性結(jié)合絨氈層組織中的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控元件的存在使絨氈層特異性表達(dá)能夠進(jìn)行?？梢云渌鼔A基對(duì)取代不與所結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子相互作用的堿基對(duì)，同時(shí)保持調(diào)控元件特異性結(jié)合組織特異性轉(zhuǎn)錄因子的全部能力。將啟動(dòng)子鑒定為組織優(yōu)選或組織特異性啟動(dòng)子后，可使用各種方法鑒別和表征影響組織優(yōu)選或組織特異性啟動(dòng)子活性的調(diào)控元件。在一種方法中，在5'端順次截?cái)鄦?dòng)子區(qū)，并使一連串經(jīng)截?cái)嗟膯?dòng)子各自可操作地連接到報(bào)告基因。當(dāng)缺失調(diào)控元件時(shí)，通過報(bào)告基因組織特異性表達(dá)的損失來推斷對(duì)啟動(dòng)子活性的影響。另外，可將假定的調(diào)控元件插入到含有諸如CaMV35S最小啟動(dòng)子的最小啟動(dòng)子(Keller等人，PlantMol.Biol.26:747-56)的表達(dá)構(gòu)筑體中，以確定所述假定調(diào)控元件是否賦予組織特異性表達(dá)。最小啟動(dòng)子僅含有啟動(dòng)子活性絕對(duì)需要的元件，諸如RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)。闡明假定調(diào)控元件的其它實(shí)例是由有關(guān)同等地調(diào)控編碼1-苯基-丙氨酸脫氨酶(PAL)和4-香豆素輔酶A接合酶(4CL)的基因轉(zhuǎn)錄的組織特異性調(diào)控元件的研究提供。Hatton等人，PlantJ.7:859-76(1995);Leyva等人，PlantCell4:263-71(1992);Hauffe等人，PlantJ.4:235-53(1993);Neustaedter等人，PlantJ.18:77-88(1999),所有文獻(xiàn)都以引用的方式并入本文中。本發(fā)欲^動(dòng)7游^/^絲變^,或/f虔本發(fā)明啟動(dòng)子的其它變異體或片段為具有散布于整個(gè)序列中的修飾的變異體或片段。如本文所使用，功能性變異體或片段為具有與參考核酸具有至少約70%同一性的核酸序列但仍使編碼產(chǎn)物能夠組織特異性表達(dá)的核酸。功能性變異體的組織特異性或優(yōu)選必須針對(duì)與參考核酸相同的組織。然而，即使所述功能性變異體不與參考核酸一樣具有優(yōu)先選擇性或特異性，仍認(rèn)為所述變異體為如本文所使用的功能性變異體。在一實(shí)施例中，功能性變異體或片段的序列與參考核酸具有至少約75%同一性。在其它實(shí)施例中，功能性變異體或片段的序列與參考核酸具有至少約80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%同一性。可通過從5'端相繼缺失殘基或從3'端缺失5'UTR序列而進(jìn)行能夠產(chǎn)生功能性變異體的修飾。或者，可對(duì)內(nèi)部殘基進(jìn)行修飾。不影響啟動(dòng)子區(qū)功能的修飾很可能為不影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的修飾。本發(fā)明所涵蓋的修飾還包括以本發(fā)明啟動(dòng)子等位基因變異體(allelicvariant)形式天然存在的修飾。劍造本發(fā)敏游提虔游方茲可通過使用眾所周知的合成技術(shù)、標(biāo)準(zhǔn)重組方法、純化技術(shù)或其組合獲得本發(fā)明的核酸。舉例來說，可使用固相亞磷酰胺三酯方法(Beaucage等人，Tetra.Letts.22:1859-1862(1981))、自動(dòng)化合成器(VanDevanter等人，NucleicAcidsRes.12:6159-6168(1984))或美國專利第4,458,066號(hào)的固體載體方法通過直接化學(xué)合成來制備本發(fā)明的經(jīng)分離聚核苷酸?；瘜W(xué)合成一般產(chǎn)生單鏈寡核苷酸，其可通過與互補(bǔ)序列雜交或通過使用單鏈作為模板進(jìn)行的聚合反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成雙鏈寡核苷酸。同樣，可通過接合較短序列獲得較長(zhǎng)序列?；蛘撸墒褂孟嗷ヒl(fā)的寡核苷酸通過重組方法獲得本發(fā)明的核酸。例如，參看Ausubel等人，(編車葺)，CurrentProtocolsinMolecularBiology(JohnWiley&Sons,Inc.1990)。同樣，參看Wosnick等人，Gene60:115(1987);和Ausubel等人，(編輯)，ShortProtocolsinMolecularBiology,第3版，(JohnWiley&Sons,Inc.1995)。己確立的使用聚合酶鏈反應(yīng)的技術(shù)提供合成至少2千堿基長(zhǎng)的聚核苷酸的能力。Adang等人，PlantMol.Biol.21:1131(1993);Bambot等人，PCRMethodsandApplications2:266(1993);Dillon等人，"UseofthePolymeraseChainReactionfortheRapidConstructionofSyntheticGenes,"inMethodsInMolecularBiology,第15巻PCRProtocols:CurrentMethodsAndApplications,White(編輯)，第263-268頁，(HumanaPress,Inc.1993);Holowachuk等人，PCRMethodsAppl.4:299(1995)。伊財(cái)發(fā)鐘凝膽方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明的核酸可用于變化植物的特性。可使核酸可操作地連接到所關(guān)注的基因以增加繁殖組織中所見的分子的含量。另外，所關(guān)注的基因可抑制繁殖發(fā)育，由此賦予植物不育性。所述經(jīng)操縱的表達(dá)的一個(gè)主要目標(biāo)為繁殖發(fā)育。出于上述原因，通過基因去除所實(shí)現(xiàn)對(duì)繁殖發(fā)育的調(diào)控相當(dāng)值得關(guān)注。舉例來說，已在絨氈層優(yōu)選啟動(dòng)子的控制下使用細(xì)胞毒素baraase分子來調(diào)控繁殖發(fā)育。歐洲專利公開案344,029。舉例來說，可使用具有降低的RNA酶活性的突變體barnase基因調(diào)控繁殖發(fā)育。在一實(shí)施例中，可使突變體barnase基因可操作地連接到啟動(dòng)子，從而使barnase基因的表達(dá)可對(duì)營養(yǎng)組織造成極低損害或無損害，而突變體barnase可為繁殖去除提供適當(dāng)?shù)腞NA酶活性。參考下列實(shí)例由此一般描述將更易于理解本發(fā)明，所述實(shí)例是借助說明提供且不打算限制本發(fā)明。實(shí)例實(shí)例1分離繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可從基因組文庫和cDNA文庫分離繁殖優(yōu)選植物啟動(dòng)子。使用繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子序列作為探針，可分離假定的繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子序列。舉例來說，可將來自輻射松的AGAMOUS(AG)啟動(dòng)子用作鑒別其它繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子序列的探針。舉例來說，基因組DNA是從火炬松的雄芽分離的。分離雄芽DNA后，將輻射松AG1序列用作篩選經(jīng)分離的雄芽基因組DNA的探針。使用基于PCR的篩選方法，分離出兩種假定的火炬松AG啟動(dòng)子序列，稱為L(zhǎng)PAG1(SEQIDNO:1)禾nLPAG2(SEQIDNO:2)。每一經(jīng)克隆的LPAG啟動(dòng)子都為約1400bp，包括600bp5'未翻譯區(qū)，其含有139bpLPAG1或LPAG2基因的第一個(gè)內(nèi)含子。使用"基因組步行(GenomeWalker)"試劑盒(Clontech，PaloAlto,CA)來克隆啟動(dòng)子。這是一種基于PCR的方法，其需要構(gòu)筑四種PCR引物，其中兩種必須具有基因特異性。一般將基因特異性引物設(shè)計(jì)到基因的5'UTR內(nèi)。擴(kuò)增片段且隨后將其克隆到GUS報(bào)告基因之前具T尾(T-tailed)的載體中。實(shí)例2確定啟動(dòng)子組織特異性的方法如實(shí)例1所述鑒別并克隆啟動(dòng)子后，使啟動(dòng)子可操作地連接到報(bào)告基因以確定啟動(dòng)子具有活性的組織的類型。出于此目的，通過電穿孔將含有本發(fā)明啟動(dòng)子的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌中。簡(jiǎn)單說來，將40pl稀AgL-1感受態(tài)細(xì)胞放置到冰上，并使其與約10ng含有啟動(dòng)子序列的pART27載體接觸。在以下參數(shù)下進(jìn)行電穿孔電阻=129歐姆充電電壓=1.44kV電場(chǎng)強(qiáng)度=14.4kV/cm脈沖持續(xù)時(shí)間=5.0ms。電穿孔后，加入400^YEP液體培養(yǎng)基，并在室溫下使細(xì)胞恢復(fù)1小時(shí)。隨后，在6000rpm下使細(xì)胞離心3min，并將其再懸浮到約50piYEP中。將細(xì)胞樣本展布到Y(jié)EPKan50/Rif50板的表面上，用石蠟?zāi)?parafilm)密封，并在29°C下培育2天供菌落生長(zhǎng)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉組織轉(zhuǎn)化，用所關(guān)注的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)植物(Burow等人，PlantMol.Biol.Rep.8:124-139,1990)。隨后，分析經(jīng)成功轉(zhuǎn)化的植物中可操作地連接的報(bào)告基因的表達(dá)。將葉、桿、根和繁殖區(qū)浸到染色溶液(50mMNaPO4pH7.2、0.5%TritonX-IOO、lmMX-葡糖苷酸、放線菌酮鹽(cycloheximidesalt)(Ducheffa))中。施加真空兩次歷時(shí)5min以使染色溶液滲透組織。隨后，在37'C下震蕩組織整夜以使顏色發(fā)展。在三或四個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)檢査組織以檢查染色發(fā)展，且如果樣本展示出早期的發(fā)展，那么用70%乙醇使一片組織脫去染色。如表1所示，GUS定位證實(shí)所公開的經(jīng)分離的核苷酸序列使報(bào)告基因優(yōu)先在諸如絨氈層的繁殖組織中表達(dá)。如實(shí)例6所示，當(dāng)腋芽(axilliarybud)的營養(yǎng)生長(zhǎng)受到抑制且營養(yǎng)芽和繁殖芽的轉(zhuǎn)變極快時(shí)，在初生花序(pnmaryinflorescence)存在下，預(yù)期繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子在營養(yǎng)莖尖(vegetativetip)中表達(dá)。表l:植株原位法(&p/a/ito)GUS繁殖表達(dá)<table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>如下文更詳細(xì)地描述，"PRMC2"啟動(dòng)子構(gòu)筑體包含可操作地連接到barnase突變體的來自輻射松的繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子，尤其PrMC2.400-l禾nPrMC2.400-3的H102E。