專利名稱：一種用于殺螨的植物提取物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高效、低毒、環(huán)保型殺螨的植物提取物，尤其是涉及一種用于殺螨的植物提取物。
背景技術(shù)：
螨病是由癢螨科和疥螨科的螨類寄生于動物體表或表皮內(nèi)所引起的體外寄生蟲病，患病動物生產(chǎn)性能下降，消化吸收機(jī)能降低，消瘦，甚至造成動物個(gè)體或大批死亡，同時(shí)也威脅人類的健康。螨病不僅直接影響畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，增加飼養(yǎng)與治療成本，對畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失，而且還危害皮革加工等相關(guān)產(chǎn)業(yè)，如疥螨在皮內(nèi)穿孔，挖鑿隧道，癢螨在皮膚表面形成結(jié)節(jié)，直接影響皮革的利用價(jià)值。畜禽螨呈接觸性傳播，健康畜禽接觸患病動物或有螨蟲存在的畜舍和器具會導(dǎo)致感染。而離開宿主的螨蟲，其生活期限因溫度、濕度和陽光照射強(qiáng)度等多種因素而異，短者數(shù)周，長者數(shù)月。有的宿主在感染螨病后的相當(dāng)一段時(shí)間內(nèi)可以不表現(xiàn)出任何癥狀，但卻處于“帶螨狀態(tài)”，潛伏期的螨病患畜以及攜帶螨的非易感動物都是本病的感染源和重要散播因素。但由于不表現(xiàn)任何癥狀，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中不易被發(fā)現(xiàn)，防治具有相當(dāng)難度。美國在20世紀(jì)初，經(jīng)過40余年努力幾乎根除了牛癢螨病，但70年代該病又出現(xiàn)大規(guī)模暴發(fā)。
畜牧業(yè)生產(chǎn)中用于螨病治療的藥物有生物合成藥、有機(jī)農(nóng)藥和植物藥三大類。其中，生物合成類以阿維菌素和伊維菌素為代表，這些大環(huán)內(nèi)酯類抗生素易在肉、乳等畜產(chǎn)品中殘留，有關(guān)其抗藥性的報(bào)道也已出現(xiàn)。因此，從長遠(yuǎn)和環(huán)保的角度考慮應(yīng)減少其使用量。
有機(jī)農(nóng)藥類殺蟲殺螨劑包括敵百蟲、殺蟲脒、林丹等。這些有機(jī)磷、有機(jī)氯、有機(jī)氮類農(nóng)藥雖然效果顯著，但毒性較大易造成人畜中毒，且不易分解，可在畜產(chǎn)品、土壤、水體中長期殘留，直接或間接進(jìn)入食物鏈，并經(jīng)生物鏈富集后再次進(jìn)入動物或人體內(nèi)，引起急性或慢性中毒。
植物類殺蟲藥在我國的應(yīng)用歷史悠久，但長期以來由于缺乏系統(tǒng)研究而未被重視，近年來關(guān)于傳統(tǒng)植物藥殺蟲活性的系統(tǒng)研究逐漸增多，有些業(yè)已被開發(fā)為商業(yè)殺蟲劑。但總的來看，這些植物藥多具有毒性，如魚藤、狼毒和苦楝皮等，且生產(chǎn)應(yīng)用中也易造成動物中毒，特別是對集約化飼養(yǎng)和群養(yǎng)動物危害嚴(yán)重；而一些毒性較低的植物源殺蟲劑，如橘皮、苦參等的活性成分，在原植物中卻含量較低，生產(chǎn)成本高，生產(chǎn)應(yīng)用也受到極大限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為了解決上述背景技術(shù)中的不足之處，提供一種用于殺螨的植物提取物，其中丁香酚(eugenol)為高效活性成分，其對家兔等動物的癢螨和疥螨均具有良好殺滅作用，且效果接近于臨床殺螨效果最佳的生物合成類藥物伊維菌素，為一種高效、低毒、環(huán)保型的殺螨新藥。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為一種用于殺螨的植物提取物，其特殊之處在于所述植物提取物為丁香提取物。
上述丁香提取物為丁香醇提取物。
上述丁香提取物為丁香石油醚部位提取物。
上述丁香提取物的殺螨活性成分為丁香酚。
丁香醇提取物的制備步驟為藥材粉末2g，加工業(yè)酒精15ml，室溫浸泡30min，85□水浴熱回流提取2次，每次45min，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成含生藥50％的藥液。
