專利名稱：通過體胚發(fā)生途徑建立草地早熟禾高效再生體系的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過體胚發(fā)生途徑建立草地早熟禾高效再生體系的方法，屬于生物技術(shù)和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
草地早熟禾(P.pratensis L.)為禾本科(Gramineae)早熟禾屬(Poa L.)植物，原產(chǎn)歐亞大陸、中亞西亞地區(qū)，由于其具有繁殖能力強(qiáng)、再生性好、抗寒、綠期長(zhǎng)等特點(diǎn)，是北溫帶利用最為廣泛的優(yōu)質(zhì)冷季型草坪草，在我國(guó)被廣泛應(yīng)用于園林綠化中，是中國(guó)北方城市的首選草坪草。但其明顯的不足是抗旱性及耐鹽性差，耐高低溫能力不強(qiáng)。長(zhǎng)期以來，育種工作者一直到致力于這些方面的遺傳改良，而草地早熟禾的兼性無融合生殖特性嚴(yán)重限制了傳統(tǒng)育種方法對(duì)對(duì)其進(jìn)行遺傳改良的優(yōu)勢(shì)。利用遺傳工程可成功地避開傳統(tǒng)育種方法的缺陷，并能充分利用草地早熟禾無融合生殖的特性，對(duì)其進(jìn)行性狀改良，是培育耐逆性強(qiáng)的草地早熟禾新品種的一條重要途徑。
但草地早熟禾遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立存在很大難度，其主要原因是草地早熟禾的組織培養(yǎng)再生體系尚不完善，再生率偏低，不能滿足利用基因工程進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的需要。為提高其再生率，國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)影響草地早熟禾再生的影響因素進(jìn)行了研究。Van der Valk等(1989年)對(duì)15個(gè)早熟禾品種的成熟胚再生性能進(jìn)行了研究，認(rèn)為基因型對(duì)植株再生影響較大，Jeffrey等(1995年)試驗(yàn)了12個(gè)草地早熟禾品種，認(rèn)為Baron品種成熟種子誘導(dǎo)出的愈傷組織再生能力最強(qiáng)，其再生頻率為46％。已報(bào)道的研究中，用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體類型主要有成熟胚、幼胚、幼穗、胚芽鞘、莖節(jié)、莖尖以及葉片等。Manton(1982)、McDonnel等(1984)、Conges(1984)以及Boyd & Dale(1987)先后報(bào)道了草地早熟禾成熟種胚和幼胚的組織培養(yǎng)特性，認(rèn)為草地早熟禾成熟胚誘導(dǎo)所得愈傷組織的植株再生能力低，最高僅為6％。Griffin & Dibble(1995年)和Hodges(1999)同樣利用其成熟種子為外植體建立了植株再生體系，最高誘導(dǎo)率達(dá)46％，Wu&Jampates報(bào)道了以莖尖為外植體建立了再生體系，但再生率很低。Ke和Lee(1996年)利用胚芽鞘、葉片和莖節(jié)為外植體也獲得了再生植株，再生率分別為32％、2％、12％。Van等(1989年)用幼穗為外植體高頻誘導(dǎo)出了再生植株，再生率達(dá)79％，朱根發(fā)等(1994年)用幼穗也建立了較高頻率的再生體系，再生率為76.92％。但由于草地早熟禾幼穗期較短，取材受季節(jié)限制，而成熟種子取材不受季節(jié)限制，且易于保存。因此，目前多集中以其成熟種子為外植體，研究進(jìn)一步完善草地早熟禾再生體系的方法與技術(shù)。遺憾的是，迄今為止，以成熟胚為外植體建立高頻穩(wěn)定的再生體系仍不理想。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明以草地早熟禾成熟種子為外植體，利用間接誘導(dǎo)法，將愈傷組織誘導(dǎo)率提高到95％以上，獲得的愈傷組織經(jīng)繼代培養(yǎng)及體細(xì)胞胚誘導(dǎo)培養(yǎng)后轉(zhuǎn)入植株再生培養(yǎng)基獲得了高頻穩(wěn)定的再生體系，為進(jìn)一步利用基因工程對(duì)其進(jìn)行遺傳改良奠定了技術(shù)平臺(tái)。
本發(fā)明通過離體培養(yǎng)草地早熟禾成熟種子，建立了再生體系，所獲得的再生植株性狀均一、穩(wěn)定，易于遺傳工程操作。
本發(fā)明所述方法包括四個(gè)培養(yǎng)階段(1)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚(4)體細(xì)胞胚再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～400勒克斯的弱光培養(yǎng)，光照時(shí)間為16h/d，(4)為2000～3000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時(shí)間為16h/d，整個(gè)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
本發(fā)明通過上述四個(gè)階段的培養(yǎng)從草地早熟禾成熟胚外植體誘導(dǎo)出愈傷組織，并從愈傷組織進(jìn)一步誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚，通過體細(xì)胞胚再生途徑得到了再生植株。
本發(fā)明所述的間接誘導(dǎo)愈傷組織的方法，其特征是將草地早熟禾種子滅菌后，接種于無菌芽床先進(jìn)行萌芽誘導(dǎo)，待種子開始萌芽或萌動(dòng)時(shí)，將其轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。
本發(fā)明各階段的培養(yǎng)基為第(1)階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、CC培養(yǎng)基或MSM培養(yǎng)基其中之一，第(2)(3)階段的基本培養(yǎng)基為MSM，第(4)階段的基本培養(yǎng)基為1/2MS。四個(gè)階段所用激素為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、噻重氮苯基脲TDZ和激動(dòng)素KT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段，愈傷組織的采用間接誘導(dǎo)，在第(2)培養(yǎng)基中還添加Cu2+，第(4)階段采用的基本培養(yǎng)基為大量元素用量減半的MS培養(yǎng)基，蔗糖為15g/L。