在經(jīng)PrMC2.400啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的煙草花藥中尚未觀察到GUS表達(dá)。因此，克隆同框(in-frame)PrMC2.400啟動(dòng)子以供去除構(gòu)筑體中使用并將其用于上述實(shí)驗(yàn)中。實(shí)例3使用繁殖特異性啟動(dòng)子的方法發(fā)現(xiàn)具有適當(dāng)組織特異性和發(fā)育模式表達(dá)的啟動(dòng)子后，可使用這一啟動(dòng)子來調(diào)控轉(zhuǎn)基因植物中的所需特性。在--實(shí)施例中，將絨氈層優(yōu)選的啟動(dòng)子用于調(diào)控植物的繁殖發(fā)育。在本實(shí)例中，使本發(fā)明的絨氈層優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到編碼細(xì)胞毒素蛋白質(zhì)的基因。舉例來說，可使絨氈層優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到編碼barnase的基因。繁殖優(yōu)選組織(諸如絨氈層)中barnase的表達(dá)可導(dǎo)致花粉去除。歐洲專利公開案344,1990。為構(gòu)筑具有已去除的雄性繁殖發(fā)育的轉(zhuǎn)基因植物，使barnasecDNA片段以適當(dāng)方向可操作地連接到本發(fā)明的繁殖特異性啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶3'終止子。將整個(gè)構(gòu)筑體作為限制性片段插入到二元載體pBI101.1(Clontech，PaloAlto,CA)中。對(duì)于煙草或白楊轉(zhuǎn)化來說，分別使載體電穿孔到根癌農(nóng)桿菌菌株LBA4404或C58pMP90。一般參看No等人，PlantScience160:77-86(2000)。根據(jù)Leple等人，PlantCellRep.11:137-141(1992)的程序，將如上文所述的煙草葉圓片或白楊桿斷片浸入到如上文所述的農(nóng)桿菌培養(yǎng)物中。測(cè)試抗卡那霉素轉(zhuǎn)化體的活性，通過Southern分析來測(cè)定轉(zhuǎn)基因拷貝的數(shù)量，且使適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)化體生根并將其轉(zhuǎn)移到溫室中。實(shí)例4制造并選擇已減弱的細(xì)胞毒素酶的方法萬扁履￡7_G浙臉廳ef70(5S游#威通過隨機(jī)PCR突變發(fā)生獲得barnase突變體F106S和E73G。使PrAG啟動(dòng)子可操作地連接到野生型barnase編碼區(qū)，且進(jìn)行三次PCR反應(yīng)，從而以barnase翻譯密碼子置換PrAG翻譯起始密碼子ATG。在第一次PCR中，使5'引物PrAGKpn(5'-GGTTTGGTACCTAACTTGCC-3'，SEQIDNO:27)與PrAG啟動(dòng)子的-199位至-179位關(guān)于其翻譯起始ATG位置退火，而3'引物PrAG-7:(5'-GTGTTGATAACCTGTGCCATGATTTGTACACAAAATTTCCG-3'，SEQIDNO:28)與包括翻譯起始ATG的-21至+3位退火。PrAG-7引物具有與barnase編碼區(qū)5'互補(bǔ)的額外18個(gè)堿基。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVCZ3DNA)、200dNTP、1.5mMMgCl2和0.5^1TaqDNA聚合酶(PerkinElmer)。在95°C下使DNA變性20秒，在55i:下使其再退火30秒，并在72'C下培育60秒。將這一PCR循環(huán)重復(fù)25次。PCR后，凝膠純化220bp產(chǎn)物。在第二次PCR中，使5'引物PrAG-8:29)與barnase編碼區(qū)的5'退火，且這一引物具有與PrAG啟動(dòng)子3'互補(bǔ)的21個(gè)額外堿基。使3'引物3Barn(GGTTCTCGAGTTTCACGTTAACTGGCTAG，SEQIDNO:30)與barnaseDNA的3'退火，并攜帶供克隆的SacI位點(diǎn)。PCR混合物含有50ng模板DNA(pWVR14)、200dNTP、1.5mMMgCU0.5jiilTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)。在95。C下使DNA變性20秒，在55'C下使其再退火30秒，并在72°C下培育60秒。將這一PCR循環(huán)重復(fù)25次。PCR后，凝膠純化462bp產(chǎn)物。在第三次PCR中，5'引物為PrAGKpn且3'引物為3Barn，而DNA模板為等量的第一次PCR與第二次PCR產(chǎn)物(各自約40ng)的混合物。第三次PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物為640bp，其為PrAG的3'與barnase編碼區(qū)之間的融合。第三次PCR后，用KpnI和SacI消化PCR片段，并使其與已攜帶PrAG啟動(dòng)子的質(zhì)粒(pUC19)接合，從而在接合后通過全長(zhǎng)PrAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)barnase。通過電穿孔將接合混合物引入大腸桿菌中，并使經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌落在含有75pg/ml氨比西林的LB瓊脂上生長(zhǎng)。從兩個(gè)菌落中提取質(zhì)粒，且以限制性酶消化來確認(rèn)PrAG::baraase插入物的存在。對(duì)質(zhì)粒DNA測(cè)序以確認(rèn)其在barnase編碼區(qū)中都具有突變。已認(rèn)識(shí)到，在LB培養(yǎng)板上生長(zhǎng)的所有菌落都含有突變體形式的baraase，且大部分突變都已廢除baraase活性。然而，如LB培養(yǎng)板上較小尺寸的菌落所指示，部分突變會(huì)降低bamase的活性。選擇約100個(gè)菌落，并將其培育到含有75pg/ml氨比西林的1mlLB液體中。在37'C下培養(yǎng)整夜后，比較培養(yǎng)物中的細(xì)胞密度，且選擇5份具有顯著較低細(xì)胞密度的培養(yǎng)物。低細(xì)胞密度指示barnase具有活性，但具有小得多的毒性。從5份大腸桿菌培養(yǎng)物中純化質(zhì)粒，并將其再引入到大腸桿菌中以確認(rèn)所引入的質(zhì)粒確實(shí)在LB瓊脂板上產(chǎn)生較小尺寸的菌落，表明質(zhì)粒具有減弱的baraase活性。重復(fù)將質(zhì)粒再引入到大腸桿菌中三次。對(duì)已確認(rèn)的質(zhì)粒測(cè)序，且結(jié)果表明，從大腸桿菌培養(yǎng)物提取的質(zhì)粒29-S在barnase編碼區(qū)73位處谷氨酸的密碼子中含有單核苷酸取代(A—G),導(dǎo)致谷氨酸變?yōu)楦拾彼?。這一barnase突變體稱為barnaseE73G(SEQIDNO.11)。從大腸桿菌培養(yǎng)物提取的質(zhì)粒43-S在barnase編碼區(qū)106位處苯丙氨酸的密碼子中含有單核苷酸取代(T—C)，導(dǎo)致苯丙氨酸變?yōu)榻z氨酸。這一barnase突變體稱為barnaseF106S(SEQIDNO.12)?！曛?jǐn)嫌f7船力W為分析F106S毒性，如上文實(shí)例2所述，用具有PrAG啟動(dòng)子的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化煙草植物，所述啟動(dòng)子可操作地連接到編碼突變體barnaseF106S的基因。由于突變體barnaseF106S的表達(dá)是致死的，所以并無可見的煙草轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生。這些結(jié)果表明，需要例如可誘導(dǎo)雄性不育性而對(duì)營養(yǎng)生長(zhǎng)無不利影響的己減弱的barnase。5ama^￡73G分橋基于大腸桿菌中毒性篩選的結(jié)果，選擇barnase突變體E73G用于繁殖去除。大腸桿菌中barnaseE73G的表達(dá)導(dǎo)致低毒性水平。具體說來，barnaseE73G抑制大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中和LB固體板上的生長(zhǎng)。盡管不能從這一生物篩選獲得barnase突變體降低的RNA酶活性(毒性)的值，但這些結(jié)果仍表明E73G具有減弱的RNA酶活性。有關(guān)barnaseE73G中barnase活性減弱的另一證據(jù)可見于barnaseE73G與F106S之間的比較研究。在比較中，barnaseF106S引起比barnaseE73G顯著高的大腸桿菌毒性。這些結(jié)果表明，barnaseF106S具有比barnaseE73G高的RNA酶活性?；谟嘘P(guān)相關(guān)酶barnase中的對(duì)應(yīng)突變具有約2%天然酶活性的報(bào)告，選擇barnaseH102E突變。Yakovlev等人，F(xiàn)EBSLett.354:305-306(1994)。如下文實(shí)例5中所述，barnaseH102E具有減弱的活性。在這一突變體中，組氨酸102的密碼子經(jīng)谷氨酸密碼子取代。Barnase區(qū)段的定向突變發(fā)生利用包含野生型barnase編碼區(qū)的現(xiàn)存質(zhì)粒pWVR14。Barnase的這一先驗(yàn)克隆使用引物BAR5NCO(5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC-3',SEQIDNO:31)和BAR3MFE(5'-AAAGTGCAATTGACCGATCAGAGTTTGAAG匿3'，SEQIDNO:32)以擴(kuò)增質(zhì)粒pMT416的barnase盒的整個(gè)編碼區(qū)。Hartley,R.W.J.Mol.Biol.202:913-915(1988)。用Ncol消化經(jīng)擴(kuò)增的片段，并將其克隆到已制備的具有一個(gè)NcoI端和一個(gè)平端的載體中。所得質(zhì)粒pWVR14將barnase區(qū)段放到啟動(dòng)子和SEPALLATA1基因(SEPl，以前稱為AGL2)5'-UTR的相鄰處，且突變發(fā)生程序利用所述啟動(dòng)子序列。使用引物AGL2PB(5'-TTTCACAACCTCCACACACTT-3'，SEQIDNO:33)禾口BARH2E(5'-GTAAAGGTCTGATACTCGTCCGTTG-3'，SEQIDNO:34)來擴(kuò)增編碼區(qū)的5'部分和鄰接啟動(dòng)子區(qū)段。使用引物BAR5NCO和BAR3MFE擴(kuò)增野生型barnase盒。擴(kuò)增后，使用凝膠電泳和QIAEX凝膠純化試劑盒(QIAGEN)來純化分離片段和引物與PCR試齊U。使約100ng每一片段與50|il反應(yīng)物中的lxPerkinElmerTaq緩沖液、1.6mMMgCl2、0.10mM各dNTP和0.5piPerkinElmerTaqDNA聚合酶組合，且重復(fù)使混合物在95。C下變性、在50'C下再退火和在72'C下培育(5個(gè)循環(huán))，以便使包含一部分SEP1啟動(dòng)子和完整barnase編碼區(qū)的0.75kb片段延長(zhǎng)。將10延長(zhǎng)反應(yīng)物加入到50含有20pmol引物AGL2PB和BAR3MFE的每一者、lxPCR緩沖液、1.6mMMgCl2、0.250mM各dNTP和0.5^1TaqDNA聚合酶中，并且再執(zhí)行七次循環(huán)，從而進(jìn)一步擴(kuò)增所述0.75kb的片段。用Ncol消化片段，并對(duì)barnase區(qū)段進(jìn)行凝膠純化，且用Ncol和平端將其接合到載體中。通過序列分析來驗(yàn)證正確的突變。