丁香殺螨活性部位篩選的步驟為丁香粉末5g，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進(jìn)行水浴熱回流提取，每種溶劑提取4次，每次60min，合并分次提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物加食用油10ml，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成含生藥50％的藥液，離體殺螨試驗(yàn)篩選活性部位。
丁香酚的分離純化步驟為丁香石油醚部位提取物在200目硅膠柱中，依次用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯(500∶1，200∶1，100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1)洗脫，減壓回收溶劑，得丁香酚粗品。丁香酚粗品用乙醇溶解，在硅膠G薄層板上，用石油醚∶乙酸乙酯(12∶1)多次上行法展開，刮取Rf值0.35處的硅膠，40℃水浴回流提取2次，回收溶劑得丁香酚純化合物。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和效果如下1、高效性我們試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)0.1％濃度丁香酚體外殺死全部供試螨的時(shí)間為280min，1％濃度時(shí)為110min，當(dāng)濃度提高至10％時(shí)，4min使部分供試螨麻痹，10min使全部供試螨麻痹，復(fù)蘇偶見肢體顫動，25min可殺死全部試蟲。丁香酚的這種高效性，除阿維菌素、伊維菌素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和一些劇毒的化學(xué)農(nóng)藥外，目前已有系統(tǒng)研究和臨床普遍使用的其它中藥及其相關(guān)制劑，很少有能達(dá)到這種效果的。
2、低毒環(huán)保丁香酚原植物丁香及其制品等在日常生活中常被作為食用香料而廣泛使用，對人畜安全，且多數(shù)天然植物成分在環(huán)境中可自行降解，不致于在動物產(chǎn)品中長期殘留或通過食物鏈富集。丁香酚作為從這些植物中得到的活性天然成分，同樣具有低毒、安全和環(huán)保的特點(diǎn)。
3、資源豐富丁香酚廣泛存在于多種植物中，如丁香、丁香羅勒、肉豆蔻、肉蓯蓉、肉桂、細(xì)葉香桂葉、玫瑰、手掌參、山楂、檸檬等，其中在桃金娘科植物丁香中含量可高達(dá)10％以上。同時(shí)從這些植物中提取丁香酚的提取率高，成本低廉，生產(chǎn)工藝成熟。丁香酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，比較簡單，也容易合成。
丁香酚在各種動物的多種螨病的治療方面展現(xiàn)出廣闊的開發(fā)利用前景。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明對200味植物源性中藥的工業(yè)酒精提取物，用吐溫-80配成50％溶液，對兔癢螨(Psoroptes cuniculi)進(jìn)行離體殺螨試驗(yàn)，在240min以內(nèi)可殺死全部供試螨的有35味，其中丁香殺螨時(shí)間僅為15min，表現(xiàn)出較高的殺螨活性，進(jìn)一步經(jīng)溶劑部位分離、柱層析分離和薄層層析純化及活性追蹤，得到一種高效殺螨活性成分，其薄層層析行為和殺螨活性與丁香酚對照品一致，確定這種高效殺螨活性成分為丁香酚。
1材料與方法1.1試驗(yàn)材料1.1.1供試藥物中藥200味，均購自陜西省藥材公司采購供應(yīng)站；伊力佳(0.1％伊維菌素注射液)，北京中農(nóng)華威科技有限公司，2003.0222；丁香酚(eugenol)對照品，購自中國藥品生物制品檢定所。
1.1.2供試螨蟲采自自然感染螨病的家兔。病兔耳廓長滿血痂，靠近耳道內(nèi)側(cè)痂皮濕潤，呈團(tuán)塊狀，外部相對稍干燥，呈卷紙狀，患兔瘙癢不安。螨蟲經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)寄生蟲教研組鑒定為兔癢螨(Psoroptes cuniculi)。
1.1.3主要試劑工業(yè)酒精，石油醚(沸程30-60℃)，氯仿，乙酸乙酯，正丁醇，乙醚，吐溫-80，食用油。無水硫酸鈉；硅膠G，羧甲基纖維素鈉，香草醛，濃硫酸。