選優(yōu)為第(1)(2)(3)三個(gè)階段適合的基本培養(yǎng)基為MSM培養(yǎng)基，第(1)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D2.0～4.0mg/L，噻重氮苯基脲TDZ 0.05mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二苯氧乙酸2，4-D 2.0～3.0mg/L與兩種促進(jìn)細(xì)胞分裂生長(zhǎng)的噻重氮苯基脲TDZ0.02～0.3mg/L或激動(dòng)素KT0.05～1.0mg/L二者其中之一，在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二苯氧乙酸2，4-D0.05～0.5mg/L，噻重氮苯基脲TDZ0.01～0.2mg/L，在第(4)階段的培養(yǎng)基為不使用激素的MS培養(yǎng)基，其大量元素減半，蔗糖用量減至15g/L。其中，在第(2)階段，繼代培養(yǎng)2次，并在培養(yǎng)基中添加了硫酸銅CuSO40.4～1.0mg/L，繼代培養(yǎng)過程，適量培養(yǎng)TDZ濃度或KT濃度，有助于改善愈傷組織的生長(zhǎng)質(zhì)量，Cu2+對(duì)提高體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率有明顯促進(jìn)作用。
本發(fā)明所述的方法具體步驟包括(1)將草地早熟禾種子用稀釋后的洗滌劑洗滌，用流動(dòng)的自來水充分沖洗后，移入無菌環(huán)境用70～75％乙醇和0.1％升汞組合滅菌，再用無菌水沖洗3～5次后，接種于無菌芽床進(jìn)行萌芽誘導(dǎo)，(2)待種子開始萌芽或萌動(dòng)時(shí)，將其轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境，對(duì)芽體切割后接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2.0～4.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；(3)誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于添加2.0～3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.02～0.3mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.5～0.9mg/LCuSO4的培養(yǎng)基，進(jìn)行兩次繼代培養(yǎng)，繼代周期20天，大部分愈傷組織體積明顯增大，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及色譯也發(fā)生明顯變化，具備胚性愈傷組織的特征；(3)選擇胚性愈傷組織接種于添加0.1～1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05～0.2mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培養(yǎng)基；弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為200～400勒克斯，(5)誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚接種于僅添加噻重氮苯基脲TDZ0.05～0.3mg/L的培養(yǎng)基，見光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000～3000勒克斯。整個(gè)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。如該方法所述，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)95％以上，植株再生率達(dá)80％。
獲得的再生植株經(jīng)煉苗后，用自來水洗凈根系上殘留的培養(yǎng)基，移栽到蛭石∶泥土為1∶1的基質(zhì)中遮強(qiáng)光培養(yǎng)1周，移到試驗(yàn)田，其成活率達(dá)100％。


圖1.草地早熟禾愈傷組織的間接誘導(dǎo)圖2.胚性愈傷組織的誘導(dǎo)圖3.愈傷組織的分化圖4.組胚苗的再生
具體實(shí)施例方式在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說明了本發(fā)明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1于培養(yǎng)四鋪三層濾紙并用0.2％KNO3潤(rùn)濕，將草地早熟禾品種‘優(yōu)異’(Merit)成熟種子播在該濾紙上，7℃處理7天，進(jìn)行春化處理。
將經(jīng)春化處理的種子用稀釋后的洗滌劑洗滌，用流動(dòng)的自來水充分沖洗后，移入無菌環(huán)境用75％乙醇滅菌60s后，用0.1％升汞滅菌10min后，再用無菌水沖洗4～6次后，接種于無菌芽床進(jìn)行萌芽誘導(dǎo)，培養(yǎng)7天后，種子開始萌芽或萌動(dòng)。
將萌發(fā)的和開始萌動(dòng)的種子轉(zhuǎn)入無菌環(huán)境，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；暗培養(yǎng)20天調(diào)查愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)98.33％。
誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于添加2.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.25mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.8mg/LCuSO4的培養(yǎng)基，進(jìn)行兩次繼代培養(yǎng)，繼代周期20天，大部分愈傷組織體積明顯增大，其形態(tài)結(jié)構(gòu)及色譯也發(fā)生明顯變化，具備胚性愈傷組織的特征。選擇胚性愈傷組織接種于添加0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培養(yǎng)基；在光照強(qiáng)度為400勒克斯的弱光條件下培養(yǎng)40天，產(chǎn)生大量，結(jié)構(gòu)疏松、色譯鮮黃的硬質(zhì)顆粒愈傷組織，將其接種于僅添加噻重氮苯基脲TDZ0.1mg/L的1/2MS培養(yǎng)基，見光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000～3000勒克斯。整個(gè)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為25±1℃，每培養(yǎng)20天換一次新鮮培養(yǎng)基。植株再生率達(dá)80％。
獲得的再生植株經(jīng)煉苗后，用自來水洗凈根系上殘留的培養(yǎng)基，移栽到蛭石∶泥土為1∶1的基質(zhì)中遮強(qiáng)光培養(yǎng)1周，移到試驗(yàn)田，其成活率達(dá)100％。
實(shí)施例2培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2.5mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培養(yǎng)基。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)96.67％，植株再生率為78.3％。
實(shí)施例3培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加3.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.125mg/L噻重氮苯基脲TDZ；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.1mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.25mg/L的1/2培養(yǎng)基。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)97.06％，植株再生率為77.5％。
實(shí)施例4培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加4.0mg/L2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.03mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.25mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及1.0mg/LCuSO4；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.25mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.10mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.25mg/L的1/2培養(yǎng)基。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)99.67％，植株再生率為79.3％。
實(shí)施例5培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于采用的外植體為早草早熟禾品種‘午夜極品’(Midnight)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基中添加2.5mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/Lmg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培養(yǎng)基。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)95.06％，植株再生率為75.3％。
實(shí)施例6培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于采用的外植體為早草早熟禾品種‘百蒂雅’(Bartitia)。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為添加3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D和0.05mg/L噻重氮苯基脲TDZ的MSM培養(yǎng)基；繼代培養(yǎng)基中添加3.0mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ以及0.6mg/LCuSO4；胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加0.3mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.08mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ；植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加噻重氮苯基脲TDZ0.2mg/L的1/2培養(yǎng)基。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)96.5％，植株再生率為74.86％。
實(shí)施例7培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于采用的外植體為早草早熟禾品種‘新歌來德’(Nuglade)。各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基及外源激素等用量同實(shí)施例2。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)95.43％，植株再生率為75.46％。
實(shí)施例8培養(yǎng)程序均按實(shí)施例1進(jìn)行，所不同之處在于采用的外植體為草地早熟禾品種‘納蘇’(Nassau)。各培養(yǎng)階段的培養(yǎng)基及外源激素等用量同實(shí)施例3。所得愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)96.67％，植株再生率為70.75％。