在諸如組裝pWVR220的后續(xù)工作中，使用引物BAR5NCO和BAR3SAC(5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'，SEQIDNO:35)擴(kuò)增全長(zhǎng)barnaseH102E片段，用Ncol和Sacl消化并加以純化。由于需要在翻譯起始密碼子處需要具有Ncol位點(diǎn)，所以引物BAR5NCO中包括ATG后緊接著的額外丙氨酸密碼子。這導(dǎo)致實(shí)際最終編碼區(qū)中密碼子103處His成為Glu的突變?；谟嘘P(guān)相關(guān)酶barnase中的對(duì)應(yīng)突變具有約20%天然酶活性的報(bào)告，選擇barnaseK27A突變。Yakovlev等人，F(xiàn)EBSLett.354:305-306(1994)。另一報(bào)告表明，barnaseK27A突變體相比天然酶具有降低的活性。Mossakowska等人，Biochemistry28:3843-3850(1989)。變化barnase編碼區(qū)，從而使賴氨酸27的密碼子經(jīng)丙氨酸密碼子取代。使用PCR同日寸實(shí)現(xiàn)對(duì)barnase區(qū)段的擴(kuò)增和定向突變。使用引物BAR5NCO(5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC匿3'，SEQIDNO:31)和BARK27AR(5'-TGCTTCTGATGCTGTAATGTAATTATCAG-3'，SEQIDNO:36)來擴(kuò)增編碼區(qū)的5'部分，且使用引物BARK27AF(5'-AATTACATTACAGCATCAGAAGCACAAG-3'，SEQIDNO:37)禾卩BAR3SAC(5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'，SEQIDNO:35)來擴(kuò)增質(zhì)粒pMT416barnase盒編碼區(qū)的3'部分。擴(kuò)增后，純化分離所述片段與引物和PCR試劑，且隨后將其組合。使約100ng每一片段與25^反應(yīng)物中的lxStmtagene高鹽緩沖液、0.175mM各dNTP和0.25piTaqPlusLong組合，且重復(fù)使混合物在95。C下變性、在50'C下再退火和在72'C下培育(5個(gè)循環(huán))，以便使全部編碼區(qū)延長(zhǎng)。將延長(zhǎng)反應(yīng)物加入到75jal含有20pmol引物BAR5NCO和BAR3SAC的每一者、lxStratagene高鹽緩沖液、0.175mM各dNTP和0.75(ilTaqPlusLong中，并且再執(zhí)行十五次循環(huán)，從而進(jìn)一步擴(kuò)增全長(zhǎng)baraaseK27A片段。用Ncol和Sacl消化所得全長(zhǎng)片段，并加以純化。經(jīng)突變的編碼序列陳述在SEQIDNO:8中。如上所述，引物BAR5NCO中ATG后緊接著包括額外丙氨酸密碼子。這導(dǎo)致實(shí)際最終編碼區(qū)中密碼子28處Lys成為AIa的突變。實(shí)例5大腸桿菌中barnase突變體的毒性分析通過PCR在PrAG啟動(dòng)子的3'端融合barnaseDNA，且將所得PCR片段克隆到pUC19中，并將其引入到大腸桿菌中。在37攝氏度下在補(bǔ)充有80叫/ml氨比西林的LB瓊脂上生長(zhǎng)整夜(約16小時(shí))后，選擇單個(gè)菌落，并在1ml含有氨比西林的LB液體中培育。培育整夜后，選擇正緩慢生長(zhǎng)的大腸桿菌培養(yǎng)物，并提取質(zhì)粒。將經(jīng)純化的質(zhì)粒再引入到大腸桿菌中，且在37攝氏度下培育整夜后在LB瓊脂上獲得單個(gè)菌落。測(cè)量菌落直徑，并將其與對(duì)照物(由PrAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的具有barnaseH102Y插入物的pUC19)相比較。具有barnase突變體的單個(gè)菌落的直徑為從將質(zhì)粒引入大腸桿菌中的步驟起重復(fù)的三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。通過將所述單個(gè)菌落的直徑與對(duì)照菌落的直徑相比較來確定bamase突變體的毒性。如下表2所示，大直徑菌落指示無毒性，而小直徑菌落表明強(qiáng)毒性。表2:大腸桿菌中Barnase突變體的毒性<table>tableseeoriginaldocumentpage47</column></row><table>*BarnaseH102Y不具有所報(bào)告的RNA酶生物活性。實(shí)例6ALAPG啟動(dòng)子的組織優(yōu)選表達(dá)通過實(shí)例1所述的程序鑒別和克隆啟動(dòng)子后，使啟動(dòng)子可操作地連接到報(bào)告基因以確定啟動(dòng)子具有活性的那些組織類型。為確定LPAG1和LPAG2啟動(dòng)子的組織特異性，如實(shí)例2所述，使每一啟動(dòng)子都可操作地連接到GUS報(bào)告基因，并將所得構(gòu)筑體引入煙草植物中。箏^"浙在層Gt/S分析簡(jiǎn)單說來，為分析煙草中LPGA1啟動(dòng)子活性的GUS表達(dá)，從高度為約2到5mm的未成熟、幼花中移除萼片和花瓣。使用刀片垂直切下中間的心皮，且在37'C下對(duì)所得一半心皮(連有2-3片幼雄蕊)染色歷時(shí)16小時(shí)以用于GUS活性分析。對(duì)來自每一轉(zhuǎn)基因株的三朵單獨(dú)花染色，且在70%乙醇中且且隨后在95%乙醇中進(jìn)行脫染色。妨〃/"游GfAS分橋分析與花相鄰的幼葉的GUS表達(dá)。對(duì)于每一轉(zhuǎn)基因株來說，將三片幼葉切成小正方形(9mm2)，并如上文關(guān)于萼片和花瓣所述，在37。C下染色16小時(shí)以供GUS活性分析，且隨后脫染色。,養(yǎng)莖關(guān)游Gra分界從處于兩個(gè)不同生長(zhǎng)階段的個(gè)別植物收集幼莖尖。第一生長(zhǎng)階段的分析涵蓋收集煙草植物的莖尖，其中初生頂生花序(primaryterminalinflorescence)上30%的花已開放。在這一第一生長(zhǎng)階段分析具有初生頂生花序的莖尖。具有初生頂生花序的莖尖表示從初生桿與初生葉的橫斷面長(zhǎng)出的腋生莖尖(axillaryshoottip)。具有初生頂生花序的每一莖尖為約10至15mm長(zhǎng)。分析第二生長(zhǎng)階段涵蓋收集移除初生頂生花序6天后的莖尖。這些莖尖不具有初生頂生花序，且表示從初生桿與初生葉的橫斷面長(zhǎng)出的腋生莖尖。所收集的每一無初生頂生花序的莖尖都為約25至40mm長(zhǎng)。移除莖尖周圍大部分的幼葉，且僅使一到三片葉子與莖尖相連。從中間垂直切下分開的莖尖，且在37'C下對(duì)所得一半莖尖(仍連有1-3片葉)染色歷時(shí)16小時(shí)以供GUS活性分析。從每一轉(zhuǎn)基因株收集三個(gè)莖尖，并加以染色。如下表3所示，LPAG1啟動(dòng)子優(yōu)先在雄蕊和心皮(繁殖組織)中具有活性且在葉(營養(yǎng)組織)中未展示活性。表3:轉(zhuǎn)基因煙草中LPAG1活性的GUS表達(dá)分析<table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>如上表3所示，移除初生頂生花序后，莖尖中LPAG1啟動(dòng)子活性降低。在初生花序存在下，腋芽的營養(yǎng)生長(zhǎng)受抑制，且營養(yǎng)芽極快轉(zhuǎn)變?yōu)榉敝逞?。在一些情況下，當(dāng)腋生枝僅10mm長(zhǎng)時(shí)，出現(xiàn)花芽。在煙草的繁殖生長(zhǎng)期間，養(yǎng)分獲取和激素產(chǎn)生會(huì)誘導(dǎo)腋生枝中花基因的表達(dá)。移除初生頂生花序使煙草植物恢復(fù)營養(yǎng)生長(zhǎng)，且腋芽的生長(zhǎng)不再經(jīng)歷由頂生花強(qiáng)加的抑制。己觀察到，移除初生頂生花序后，當(dāng)腋生枝為40mm長(zhǎng)時(shí)，腋芽生長(zhǎng)加快，且不存在花芽。因此，在頂生花存在下，腋生枝的分生組織已轉(zhuǎn)變成花分生組織，或中途朝向花分生組織轉(zhuǎn)變，其中諸如LEAFY和AGAMOUS的花基因的表達(dá)開啟且LPAG1啟動(dòng)子也開啟。移除頂生花使腋芽恢復(fù)營養(yǎng)生長(zhǎng)，且腋生枝分生組織中花基因的表達(dá)關(guān)閉，且因此LPAG1啟動(dòng)子活性也可能關(guān)閉。實(shí)例6BLPAGl啟動(dòng)子的缺失分析可使用啟動(dòng)子缺失分析來確定啟動(dòng)子序列內(nèi)的最小啟動(dòng)子和調(diào)控元件。使每一啟動(dòng)子缺失可操作地連接到報(bào)告基因，并分析啟動(dòng)子-報(bào)告基因構(gòu)筑體的表達(dá)概況。舉例來說，連續(xù)缺失LPAG1啟動(dòng)子(SEQIDNO.1)。簡(jiǎn)單說來，從LPAG1啟動(dòng)子序列的5'端得到5個(gè)連續(xù)缺失。每一連續(xù)缺失都缺失約160bp,共800bp缺失。以下為有關(guān)LPAG1啟動(dòng)子缺失的初步結(jié)果的摘要。將5個(gè)連續(xù)缺失構(gòu)筑體(稱為L(zhǎng)PAGldl-LPAGld5)引入到松樹和煙草中。由于缺失是從LPAG1啟動(dòng)子序列的5'端得到，估計(jì)LPAGld5缺失構(gòu)筑體將切開LPAG1基因的5'未翻譯區(qū)，且因此LPAG1啟動(dòng)子序列將不在LPAGld5構(gòu)筑體中。用啟動(dòng)子缺失構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化松樹和煙草植物后，如實(shí)例2所述，分析經(jīng)轉(zhuǎn)化胼胝體的LPAG1啟動(dòng)子活性。如實(shí)例5所述確定GUS表達(dá)分析。LPAG1啟動(dòng)子缺失實(shí)驗(yàn)的結(jié)果概括于下表4中。表4:LPAG1的啟動(dòng)子缺失分析<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>基于表4所示的GUS表達(dá)概況，結(jié)果清楚地表明存在于LPAGld3中但不存在于LPAGld4中的核苷酸序列(約150bp)對(duì)于在煙草花雄蕊和心皮中具活性的LPAGl啟動(dòng)子至關(guān)重要，但由于LPAGld4在胼胝體中仍具有類似GUS活性，所以相同序列對(duì)于在松樹胼胝體中具活性的LPAGl啟動(dòng)子不太重要，如GUS染色和MUG分析所示。實(shí)例7使用具有LPAGl和PrAG啟動(dòng)子的構(gòu)筑體去除松樹雄球花和雌球花的方法基于實(shí)例6表4所示的結(jié)果，可將LPAG1和PrAG啟動(dòng)子和其啟動(dòng)子缺失用于去除松樹中的雄球花和雌球花。舉例來說，去除構(gòu)筑體可具有可操作地連接到編碼barnase的基因的LPAG1啟動(dòng)子，而PrAG或LPAGld4啟動(dòng)子可操作地連接到編碼barstar(barnase抑制劑)的基因。如上文實(shí)例6中所示，LPAG1啟動(dòng)子在松球和胚中具活性，而PrAG或LPAGd4啟動(dòng)子僅在松樹胚中具活性。通過在啟動(dòng)子(PrAG)下放置在松球中展示極低活性的編碼barstar的基因，由其它啟動(dòng)子(LPAG)產(chǎn)生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，松樹胚中兩個(gè)啟動(dòng)子的相似活性水平會(huì)產(chǎn)生相似量的barnase和barstar,且因此胚中的barnase毒性得以有效中和，導(dǎo)致松樹胚性愈傷組織和胚的轉(zhuǎn)化和再生。實(shí)例2中所述的轉(zhuǎn)化方案后，分析松樹愈傷組織的LPAG1表達(dá)。實(shí)例8輻射松AO4M0C/S啟動(dòng)子的分析如實(shí)例1所述，可從諸如輻射松或巨桉的樹種類中鑒別繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子并進(jìn)行克隆。