1.1.4主要儀器FZ102微型植物試樣粉碎機(jī)，RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，HH.SY21-Ni 6c電熱恒溫水浴鍋，SHB-B型循環(huán)水式多用真空泵，XDS-IB型倒置顯微鏡，90-1型特大功率攪拌器，凹形載玻片等。
1.2試驗(yàn)方法1.2.1殺螨活性中藥篩選1.2.1.1中藥提取物制備藥材粉末2g，加工業(yè)酒精15ml，室溫浸泡30min，85□水浴熱回流提取2次，每次45min，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成含生藥50％的藥液(即每毫升相等于原藥材0.5g的溶液)。
1.2.1.2離體殺螨試驗(yàn)在凹孔玻璃板上滴加數(shù)滴50％藥液，將活性強(qiáng)的螨蟲6只放入藥液中，倒置顯微鏡下觀察，同時(shí)進(jìn)行溶劑對照試驗(yàn)。每隔10min觀察1次，直至6只螨全部死亡，分別記錄螨麻痹或死亡時(shí)間。
1.2.2丁香殺螨活性部位篩選丁香粉末5g，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進(jìn)行水浴熱回流提取。每種溶劑提取4次，每次60min，合并分次提取液，減壓回收溶劑，得5種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物加食用油10ml，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成含生藥50％的藥液，離體殺螨試驗(yàn)篩選活性部位。
1.2.3丁香殺螨活性成分分離純化(1)柱層析分離石油醚部位提取物1g在200目硅膠柱中，依次用石油醚，石油醚∶乙酸乙酯(500∶1，200∶1，100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1)洗脫，收集洗脫液，減壓回收溶劑，TLC檢測，合并相同部分，離體殺螨試驗(yàn)檢測活性。
(2)薄層層析純化柱層析分離的有效成分粗品，用乙醇溶解，在硅膠G薄層板(105□活化0.5～1h)上，用石油醚和乙酸乙酯(12∶1)混合溶液多次上行法展開。用5％香草醛硫酸溶液對部分薄層板顯色，標(biāo)記色斑位置，刮取未顯色部分的相應(yīng)位置處的硅膠，40□水浴熱回流提取2次，收集提取液，加入適量的無水硫酸鈉靜置，過濾，回收溶劑得純活性物。
純活性物用食用油配成1％、0.1％、0.01％不同濃度的藥液，并用10％、1％、0.1％、0.01％的丁香酚對照品和0.1％伊維菌素進(jìn)行活性比較試驗(yàn)。
2試驗(yàn)結(jié)果2.1殺螨活性中藥的篩選試驗(yàn)結(jié)果在供試的200味中藥中，離體殺螨時(shí)間在240min以內(nèi)的共35味，其中丁香表現(xiàn)出較高的殺螨活性，50％的工業(yè)酒精提取物3min時(shí)即可使部分供試螨麻痹，8min時(shí)全部試蟲麻痹，復(fù)蘇時(shí)偶見肢體顫動，16min時(shí)可殺死全部供試螨，其殺螨時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于其他中藥，如百部、桔皮、狼毒、苦楝皮等(表1)。
表1 35味藥物工業(yè)酒精提取物對兔癢螨的離體殺滅效果

2.2丁香殺螨活性試驗(yàn)結(jié)果2.2.1丁香活性部位篩選試驗(yàn)結(jié)果丁香石油醚提取物20min、乙酸乙酯提取物53min、氯仿提取物105min可殺死全部供試螨，其中石油醚提取物3min即可使部分供試螨麻痹，12min可使全部供試螨麻痹。正丁醇提取物和蒸餾水提取物不具殺螨作用，丁香殺螨活性成分主要存在于石油醚提取物中(表2)。
表2 丁香不同提取部位對家兔癢螨的離體殺滅效果

注“-”表示120min內(nèi)不能殺死癢螨，“±”表示在120min內(nèi)可部分殺死癢螨。
2.2.2丁香殺螨活性成分純化結(jié)果2.2.2.1柱層析分離及殺螨試驗(yàn)結(jié)果根據(jù)TLC檢驗(yàn)結(jié)果合并相同組分，得5種不同組分，1～3組分50％濃度時(shí)，5min使部分供試螨麻痹，9min使全部供試螨麻痹，15min可殺死全部供試螨；4～51組分50％濃度時(shí)，3min使部分供試螨麻痹，6min使全部供試螨麻痹，10min可殺死全部供試螨，其余組分120min內(nèi)不能殺死全部供試螨。因此，殺螨主要成分集中在小極性組分中(表3，4)。
表3 丁香石油醚提取物的柱層析分離結(jié)果