附表1MS基本培養(yǎng)基成分

附表2N6基本培養(yǎng)基成分

附表3CC基本培養(yǎng)基成分

附表4NB基本培養(yǎng)基成分

附表5MSM基本培養(yǎng)基成分

權(quán)利要求
1.一種建立草地早熟禾再生體系的方法，其特征在于以草地早熟禾成熟種子為外植體，進(jìn)行培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于所述方法包括四個(gè)培養(yǎng)階段(1)外植體培養(yǎng)誘導(dǎo)愈傷組織(2)愈傷組織繼代培養(yǎng)(3)愈傷組織誘導(dǎo)體細(xì)胞胚(4)體細(xì)胞胚再生植株，其中(1)(2)為黑暗培養(yǎng)，(3)為200～400勒克斯的弱光培養(yǎng)，光照時(shí)間為16h/d，(4)為2000～3000勒克斯的光培養(yǎng)，光照時(shí)間為16h/d，整個(gè)培養(yǎng)過程，培養(yǎng)溫度為20℃～30℃，每培養(yǎng)20天換新鮮培養(yǎng)基。
3.按照權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于第(1)階段的基本培養(yǎng)基是MS培養(yǎng)基、N6培養(yǎng)基、NB培養(yǎng)基、CC培養(yǎng)基或MSM培養(yǎng)基其中之一，第(2)(3)階段的基本培養(yǎng)基為MSM，第(4)階段的基本培養(yǎng)基為1/2MS。四個(gè)階段所用激素為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D、萘乙酸NAA、6-芐基氨基腺嘌呤6-BA、噻重氮苯基脲TDZ和激動(dòng)素KT的組合中選擇出的任何一種、兩種或三種，在第(1)階段，愈傷組織的采用間接誘導(dǎo)，在第(2)培養(yǎng)基中還添加Cu2+，第(4)階段采用的基本培養(yǎng)基為大量元素用量減半的MS培養(yǎng)基，蔗糖為15g/L。
4.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的間接誘導(dǎo)是指將草地早熟禾無菌種先進(jìn)行萌芽誘導(dǎo)，后將整個(gè)種子接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中再誘導(dǎo)愈傷組織。
5.按照權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于在第(1)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D 1～5mg/L，噻重氮苯基脲TDZ0.05～1.0mg/L，在第(2)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為2，4-二苯氧乙酸2，4-D0.1～5mg/L，激動(dòng)素KT0.05～3mg/L，另外還添加了硫酸銅CuSO40.1～1.0mg/L。在第(3)階段的培養(yǎng)基中所用外源激素及其濃度為0.005～0.5mg/L2，4-二苯氧乙酸2，4-D，0.01～0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ，在第(4)階段的培養(yǎng)基為不使用激素的MS培養(yǎng)基，其中大量元素減半，蔗糖用量減至15g/L。
6.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于該方法包括以下步驟(1)外植體經(jīng)間接誘導(dǎo)后，接種于添加1～5mg/L 2，4-二苯氧乙酸2，4-D、0.01～0.2mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培養(yǎng)基；(2)誘導(dǎo)得到的愈傷組織接種于添加2.0～3.0mg/L 2，4-二苯氧乙酸2，4-D，0.02～0.3mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培養(yǎng)基，進(jìn)行兩次繼代培養(yǎng)，繼代周期20天；(3)選擇胚性愈傷組織接種于添加0.1-1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸2，4-D，0.05～0.3mg/L mg/L噻重氮苯基脲TDZ的培養(yǎng)基；弱光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為200～400勒克斯，(5)誘導(dǎo)得到的體細(xì)胞胚接種于僅添加噻重氮苯基脲TDZ0.05～1mg/L的培養(yǎng)基，見光培養(yǎng)，光照強(qiáng)度為2000～3000勒克斯。
全文摘要
本發(fā)明涉及以草地早熟禾成熟種子為材料建立其再生體系的方法，主要步驟包括將無菌種子播于無菌芽床誘導(dǎo)萌發(fā)后再誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，經(jīng)繼代培養(yǎng)、胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)及植株再生誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得高頻再生植株。培養(yǎng)過程中除植株再生是在含噻重氮苯基脲TDZ的1/2MS培養(yǎng)基上進(jìn)行的外，其它培養(yǎng)階段均在含2，4－二氯苯氧乙酸2，4－D和噻重氮苯基脲TDZ(或激動(dòng)素KT)不同濃度配比的MSM培養(yǎng)基培養(yǎng)。間接誘導(dǎo)愈傷組織可明顯提高愈傷組織的誘導(dǎo)率；繼代培養(yǎng)過程添加Cu
文檔編號(hào)A01H4/00GK1749391SQ20051009007
公開日2006年3月22日 申請(qǐng)日期2005年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2005年8月12日
發(fā)明者孫振元, 韓蕾, 孫碧波, 錢永強(qiáng), 王濤 申請(qǐng)人:中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所