PrAG啟動(dòng)子為來自輻射松的AGAMOUS啟動(dòng)子。PrAG啟動(dòng)子具有約1400bp的長(zhǎng)度，包括5'-未翻譯區(qū)。PrAG啟動(dòng)子公開于WO00/55172中，所述專利以引用的方式并入本文中。為確定PrAG是否能夠繁殖優(yōu)選表達(dá)，使PrAG啟動(dòng)子可操作地連接到具有內(nèi)含子的GUS報(bào)告基因。如實(shí)例2中所述，將所得PrAG-GUS啟動(dòng)子構(gòu)筑體引入煙草植物中。分析煙草組織的GUS表達(dá)，且表5中概括PrAG啟動(dòng)子活性。表5:PrAG啟動(dòng)子活性的GUS分析<table>tableseeoriginaldocumentpage51</column></row><table>盡管通過酶分析未檢測(cè)到葉、花瓣、雄蕊和心皮組織中的GUS表達(dá)，但使用更敏感的方法(諸如用poly(A+)RNA進(jìn)行的RNA酶保護(hù)分析(RNaseProtectionAssay))可檢測(cè)到花瓣、雄蕊和心皮組織中的GUS表達(dá)。實(shí)例9花特異性增強(qiáng)子增加PrAG啟動(dòng)子活性如實(shí)例8所述，PrAG啟動(dòng)子使繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子在煙草中極弱地表達(dá)。已展示，擬南芥AGAMOUS基因含有存在于AG基因的第二個(gè)內(nèi)含子中的花特異性增強(qiáng)子(AtAGenh)。Sieburth,L.E.和Meye薩itz，E.M.ThePlantCell9,355-365(1997)。Busch,M.A.,Bomblies,K.和Weigel,D.Science285，585-587(1999)。Deyholos，M.K.和Sieburth,L.E.ThePlantCell12:1799-1810(2000)。AtAGenh增強(qiáng)子元件可優(yōu)先在被子植物花的繁殖組織屮上調(diào)PrAG啟動(dòng)子活性是可能的。為確定AtAGenh是否增強(qiáng)繁殖組織中的PrAG啟動(dòng)子活性，分離擬南芥AG(2750bp)的第二個(gè)內(nèi)含子并使其與可操作地連接到具有內(nèi)含子((AtAGenh)PrAG::GUSIN)的GUS報(bào)告基因的PrAG啟動(dòng)子的5'端融合，并將所得構(gòu)筑體(pWVCZ20，參看圖2)引入煙草中。煙草轉(zhuǎn)化后，收集煙草組織，并分析其GUS表達(dá)。如下表6中所示，GUS染色揭示，AtAGenh確實(shí)增強(qiáng)主要在雄蕊和心皮中的PrAG啟動(dòng)子活性，且也在花瓣中觀察到部分增加。在萼片、葉和營養(yǎng)莖尖中未觀察到GUS染色。表6:AfAGenh增強(qiáng)PrAG啟動(dòng)子活性<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>實(shí)例10使用繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子::突變體barnase構(gòu)筑體用于繁殖去除而不干擾營養(yǎng)生長(zhǎng)如上文實(shí)例4中所述，可使用各種方法產(chǎn)生具有減弱的細(xì)胞毒素作用的突變體細(xì)胞毒素基因。通過降低barnase酶的毒性作用，可將barnase用于繁殖去除，而不危及植物的營養(yǎng)生長(zhǎng)。而且，可操作地連接到減弱的barnase的繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子組合提供一種供繁殖去除而不破壞營養(yǎng)生長(zhǎng)的方式。舉例來說，分別使突變體barnaseE73G與PrAG融合以建立pWVCZ23(圖3),與(AtAGenh)PrAG融合以建立pWVCZ24(圖4),并將所得構(gòu)筑體引入煙草中。轉(zhuǎn)化后，分析煙草植物，并將結(jié)果展示于下表7中。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>如表7所示，68呢經(jīng)(AtAGenh)PrAG::E73G轉(zhuǎn)化的煙草植物具有不育性繁殖表型，即許多經(jīng)轉(zhuǎn)化植物不產(chǎn)生具生育力的花粉，也不產(chǎn)生具生育力的種子。同樣，10%經(jīng)PrAG::E73G轉(zhuǎn)化的植物不產(chǎn)生具生育力的花粉和種子。有趣的是，以任一構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化都不危及營養(yǎng)生長(zhǎng)。所得結(jié)果清楚地證實(shí)，去除盒(AtAGenh)PrAG::E73G可產(chǎn)生雄性不育性和雌性不育性煙草，且此盒能夠?qū)ζ渌蛔又参?包括被子植物和裸子植物)產(chǎn)生類似的去除作用。實(shí)例11使用溫度敏感型Barnase去除繁殖原基而不干擾營養(yǎng)生長(zhǎng)Barnase是一種經(jīng)良好表征的酶，且已鑒定出多種突變體。具體說來，己鑒定出具有變化的穩(wěn)定性和/或毒性的banrnse突變體?？赡苄枰獪囟让舾行蚥arnase來去除繁殖原基而不影響營養(yǎng)生長(zhǎng)。舉例來說，可將熱敏感型baraase用于繁殖去除。舉例來說，在夏季(高溫)，當(dāng)出現(xiàn)大量營養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)，熱敏感型barnase的表達(dá)可具有極低毒性作用，但在冬天或低溫產(chǎn)生繁殖芽時(shí)可具有毒性?？墒褂弥T如PrMC2(SEQIDN04或16)的繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子使?fàn)I養(yǎng)組織中熱敏感型barnase的表達(dá)減到最低。實(shí)例12Barstar中和轉(zhuǎn)基因松樹愈傷組織和再生胚中的barnase毒性Barstar是一種天然的barnase抑制劑，且已將其用于保護(hù)非目標(biāo)組織免受baraase毒性影響和恢復(fù)植物的繁殖力。BealsT.P.禾口GoldbergR.B,PlantCell.9:9:1527-45(1997)。KuvshinovV等人，PlantSci.160:3:517-522(2001)。先前的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，三種啟動(dòng)子LPAGl、PrAG和LPAGld4在松樹愈傷組織和再生胚中具有相似的活性。LPAG1啟動(dòng)子在煙草花中具有高活性，而PrAG和LPAGld4啟動(dòng)子在煙草花中不展示活性或展示痕量活性，表明PrAG和LPAGld4啟動(dòng)子在被子植物或裸子植物繁殖組織中可能不具活性。因此，可使PrAG和LPAGld4啟動(dòng)子可操作地連接到中和barnase的細(xì)胞毒素作用的基因，諸如barstar，且啟動(dòng)子::barstar構(gòu)筑體將靶向非繁殖組織。所述啟動(dòng)子::barstar構(gòu)筑體(例如，PrAG::barstar)將保護(hù)營養(yǎng)組織免受有害barnase表達(dá)的影響。而且，建立具有可操作地連接到barnase的繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子和可操作地連接到barstar的非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子的去除構(gòu)筑體可能極為有益。舉例說來，松球去除構(gòu)筑體可具有驅(qū)動(dòng)barnase的LPAG1啟動(dòng)子，而PrAG或LPAGld4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)barstar(諸如LPAG1::barnaseE73G/PrAG::barstar或LPAGl::barnaseE73G/LPAGld4::barstar)，且兩個(gè)盒在一個(gè)骨架中。在松樹轉(zhuǎn)化期間，由松樹愈傷組織和再生胚中的LPAG1活性引起的barnase毒性將由PrAG或LPAGld4啟動(dòng)子活性產(chǎn)生的barstar有效中和，且因此可平穩(wěn)地進(jìn)行轉(zhuǎn)化。然而，在成熟轉(zhuǎn)基因松樹中，松球芽(pine-conebud)中由LPAGl啟動(dòng)子活性引起的barnase的存在將因barnase毒性和松球芽中barstar的缺乏而有效殺死松球。實(shí)例13同框PrMC2.400啟動(dòng)子片段的克隆如美國專利申請(qǐng)公開案20030101487中所述，鑒別并分離PrMC2.400啟動(dòng)子序列，所述專利以引用的方式并入本文。PrMC2.400序列具有與pWVR220和其它PrMC2構(gòu)筑體中所使用的ATG不同框的ATG。盡管先前有關(guān)擬南芥的測(cè)試清楚表明GUS是由PrMC2.400啟動(dòng)子表達(dá)的，但在經(jīng)PrMC2.400啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化的煙草花藥中未觀察到GUS表達(dá)。因此，克隆同框PrMC2.400以用于去除構(gòu)筑體中。使用下述PCR引物，分離兩種不同PrMC2.400啟動(dòng)子的序列。如下文所述，將兩個(gè)PrMC2.400啟動(dòng)子克隆到表達(dá)載體中，以確保所述序列與可操作地連接的基因同框。在PrMC2.400啟動(dòng)子序列中尤其361、367和397位處存在若干個(gè)同框ATG。使用所述的反向引物，產(chǎn)生兩種不同的PrMC2.400產(chǎn)物。PrMC2.400-l含有所有三個(gè)ATG;PrMC2.400-3僅含有第一個(gè)ATG。反向引物的5'端經(jīng)磷酸化，因此其可與克隆載體中的適當(dāng)位點(diǎn)平末端接合(blunt-ligated)。PrMC2-XG引物含有Xhol位點(diǎn)。使用高保真Taq聚合酶摻合物(TaqPlusLong,Stratagene)進(jìn)行PCR。PCR后，凝膠純化擴(kuò)增產(chǎn)物且隨后使用標(biāo)準(zhǔn)程序用Xhol進(jìn)行消化。將每一產(chǎn)物克隆到中間載體中并測(cè)序。測(cè)序指示PrMC2.400-l序列與原始序列存在1個(gè)核苷酸的差異，即35位處存在"T"殘基插入。將PrMC2.400-l和PrMC2.400-3序列克隆到表達(dá)載體中已確保所有ATG位點(diǎn)都與所關(guān)注的基因保持同框。PrMC2習(xí)XG(正向):5'匿GAAGAACTCGAGTAAAACATAATTTTGGCAGTAAAAAGTGA-3'(SEQIDNO:38)PrMC2-Rl(反向):5'-CATGTTCCCGTTTGATACCTGAATTTTG-3'(SEQIDNO:39)PrMC2-R3(反向)5'-CATAAATCTTCTAAAAACAGCAGAACTGAC-3'(SEQIDNO:40)PrMC2-XG+PrMC2-Rl:產(chǎn)生指定為PrMC2.400-l的3966(KNC)bp產(chǎn)物(SEQIDNO:5)PrMC2-XG+PrMC2-R3:產(chǎn)生指定為PrMC2.400-3的3603(KNC)bp產(chǎn)物(SEQIDNO:16)。實(shí)例14將同框PrMC2.400-l::突變體barnase克隆到二元載體中如實(shí)例17中所述，可使同框啟動(dòng)子PrMC2.400-l和PrMC2.400-3可操作地連接到所關(guān)注的基因以用于基因去除。舉例說來，可使同框PrMC2.400-l啟動(dòng)子可操作地連接到減弱的barnase序列以用于繁殖去除。如實(shí)例4中所述，將K27A突變體barnase預(yù)先克隆到高拷貝載體pWVR63中。