注“++++”表示顯色非常明顯，斑點(diǎn)較大且規(guī)則；“+++”表示顯色明顯，斑點(diǎn)較大；“++”表示顯色較明顯，斑點(diǎn)較??；“+”表示顯色極淺且斑點(diǎn)較小。標(biāo)號1～6表示薄層板上由上到下Rf值不同的6個(gè)顯色區(qū)。
表4 丁香石油醚提取物柱層析分段殺螨效果

注“-”表示120min內(nèi)不能殺死癢螨，“±”表示在120min內(nèi)可部分殺死癢螨2.2.2.2薄層層析純化及殺螨試驗(yàn)結(jié)果TLC檢查表明，在展開劑為石油醚∶乙酸乙酯(12∶1)時(shí)，可顯Rf不同的6個(gè)顯色點(diǎn)，分別為1藍(lán)色，2紫紅色，3紫紅色，4紫色，5紫紅色，6黃色。將其分為三段第一段(合并1、2、3三個(gè)顯色點(diǎn))，第二段(合并4，5兩個(gè)顯色點(diǎn))，第三段(第6顯色點(diǎn))，Rf值為0.35，與丁香酚對照品相同，50％濃度時(shí)，3min使部分供試螨麻痹，8min使全部供試螨麻痹，12min可殺死全部供試螨，為高活性殺螨有效成分(表5)。
表5 薄層層析制備物離體殺螨試驗(yàn)結(jié)果

2.2.2.3殺螨活性比較試驗(yàn)結(jié)果0.1％丁香酚體外殺螨時(shí)間為280min，1％濃度時(shí)為110min，當(dāng)濃度提高至10％時(shí)，4min使部分供試螨麻痹，10min使全部供試螨麻痹，復(fù)蘇偶見肢體顫動，25min可殺死全部試蟲。其殺螨活性與丁香酚對照品相似。
表6 丁香酚離體殺螨活性比較試驗(yàn)結(jié)果


注“-”表示在6h內(nèi)不能殺死癢螨。括號內(nèi)表示使全部供試螨蟲麻痹的時(shí)間3.討論3.1關(guān)于中藥的殺螨作用我國傳統(tǒng)中藥防治寄生蟲病由來已久，《齊民要術(shù)》中就有用藜蘆治療羊疥的記載。但長期以來獸醫(yī)臨床中治療螨病時(shí)，多是數(shù)味中藥組成方劑后應(yīng)用，如“一掃光”、地骨皮散、木槿皮散等。近年來，有關(guān)植物源性殺螨劑的研究取得了長足進(jìn)展，一些中藥也已被相繼開發(fā)為商業(yè)殺螨劑，如擬除蟲菊酯類殺蟲劑，但其對光照和空氣均不穩(wěn)定。另外，煙葉、苦楝皮、狼毒等也都屬高效殺螨劑，但這些藥物具有一定毒性，使用不當(dāng)易造成動物中毒。一些高效、低毒的殺螨物質(zhì)，如橘皮、苦參中的殺螨活性成分，在原植物中的含量比較低。本試驗(yàn)對200多種傳統(tǒng)的植物源性殺蟲劑做了系統(tǒng)的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在240min以內(nèi)可殺死全部供試螨的有35味。植物源殺螨劑在環(huán)境中降解迅速，資源豐富，且具有可再生等優(yōu)點(diǎn)。因此，從傳統(tǒng)中藥中有望篩選出高效、低毒、環(huán)保型的殺螨新藥，并以這些藥物的有效成分為先導(dǎo)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，有可能獲得更高活性的殺螨劑，對于殺螨劑的研究開發(fā)具有重要意義。
3.2丁香的殺蟲及殺螨活性丁香水或醇提取液在體外對豬蛔蟲有麻痹或殺死作用。50％煎劑及乙醇浸劑在體外對豬蛔蟲有殺死作用，1％丁香油的混懸液即有殺死部分蛔蟲的作用。0.1～0.5g/kg口服對豬蛔蟲有驅(qū)除作用。丁香酚對蚊蟲有顯著的驅(qū)避作用。大葉丁香丙酮提取物對香蕉皮氏葉螨具有良好的毒殺作用，處理后72h的LD50值為4.31mg/mL其13.33mg/mL對皮氏葉螨的48h和72h校正死亡率分別為81.82％和95.35％，其6.67mg/mL對皮氏葉螨的72h校正死亡率為75.58％。丁香的正己烷和苯提取物對朱砂葉螨24h的校正死亡率分別為96.45％和98.56％，24h正己烷和苯提取物對朱砂葉螨的LC50分別為1.5333g/L和4.4393g/L，對朱砂葉螨具急性致死作用。同時(shí)，丁香酚及其類似物可直接導(dǎo)致塵螨死亡。丁香酚還可對蜂螨病起到控制作用。在本試驗(yàn)中，50％丁香醇提物殺死全部供試癢螨的時(shí)間為16min，表現(xiàn)出較高的殺滅癢螨的活性，進(jìn)一步經(jīng)溶劑部位分離、柱層析分離和薄層層析分離及活性追蹤，發(fā)現(xiàn)50％丁香酚殺癢螨時(shí)間為12min，為丁香的主要?dú)Ⅱ钚猿煞帧Ｄ壳?，除阿維菌素、伊維菌素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素和一些劇毒化學(xué)農(nóng)藥外，很少能達(dá)到這樣的殺螨效果。