將PCR產(chǎn)生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR63中，所述pWVR63預(yù)先經(jīng)Ncol消化，經(jīng)綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平末端，隨后經(jīng)XhoI消化和凝膠純化以分離載體片段。隨后的中間質(zhì)粒pWVR205現(xiàn)含有去除盒PrMC2.400-l::K27Abarnase::RNS2TER。接著，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中以產(chǎn)生pWVR216。如實(shí)例4中所述，預(yù)先將H102E突變體barnase克隆到高拷貝載體pWVR15中。為得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由pWVR15模板產(chǎn)生H102E。使用以下PCR引物產(chǎn)生突變體barnaseH102E:Agl2-PB:5'-TTTCACAACCTCCACACACTT-3'(SEOIDNO:33)Bar3Sac:5'-GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'(SEOIDNO:35)。使用高保真Taq聚合酶摻合物(TaqPlusLong，Strategene)進(jìn)行PCR。使用標(biāo)準(zhǔn)的三步驟PCR方法。凝膠純化PCR反應(yīng)物，且隨后用Ncol和Sacl進(jìn)行消化。凝膠純化限制性消化物，并分離片段且濃縮。將這一經(jīng)純化PCR片段克隆到預(yù)先經(jīng)Ncol和Sacl消化的中間載體中，產(chǎn)生構(gòu)筑體pWVR218。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的突變體baraase序列。隨后，將PCR產(chǎn)生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR218中，所述pWVR218預(yù)先經(jīng)Ncol消化，經(jīng)綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平末端，隨后經(jīng)Xhol消化和凝膠純化以分離載體片段。隨后的質(zhì)粒pWVR219現(xiàn)含有去除盒PrMC2.400-l::H102Ebarnase::RNS2TER。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子:基因聯(lián)接。接著，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中以產(chǎn)生pWVR220。如實(shí)例4中所示，預(yù)先將E73G突變體barnase克隆到高拷貝載體中。為得到更便利的限制性酶末端以供克隆，使用PCR引物由質(zhì)粒模板產(chǎn)生E73G序列。使用以下PCR引物產(chǎn)生突變體barnaseE73G:Bar5Nco:5'-TGACAACCATGGCACAGGTTATCAACACGTTTGAC習(xí)3'(SEOIDNO:MlBar3Sac:5'匿GAAGAAGAGCTCTTGACCGATCAGAGTTTGAAG-3'(SEOIDNO:Ml。使用高保真Taq聚合酶摻合物(TaqPlusLong,Strategene)進(jìn)行PCR。使用標(biāo)準(zhǔn)的三步驟PCR方法。凝膠純化PCR反應(yīng)物，且隨后用Ncol和Sacl進(jìn)行消化。凝膠純化限制性消化物，并分離片段且濃縮。將這一經(jīng)純化PCR片段克隆到預(yù)先經(jīng)NcoI和Sacl消化的中間載體中，產(chǎn)生構(gòu)筑體pWVR230。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的突變體barnase序列。隨后，將PCR產(chǎn)生的片段PrMC2.400-l克隆到pWVR230中，所述pWVR230預(yù)先經(jīng)NcoI消化，經(jīng)綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平末端，隨后經(jīng)Xhol消化和凝膠純化以分離載體片段。隨后的質(zhì)粒pWVR231現(xiàn)含有去除盒PrMC2.400-I::E73Gbarnase::RNS2TER。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子:基因聯(lián)接。接著，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中以產(chǎn)生pAGF232。GfAS抓裙盡管先前關(guān)于擬南芥的測(cè)試證實(shí)GUS是從原始PrMC2.400啟動(dòng)子表達(dá)的，但在經(jīng)轉(zhuǎn)化的煙草花藥中未觀察到染色。合成新的報(bào)告基因盒(參看下文)，從而使其匹配去除構(gòu)筑體的框架。將PCR產(chǎn)生的片段PrMC2.400-1克隆到pWVR52中，所述pWVR52預(yù)先經(jīng)Ncol消化，經(jīng)綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平末端，隨后經(jīng)XhoI消化和凝膠純化以分離載體片段。隨后的質(zhì)粒pWVR233現(xiàn)含有盒PrMC2.400-l::GUS::RNS2TER。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子:基因聯(lián)接。接著，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中以產(chǎn)生pAGF234。實(shí)例15PrMC2.400-l:Barnase的植物原位表達(dá)通過電穿孔以二元載體pWVR216或pWVR220或pAGF232或pAGF234轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株GV2260。由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草(Nicotianatabacum)轉(zhuǎn)化制造轉(zhuǎn)基因植物。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。通過PCR鑒別陽性轉(zhuǎn)化體，將其轉(zhuǎn)移到土壤中，并使其在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長(zhǎng)。分析植物的總營養(yǎng)生長(zhǎng)速率、開花時(shí)間和雄性不育性。由PrMC2.400-l啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)突變體barnase基因的植物展現(xiàn)出雄性不育表型。具體說來，轉(zhuǎn)基因植物不產(chǎn)生花粉粒。這是以顯微鏡通過在復(fù)式光學(xué)顯微鏡下(compoundlightmicroscope)觀察得到確認(rèn)。另外，無花粉植物不產(chǎn)生果實(shí)蒴果(fruitcapsue)和種子。然而，當(dāng)用野生型(wt)煙草花粉對(duì)植物進(jìn)行異花授粉時(shí)，出現(xiàn)正常結(jié)實(shí)，表明雌性繁殖力未受影響。此外，這些異花授粉的苗種產(chǎn)生無花粉表型，表明轉(zhuǎn)基因得以繼承且后代中轉(zhuǎn)基因的存在產(chǎn)生雄性不育植物。應(yīng)注意，由PrMC2.400-l啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)表達(dá)突變體barnase基因的煙草株具有相對(duì)于心皮降低的雄蕊高度。開花時(shí)間也有所延遲。易于相對(duì)于對(duì)照株由表達(dá)K27A和E73G的煙草株觀察到營養(yǎng)生長(zhǎng)的降低。所述營養(yǎng)生長(zhǎng)的降低導(dǎo)致較小的植物和較慢的發(fā)育。表達(dá)H102E的植株展示出最小的營養(yǎng)影響標(biāo)志，且在總體生長(zhǎng)方面與對(duì)照株極其類似。營養(yǎng)生長(zhǎng)降低可指示煙草組織中PrMC2.400啟動(dòng)子表達(dá)的"漏出程度(leakiness)"。為分析營養(yǎng)組織中PrMC2.400啟動(dòng)子的活性，對(duì)經(jīng)PrMC2.400-l::GUS株轉(zhuǎn)化的植株中幼葉組織、根和營養(yǎng)莖尖的GUS活性進(jìn)行測(cè)試。使用發(fā)色底物X-GIuc以組織化學(xué)方法分析GUS活性。室溫下，使組織中真空滲入X-Gluc歷時(shí)1小時(shí)，隨后在37'C下培育16小時(shí)。培育后，使組織在100%甲醇中且隨后在95%乙醇中脫染色。這些組織顯示并無GUS表達(dá)。也可能GUS表達(dá)水平過低而無法通過這一分析檢測(cè)。進(jìn)行使用連接到GUS的PrMC2.400-l進(jìn)行的其它實(shí)驗(yàn)以進(jìn)一步了解煙草花藥發(fā)育期間的時(shí)間和空間表達(dá)模式?？蓪煵莼òl(fā)育細(xì)分成12個(gè)階段以提供花器官系統(tǒng)中基因表達(dá)的參考點(diǎn)。Koltunow等人，ThePlantCell2:1201-1224(1990)。在每一階段時(shí)都移除花芽，切細(xì)，染色以分析GUS活性，并以顯微鏡觀察。使用發(fā)色底物X-Gluc以組織化學(xué)方法分析GUS活性。室溫下，使花芽中真空滲入X-Gluc歷時(shí)1小時(shí)，隨后在37i:下培育16小時(shí)。使組織在100%甲醇中且隨后在95%乙醇中脫染色。結(jié)果指示PrMC2.400-l啟動(dòng)子僅在花藥中表達(dá)，且PrMC2.400-l的表達(dá)限于其中存在絨氈層的發(fā)育階段。這些絨氈層在花粉形成中起到重要作用。因此，絨氈層中細(xì)胞毒素基因的表達(dá)可防止花粉產(chǎn)生。實(shí)例16將PrMC2.400-3::突變體barnase克隆到二元載體中如上文實(shí)例13所述，使用引物PrMC2.400-XG和PrMC2-R3產(chǎn)生PrMC2.400-3。用于擴(kuò)增這一片段的模板是二元載體pWVR220。將這一經(jīng)純化PCR片段克隆到預(yù)先經(jīng)Nco1和Sacl消化的中間載體中，產(chǎn)生構(gòu)筑體pWVR242，其現(xiàn)含有去除盒PrMC2.400-3::H102Ebarnase::RNS2TER。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子:基因聯(lián)接。隨后，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中產(chǎn)生pWVR243。G"S妖街將PCR產(chǎn)生的片段PrMC2.400-3克隆到pWVR52中，所述pWVR52預(yù)先經(jīng)Ncol消化，經(jīng)綠豆核酸酶處理以產(chǎn)生平末端，隨后經(jīng)XhoI消化和凝膠純化以分離載體片段。隨后的質(zhì)粒pWVR244現(xiàn)含有所述盒PrMC2.400-3::GUS::RNS2TER。對(duì)這一構(gòu)筑體測(cè)序以確保正確的啟動(dòng)子序列和啟動(dòng)子:基因聯(lián)接。隨后，使用Kpnl和Apal將此盒亞克隆到二元載體中以產(chǎn)生pWVR245。實(shí)例17PrMC2.400-3:barnase的植物原位表達(dá)通過電穿孔以二元載體pAGF243或pAGF245轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌菌株GV2260。由農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草(Nicotianatabacum)轉(zhuǎn)化制造轉(zhuǎn)基因植物。在含有卡那霉素的培養(yǎng)基上選擇轉(zhuǎn)化體。通過PCR鑒別陽性轉(zhuǎn)化體，將其轉(zhuǎn)移到土壤中，并使其在標(biāo)準(zhǔn)溫室條件下生長(zhǎng)。觀察植物的總營養(yǎng)生長(zhǎng)速率、開花時(shí)間和雄性不育性。轉(zhuǎn)基因煙草植株顯示出雄性不育表型。具體說來，植物不產(chǎn)生花粉粒。另外，PrMC2.4000-l::H102E株相對(duì)于心皮高度具有降低的雄蕊高度，且開花時(shí)間有所延遲。將含有連接到報(bào)告基因GUS的PrMC2.400-3的植株與PrMC2.400-1::GUS株相比較?；ㄑ俊⒂绕浠ㄋ幗M織中GUS染色的強(qiáng)度可與PrMC2.400-l::GUS株相較。實(shí)例18構(gòu)筑具有開花對(duì)照盒的前體質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)筑是以得自因缺失非必需DNA區(qū)段而降低尺寸的pBIN19的二元載體pARB310(SEQIDNO:Z1)開始。通過BstXI消化將先前已以側(cè)翼BstXI位點(diǎn)克隆的barstar基因(Hartley,R.W.J.Mol.Biol.202:913-915(1988))從pWVR200B移除，并進(jìn)行凝膠純化。使約470bp片段接合到已經(jīng)BstXI消化的pARB310中，產(chǎn)生pARB310B。接下來，使用PCR以下述引物對(duì)由pART27(Gleave，1992)擴(kuò)增ColEl復(fù)制起點(diǎn)和周圍區(qū)域ColEl-F4(5'-GAGAGAGGATCCGGTGTGAAATACCGCACAG-3'，SEQIDNO:41)禾口ColEl-R4(5'-GAGAGATGATCAGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTG-3'，SEQIDNO:42)。用BamHI和Bell消化1.0kb的ColEl片段，隨后加以純化并將其接合到trfA基因末端與T-DNA左邊界(LB)之間pARB310B的Bell位點(diǎn)中。這產(chǎn)生pAGF50，其充當(dāng)大腸桿菌中的高拷貝數(shù)質(zhì)粒，但仍在農(nóng)桿菌中復(fù)制。用Ascl和Ncol消化pAGF50以移除UBQ3啟動(dòng)子和大部分NPTII編碼區(qū)，并對(duì)所得5.7kb片段進(jìn)行凝膠純化。通過Ascl和Ncol消化將連接到NPTII編碼區(qū)5'端的1.9kb片段和UBQ10啟動(dòng)子從pWVR3釋放，凝膠純化并將其接合到pAGF50片段中以產(chǎn)生pARB1000。通過加入SUBIN::GUSIN::NOSTER報(bào)告基因盒進(jìn)一步修飾這一質(zhì)粒。SUBIN表示來自輻射松的獨(dú)特啟動(dòng)子，其包括編碼5'-UTR和內(nèi)含子的基因組DNA;GUSIN表示來自馬鈴薯tuberin基因的(3-葡糖苷酸酶編碼區(qū)和內(nèi)含子(Vancanneyt等人，1990)。通過Dral消化將報(bào)告基因盒從pARB494移除，并將其接合到pARB1000的Smal位點(diǎn)中以產(chǎn)生pARB1001。除能夠充當(dāng)轉(zhuǎn)化對(duì)照物外，由于pARB1001具有兩個(gè)在報(bào)告基因側(cè)面的可用于使其與所關(guān)注的其它基因轉(zhuǎn)換的Notl位點(diǎn)，所以還將其用作開花對(duì)照質(zhì)粒的直接前體。雄性特異性開花對(duì)照基因PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER存在于pWVR219中，且具有一個(gè)接近3'端的不合需要的Notl位點(diǎn)。用Notl消化質(zhì)粒，且隨后在dNTP存在下通過用T4DNA聚合酶處理并與載體再接合來破壞所述位點(diǎn)。用Ascl和Xhol將PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒從已變化的pWVR219切除，并對(duì)1.1kb的片段進(jìn)行凝膠純化。通過用Xhol部分消化隨后以Ascl完全消化來制備pARB1001以使質(zhì)粒線性化。使PrMC2.400::barnaseH102E::RNS2TER盒與所制備的pARB1001載體接合以產(chǎn)生pARB1002。用單邊測(cè)序(single-passsequencing)驗(yàn)證質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。通過EcoRI禾GAscl消化將(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G::NOSTER盒從pWVCZ24移除。將包含寡核苷酸EcoNotl(5'-AATGCGGCCGCAGAGA-3'，SEQIDNO:43)禾口EcoNot2(5'-TCTCTGCGGCCGC-3'，SEQIDNO:44)的Notl接頭接合到EcoRI位點(diǎn)，并用Notl消化，且隨后純化4.9kb片段。用Notl和Ascl消化質(zhì)粒pARB1001，并對(duì)7.6kb載體片段進(jìn)行凝膠純化。將上述盒接合到這些位點(diǎn)中以產(chǎn)生pARB1005L(圖19)。用單邊測(cè)序驗(yàn)證質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)。實(shí)例19西方桉早花(EarlyFlowering)的轉(zhuǎn)化本實(shí)例詳細(xì)說明西方桉早花的感染和轉(zhuǎn)化。為測(cè)試開花對(duì)照構(gòu)筑體，在溫室生長(zhǎng)條件下測(cè)試西方桉籽苗的早花，并基于六個(gè)月內(nèi)的開花情況選擇克隆。將這些克隆引入不育組織培養(yǎng)物中以用于本發(fā)明的去除構(gòu)筑體和對(duì)照GUS構(gòu)筑體的轉(zhuǎn)化。如下表所示，根據(jù)美國專利申請(qǐng)案10/861,909的方法，采集葉外植體(Leafexplant)，并預(yù)培養(yǎng)4天，且隨后用具有p35SGUSINT(35S::GUSINT，NOS::NPTII)或本發(fā)明的構(gòu)筑體的農(nóng)桿菌菌株GV2260感染單獨(dú)外植體，所述專利以以引用的方式并入本文。根除農(nóng)桿菌后，將外植體移植到選擇培養(yǎng)基中，所述選擇培養(yǎng)基是由如同一專利申請(qǐng)案中所述的常規(guī)再生培養(yǎng)基和30mg/l遺傳霉素組成。使轉(zhuǎn)化體的再生枝條生根，并使其在溫室中在容器中的土壤上生長(zhǎng)以相對(duì)于對(duì)照物測(cè)試經(jīng)去除構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的桉樹的開花時(shí)間。也使用美國專利申請(qǐng)案10/861,909的方法將本發(fā)明的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化到赤桉克隆和尾葉桉和巨桉的商用克隆中。使轉(zhuǎn)化體的再生枝條生根，將其轉(zhuǎn)移到土壤中并使其適應(yīng)溫室，隨后在美國農(nóng)業(yè)部植物健康檢查服務(wù)(USAgriculturalPlantHealthInspectionService)通知下將其轉(zhuǎn)移到Florida和SouthCarolina的田間種植點(diǎn)。定期監(jiān)測(cè)植物花芽的發(fā)育。迄今尚未觀察到開花。表8<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>實(shí)例20雜交松使用美國專利第5,856,191號(hào)中所述的程序從個(gè)別未成熟大配子體的合子胚起始雜交松(火炬松屬x剛松屬)和火炬松(火炬松屬)胚細(xì)胞系，并使用美國專利第5,506,136號(hào)中所述的程序加以維持。在維持培養(yǎng)基上培養(yǎng)一到三個(gè)月后，低溫保存組織培養(yǎng)物，儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)數(shù)年的時(shí)間，且隨后使用美國專利第6,682,931號(hào)中的方法加以恢復(fù)。植物組織培養(yǎng)領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到，其它低溫保存和回收方案將適用于本方法中且不可將本實(shí)例中的細(xì)節(jié)解釋為對(duì)本方法應(yīng)用的限制。根據(jù)美國專利第5,491,090號(hào)中的方法，兩種遺傳不同的雜交松組織培養(yǎng)細(xì)胞系和多種火炬松細(xì)胞系的均勻懸浮培養(yǎng)物是通過在250mlNephelo側(cè)臂燒瓶(Nephelosidearmflask)(KontesChemistryandLifeSciencesProducts)中接種1g各組織而建立的。在23°C+21:的溫度下，在暗培養(yǎng)室中將含有液體培養(yǎng)基中的細(xì)胞的燒瓶放置到100rpm下的回轉(zhuǎn)式震蕩器(gyrotoryshaker)中。一周后，通過將15ml新鮮培養(yǎng)基傾入培養(yǎng)燒瓶中并打漩以均勻分布細(xì)胞來使每一燒瓶中的液體達(dá)到35ml。將細(xì)胞和培養(yǎng)基傾析到燒瓶的側(cè)臂部分中，使細(xì)胞沉降30分鐘且隨后測(cè)量產(chǎn)將細(xì)胞體積(SCV)，從而來測(cè)量側(cè)臂中細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)SCV大于或等于最大SCV的一半(燒瓶中50%體積由植物細(xì)胞占據(jù))時(shí)，將每一培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到含有總計(jì)80ml細(xì)胞和培養(yǎng)基的500ml側(cè)臂燒瓶中，并在相同條件下維持所轉(zhuǎn)移的培養(yǎng)物。為準(zhǔn)備基因轉(zhuǎn)移，通過高壓滅菌使聚酯膜載體無菌，并將其放置到單獨(dú)的無菌布氏漏斗(Buchnerfunnel)中，且對(duì)于每個(gè)細(xì)胞系6個(gè)復(fù)制平板中的每一個(gè)而言，將1微升到3微升松樹胚性細(xì)胞懸浮液吸到每一載體上，從而使胚性組織均勻分布。從所述組織抽吸液體培養(yǎng)基，并根據(jù)美國專利公開案第20020100083號(hào)中所述的方法，將具有胚性組織的每一載體放置到凝膠化制備型培養(yǎng)基上以供農(nóng)桿菌培育。通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的技術(shù)將二元報(bào)告基因構(gòu)筑體引入到不同根癌農(nóng)桿菌的分離物中(isolatesAgrobacteriumtumefacien),并通過常用技術(shù)以投與乙酰丁香酮誘導(dǎo)毒性，于是，使每一經(jīng)誘導(dǎo)的農(nóng)桿菌分離物與單獨(dú)的植物材料復(fù)本共混合。在22'C+2°CT,在暗室中共培植所述細(xì)胞歷經(jīng)約72小時(shí)。共培植后，根據(jù)美國專利公開案第20020100083號(hào)中所述的方法，從培養(yǎng)物中根除農(nóng)桿菌。隨后，以2周的時(shí)間間隔將聚酯膜載體上生長(zhǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新鮮選擇培養(yǎng)基上。在許多皮氏培養(yǎng)皿(petridish)上的多個(gè)獨(dú)立部分中出現(xiàn)選擇培養(yǎng)基上的活躍生長(zhǎng)。所述在選擇劑存在下的活躍生長(zhǎng)通常表明生長(zhǎng)組織已將選擇基因整合到其染色體中并經(jīng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化。將這些活躍生長(zhǎng)區(qū)作為獨(dú)立轉(zhuǎn)化事件處理，且在下文中將其稱為假定的轉(zhuǎn)基因亞株(putativetransgenicsubline)。通過將正在生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)基因部分轉(zhuǎn)移到補(bǔ)充有個(gè)別選擇劑的新鮮半固體維持培養(yǎng)基中來繁殖假定轉(zhuǎn)基因胚性組織。在推定經(jīng)轉(zhuǎn)化亞株達(dá)到約2g后，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)其進(jìn)行選擇以用于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，從而確認(rèn)轉(zhuǎn)基因的存在。表9.PCR引物對(duì)<table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>犧牲來自每一亞株的材料以供GUS染色和顯微鏡檢驗(yàn)。對(duì)于GUS染色而言，根據(jù)植物轉(zhuǎn)化技術(shù)中眾所周知的技術(shù)，在暴露到發(fā)色葡糖苷酸酶(colorigenicglucuronidase)酶底物"X-gluc"(購自Inalco)后通過每一轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系中細(xì)胞的深藍(lán)染色來檢測(cè)編碼在組織培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的P-葡糖苷酸酶的已插入uidA基因。顯微鏡檢驗(yàn)證實(shí)，細(xì)胞分裂已恢復(fù)，且uidA轉(zhuǎn)基因的瞬時(shí)表達(dá)展現(xiàn)出這些轟擊的正常頻率。如下制備可發(fā)芽胚。使已在選擇培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)的細(xì)胞團(tuán)塊增殖到至少1克后，再次將每一細(xì)胞團(tuán)塊單獨(dú)地再懸浮到液體培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞懸浮液達(dá)到均勻(最大的一半)SCV時(shí)，將等量的懸浮培養(yǎng)細(xì)胞吸到無菌膜載體上以放置到如美國專利第5,506,136號(hào)中所述的發(fā)育/突變培養(yǎng)基上，從而萌發(fā)高品質(zhì)的可采集的第3階段(子葉)胚。在暗生長(zhǎng)室中，在23'C+2^下培育培養(yǎng)皿。每三周將膜載體轉(zhuǎn)移到含有新鮮培養(yǎng)基的新皮氏培養(yǎng)皿中。第9周時(shí)，視覺分析第3階段(子葉)胚的發(fā)芽品質(zhì)，并將其采集到如美國專利第5，506，136號(hào)中所述的培養(yǎng)基上的織物載體上，且在黑暗中在4°C±2'C的溫度下培育約4周。接著，在25。C±2'C的溫度下在黑暗中，在密封容器中的水中培育其織物載體上的胚歷經(jīng)約3周。上述兩種處理后，將其織物載體上的胚轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基萌發(fā)培養(yǎng)基上，并在黑暗中在25。C±2。C的溫度下培育約3天。隨后將胚從其織物載體上移除，并將其放置到新鮮萌發(fā)培養(yǎng)基上。在光照下在25t:±2。C的溫度下進(jìn)行萌發(fā)。每周檢查萌發(fā)平板，歷時(shí)約4周的一段時(shí)間，并將正在萌發(fā)的胚轉(zhuǎn)移到含有100ml萌發(fā)培養(yǎng)基的MAGENTA⑧盒中以轉(zhuǎn)變成幼苗。在光照下，在25°C±2°C的溫度下培育含有正在發(fā)育的幼苗的MAGENTA⑧盒歷經(jīng)約8至lj12周。當(dāng)幼苗形成上胚軸(新近形成的約2cm到4cm的嫩枝)時(shí)，將其轉(zhuǎn)移到填充有灌封混合物(pottingmix)[2:1:2的泥炭塊:珍珠巖蛭石，含有602g/m3OSMOCOTE肥料(18-6-12)、340g/m3白云石和78g/m3MICRO-MAX微量養(yǎng)料混合物(SierraChemicalCo.)]的容器中。使幼苗在陰涼的溫室中生長(zhǎng)且偶爾噴霧歷經(jīng)約2周的一段時(shí)間。將其從薄霧中移除以適應(yīng)溫室中的環(huán)境歷經(jīng)約4周。隨后，將幼苗轉(zhuǎn)移到戶外蔭涼處歷經(jīng)約6周以最后適應(yīng)環(huán)境，此后，將其移到全光照條件下。接著，使其在容器中生長(zhǎng)直至條件適于田間種植。也將由火炬松松屬(P.taeda)植株再生的植物種植到相同田間地點(diǎn)，在種植后長(zhǎng)達(dá)6年的時(shí)間內(nèi)未觀察到球果產(chǎn)生。然而，出人意料的是，在種植后三年時(shí)，轉(zhuǎn)基因雜交松樹植株產(chǎn)生球花。此時(shí)，所述雜交樹大約l米高，比相鄰轉(zhuǎn)基因火炬松小得多。下表10展示另一次種植的結(jié)果，其包括作為對(duì)照物的非轉(zhuǎn)基因雜交松樹原始株以用于體細(xì)胞胚發(fā)生；與對(duì)照物具有相同親代不經(jīng)過組織培養(yǎng)的多種籽苗基因型；和使用兩種不同載體由97LP0006產(chǎn)生的總計(jì)24種不同的轉(zhuǎn)基因植株，一些使用基因槍轉(zhuǎn)化且一些使用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，且總計(jì)超過250棵植物中大部分植株的多個(gè)復(fù)本在種植2年后產(chǎn)生一些球花且在種植三年后產(chǎn)生顯著數(shù)量的球花。測(cè)試以下述觀察結(jié)果終止。表10<table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table>表10所示的結(jié)果表明，經(jīng)過組織培養(yǎng)和轉(zhuǎn)化是達(dá)成產(chǎn)生本發(fā)明的早球花(earlystrobili)結(jié)果所必需的，這是因?yàn)镾E對(duì)照物不產(chǎn)生球花，而極少數(shù)未經(jīng)組織培養(yǎng)的基因型產(chǎn)生球花。然而，幾乎所有的轉(zhuǎn)基因植株都以極高頻率產(chǎn)生雄球花或雌球花或二者。18種轉(zhuǎn)基因植株中僅一種在三年內(nèi)未產(chǎn)生球花。所述結(jié)果與所使用的轉(zhuǎn)化無關(guān)且也與所使用的轉(zhuǎn)化載體無關(guān)。這表明最佳模式是使用(例如)經(jīng)報(bào)告基因構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)基因?qū)φ瘴镆怨┧A(yù)期的比較，從而展示諸如本發(fā)明的去除構(gòu)筑體的繁殖對(duì)照構(gòu)筑體的效率。在產(chǎn)生球花時(shí)，樹平均約為1.2米高，具有平均高度的人無需專用工具就可輕易采集。隨后，使用這一系統(tǒng)來測(cè)試本申請(qǐng)案的繁殖對(duì)照構(gòu)筑體在裸子植物中的功用，所述測(cè)試為一種不可能以其它方式進(jìn)行的測(cè)試。胚性愈傷組織提供測(cè)試所測(cè)試的啟動(dòng)子是否在裸子植物中漏出和當(dāng)以漏出方式表達(dá)時(shí)減弱的barnase基因是否有害的機(jī)會(huì)(參看表中第4列)。使樹再生并將其種植到田間后，相對(duì)于經(jīng)GUS轉(zhuǎn)化的對(duì)照物可在三年內(nèi)測(cè)量對(duì)球果形成日期的影響，此后田間測(cè)試可終止。這將另外允許供這些田間測(cè)試用的昂貴制造林地更快的輪種。表11<table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>實(shí)例21使用具有LPAG1和LPAGld4啟動(dòng)子的構(gòu)筑體去除松樹雄球花和雌球花的方法基于實(shí)例6表4所示的結(jié)果，可使用LPAG1和LPAGld4啟動(dòng)子去除松樹的雄球花和雌球花。舉例說來，去除構(gòu)筑體可具有可操作地連接到編碼barnase的基因的LPAG1啟動(dòng)子，而LPAGld4啟動(dòng)子可操作地連接到編碼barstar(barnase抑制劑)的基因。如上述實(shí)例6所示，LPAG1啟動(dòng)子在松球和松胚中具活性，而LPAGld4啟動(dòng)子僅在松胚(pineembryo)中具活性。這一設(shè)想是基于LPAG1在煙草花中具有高活性而LPAGld4在煙草花中具極低活性的觀察作出的。通過在可在松球中具有極低活性的LPAGld4啟動(dòng)子的控制下放置編碼barstar的基因，由另一啟動(dòng)子(LPAG1)所產(chǎn)生的barnase毒性可有效去除雄球花和雌球花。另一方面，在松胚中兩種啟動(dòng)子的類似活性水平產(chǎn)生類似量的barnase和barstar,且因此所述胚中barnase毒性得以有效中和，引起松樹胚性愈傷組織和胚的轉(zhuǎn)化和再生。序列鑒別符的說明SEqIDNO.1—LPAG1SEGIDNO.2—LPAG2SEQIDNO.3—PrAG-ATenhSEqIDNO.4—PrMC2.400-lSEQIDNO.5—barnase突變體E73G(DNA)SEQIDNO.6—barnase突變體F106S(DNA)SEQIDNO.7—barnase突變體H102E(DNA)SEQIDNO.8—barnase突變體K27A(DNA)SEQIDNO.9—barnase突變體E73G(AA)SEQIDNO.10—barnase突變體F106S(AA)SEQIDNO.11—barnase突變體H102E(AA)SEQIDNO.12—barnase突變體K27A(AA)SEQIDNO.13—PrMC2+barnase突變體H102ESEQIDNO.14—PrMC2+barnase突變體K27ASEQIDNO.15—PrMC2+barnase突變體E73GSEGIDNO.16—PrMC2.400-3SEQIDNO.17—LPAGld4SEQIDNO.18—pWVR220[PrMC2.400::barnaseH102E](圖1)SEQIDNO.19—pWVCZ20[(AtAGenh)PrAG::GUS(內(nèi)含子)](圖2)SEQIDNO.20—pWVCZ23[PrAG::barnaseE73G](圖3)SEQIDNO.21_pWVCZ24[(AtAGenh)PrAG::barnaseE73G](圖4)SEQIDNO.22—pARB599B[PrMC2::barnaseH102E](圖5)SEQIDNO.23—pARB639B[(AtAGenli)PrAG::barnaseE73G](圖6)SEQIDNO.24—pAGF243[PrMC2.400-3::barnaseH102E](圖7)SEQIDNO.25-pABDP010[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互補(bǔ)拷貝](圖8)SEQIDNO.26—pABDP04[CZ28-bstar+UBQ10::NPTII::E9/LPAGld4::bstar::NOST的互補(bǔ)拷貝](圖9)序列如下。SEQIDNO.1—LPAG1TGTGTACAAATCATGSEQIDNO.2—IiPAG2TCATGSEQ工DNO.3—PrAG-ATenh<formula>formulaseeoriginaldocumentpage69</formula>SEQIDNO.4_PrMC2—400.1GTTTTTAGAAGATTTATGAGAATGGCCAAAATTCAGGTATCAAACGGGAACSEQIDNO.5—barnase突變體E73G(DNA)SEQIDNO.8—barnase突變體K27A(DNA)SEQIDNO.9-ba纖se突變體E73G(AA)AlaProGlyLysSerlleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyljysIieuPiroGlyliysSerGlyArgThrTrpArgGlyAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSei:SEQ工DNO.10-barnase突變體(AA>isLysLeuProAspArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSerGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSerSerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrSerTtirliysIleArgSEQIDNO.11-barnase突變體H102E(AA)AsnTyrlleThrLysSerGluAlaGlnAlaLeuGlyTrpValAlaSerLysGlyAsnLeuAlaAspValAlaProGlyLysSerlleGlyGlyAspIlePheSerAsnArgGluGlyLysLeuProGlyLysSerGlySerAspTrpIieuIleTyrliysThrThrAspGluTyrGlnThrPheThEljysIleAjrgSEQ工DNO.12-barnase突變體K27A(AA>/sGlyAsnLeuAlaAspValjeuProGlyLysSerGlyArgThrTrpArgGluAlaAspIleAsnTyrThrSeirGlyPheArgAsnSerAspArglleLeuTyrSerSerAspTrpLeuIleTyrLysThrThrAspHisTyrGlnThrPheThirLysIleArgSEQIDNO.13-PrMC2::BarnaseH102E::RNS2TE:RcassetteSEQIDNO,14—PrMC2::BarnassK27A::RNS2TERcassetteSEQIDNO.16-PrMC2.400-3啟動(dòng)子AGAAGATTTSEQIDNO.17-LPAGld4ACAAATC關(guān)于用SEQIDNO.18-26表示的序列，見圖1-9和圖13。權(quán)利要求1.一種選自由SEQIDNO1-8與13-26組成的群組的經(jīng)分離聚核苷酸或其功能性變異體，其中SEQIDNO1、2、3、4或16中任一者所述的序列使植物細(xì)胞表達(dá)繁殖優(yōu)選基因。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的經(jīng)分離聚核苷酸，其中所述功能性變異體與所述經(jīng)分離聚核苷酸的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。3.—種構(gòu)筑體，其包含可操作地連接到所需核酸的選自SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的聚核苷酸或其功能性變異體，其中所述聚核苷酸調(diào)控所述所需核酸在經(jīng)所述構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞中的表達(dá)。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)筑體，其中所述所需核酸編碼表達(dá)產(chǎn)物，所述表達(dá)產(chǎn)物能夠破壞植物中雄性繁殖結(jié)構(gòu)、雌性繁殖結(jié)構(gòu)、成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中至少一種繁殖結(jié)構(gòu)的繁殖發(fā)育。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)筑體，其中所述雄性繁殖結(jié)構(gòu)為花藥、花絲、絨氈層、花粉、小孢子葉或雄球花中的至少一種，且其中所述雌性繁殖結(jié)構(gòu)為柱頭、花柱、子房、大孢子或胚珠(ovuliferouscone)中的至少一種。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的構(gòu)筑體，其中所述表達(dá)產(chǎn)物是降低所述植物表達(dá)目標(biāo)基因的RNA轉(zhuǎn)錄本。7.—種包含權(quán)利要求3所述的構(gòu)筑體的轉(zhuǎn)基因植物。8.—種制造轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包含(a)用構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體包含(i)至少一種可操作地連接到所需核酸的具有SEQIDNO:1、2、3、4或16中任一者的序列的聚核苷酸或其功能性變異體，其中所述聚核苷酸調(diào)控所述所需核酸的活性，或(ii)具有SEQIDNO:13、14或15中任一者所述的序列的聚核苷酸；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，其中所述植物為顯示出與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物不同的表型的轉(zhuǎn)基因植物。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物的表型的特征在于與不含有所述構(gòu)筑體的相同種類植物相比的雄性繁殖結(jié)構(gòu)、雌性繁殖結(jié)構(gòu)、成熟前雄性繁殖結(jié)構(gòu)或成熟前雌性繁殖結(jié)構(gòu)中至少一種繁殖結(jié)構(gòu)的繁殖發(fā)育中的差異。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其另外包含選擇繁殖不育、已去除繁殖發(fā)育、已變化花粉育性和/或具有未受干擾的營養(yǎng)生長(zhǎng)的植物。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述植物細(xì)胞是來自木本植物。12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述木本植物是選自桉樹屬(￡McaZ，n)或松屬(■P/ttiii1)。13.—種經(jīng)分離的突變體baraase酶，其是由包含SEQIDNO:5-8中任一者所述的序列的聚核苷酸或其變異體編碼，其中所述經(jīng)編碼的突變體barnase酶與野生型barnase酶相比具有已減弱的活性。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的經(jīng)分離突變體baraase酶，其中所述變異體與SEQIDNO:5-8中任一者的序列具有大于或等于99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、90%、89%、88%、87%、86%、85%、84%、83%、82%、81%、80%、79%、78%、77%、76%、75%、74%、73%、72%、71%、70%、69%、68%、67%、66%、65%、64%、63%、62%、61%或60%的序列同一性。15.—種獲得木漿的方法，其包含(a)將構(gòu)筑體引入木本植物的植物細(xì)胞中，所述構(gòu)筑體包含(i)具有SEQIDN0:1、2、3、4或16中任一者的序列的啟動(dòng)子或其功能性變異體，其可操作地連接到(ii)所需核酸，所述核酸包含SEQIDNO:5、6、7或8中任一者所述的序列；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(c)從所述植物獲得木漿。16.—種使轉(zhuǎn)基因植物繁殖不育性的方法，其包含(a)用構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，所述構(gòu)筑體具有繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子和非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子，所述繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到細(xì)胞毒素基因，所述非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子可操作地連接到編碼抑制所述細(xì)胞毒素基因的蛋白質(zhì)的基因；其中所述繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子在被子植物或裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)中具活性，且所述非繁殖優(yōu)選自動(dòng)子在被子植物或裸子植物繁殖結(jié)構(gòu)中不具活性；(b)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞；和(c)選擇具有已去除的繁殖結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子是選自由SEQIDNO:1、2、3、4或16組成的群組。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子包含SEQIDNO:17中所述的序列。18.—種構(gòu)筑體，其包含(i)SEQIDNO:1或2中任一者的序列，其可操作地連接到包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列的聚核苷酸；(ii)SEQIDNO:3的序列，其可操作地連接到SEQIDNO:9的序列；(iii)SEQIDNO:4或16的序列，其可操作地連接到SEQIDNO:7的序列；(W)SEQIDNO:1或2的序列，其可操作地連接到編碼包含SEQIDNO:9-12中任一者中所述的氨基酸序列的多肽的聚核苷酸；或(v)SEQIDNO:22或SEQIDNO:23中所述的序列。19.一種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求18所述的構(gòu)筑體。20.根據(jù)權(quán)利要求18所述的構(gòu)筑體，其另外包含可操作地連接到barstar基因的非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的構(gòu)筑體，其中所述非繁殖優(yōu)選啟動(dòng)子包含SEQIDNO:17中所述的序列。22.—種轉(zhuǎn)基因植物，其包含權(quán)利要求20所述的構(gòu)筑體。23.根據(jù)權(quán)利要求7所述的轉(zhuǎn)基因植物，其中所述所需核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。24.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述所需核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。25.根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)筑體，其中所述核酸包含SEQIDNO:5-8中任一者的序列。26.—種經(jīng)包含SEQIDNO:18-26中任一者的序列的構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化的雜交后代植物。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的雜交后代植物，其中所述雜交后代植物是由剛松松屬(P.r!'gWa)北美油松(pitchpine)與火炬松松屬(P.toe&)火炬松(loblollypine)雜交而獲得。全文摘要本發(fā)明涉及繁殖發(fā)育的調(diào)控，尤其涉及被子植物和裸子植物中繁殖組織的基因去除。本文揭示繁殖優(yōu)選的啟動(dòng)子、調(diào)控元件和細(xì)胞毒素核苷酸序列以及基因去除的構(gòu)筑體與方法。文檔編號(hào)A01H5/02GK101410522SQ200580039310公開日2009年4月15日申請(qǐng)日期2005年9月22日優(yōu)先權(quán)日2004年9月22日發(fā)明者威廉·H·羅特曼,張春程,金·H·諾里斯-卡內(nèi)達(dá)申請(qǐng)人:阿博根有限公司