3.3丁香酚的開發(fā)利用前景癢螨具有堅(jiān)韌的角質(zhì)表皮，對不利因素的抵抗力超過疥螨和其他肉食性螨類，離開宿主以后的耐受力顯得更強(qiáng)，在畜舍內(nèi)可存活2個(gè)月，在牧場上可存活35天，而疥螨在畜舍內(nèi)、墻壁上和各種器具上的存活時(shí)間不超過3周。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.1％、1％和10％濃度的丁香酚對可在280min、110min和25min時(shí)殺死全部供試癢螨，說明丁香酚對動物寄生性螨蟲有顯著殺滅作用。此外，丁香及其制品等在日常生活中常被作為食用香料而廣泛使用，對人畜安全，不致在動物產(chǎn)品中長期殘留或通過食物鏈富集，對土壤和水體無污染。丁香花蕾中揮發(fā)油含量為16％～19％，其中主要成分為丁香酚，含量占80％以上。此外，丁香酚廣泛存在于多種植物中，如丁香羅勒、肉豆蔻、肉蓯蓉、肉桂、細(xì)葉香桂葉、玫瑰、手掌參、山楂、檸檬等，丁香酚的化學(xué)結(jié)構(gòu)為4-烯丙基-2-甲氧基苯酚，比較簡單，也容易合成。因此，丁香酚有望成為一種高效、低毒、環(huán)保的新型殺螨劑，具有廣闊的開發(fā)利用前景。
權(quán)利要求
1.一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于所述植物提取物為丁香提取物。
2.據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于所述丁香提取物為丁香醇提取物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于所述丁香提取物為丁香石油醚部位提取物或丁香乙酸乙酯部位提取物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1、2或3所述的一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于所述丁香提取物的殺螨活性成分為丁香酚。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于丁香醇取物的制備步驟為藥材粉末2g，加工業(yè)酒精15ml，室溫浸泡30min，85℃水浴熱回流提取2次，每次45min，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味，用吐溫-80等助溶劑溶解，制成含生藥50％的藥液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種用于殺螨的植物提取物，其特征在于丁香殺螨活性部位篩選的步驟為丁香粉末5g，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、蒸餾水進(jìn)行水浴熱回流提取，每種溶劑提取4次，每次60min，合并分次提取液，減壓回收溶劑，得五種不同溶劑提取物，其中石油醚提取物加食用油10ml，其余溶劑提取物均用20％吐溫-80溶解，制成含生藥50％的藥液，離體殺螨試驗(yàn)篩選活性部位。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種用于殺螨植物提取物，其特征在于丁香酚的分離純化步驟為丁香石油醚部位提取物1g在200目硅膠柱中，依次用石油醚、石油醚∶乙酸乙酯(500∶1，200∶1，100∶1，50∶1，20∶1，10∶1，5∶1，3∶1)洗脫，減壓回收溶劑，得丁香酚粗品。丁香酚粗品用乙醇溶解，在硅膠G薄層板上，用石油醚∶乙酸乙酯(12∶1)多次上行法展開，刮取Rf值0.35處的硅膠，40℃水浴回流提取2次，回收溶劑得丁香酚純化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于殺螨的植物提取物，其中丁香酚(eugenol)為高效活性成分，其對家兔等動物的癢螨和疥螨均具有良好殺滅作用，為一種高效、低毒、環(huán)保型的殺螨新藥。本發(fā)明所述植物提取物為丁香醇提物、丁香石油醚部位提取物，丁香醇提物的殺螨活性成分為丁香酚。丁香醇提取物的制備步驟為藥材粉末2g，加工業(yè)酒精15ml，室溫浸泡30min，85□水浴熱回流提取2次，每次45min，合并提取液，減壓回收溶劑至無醇味,用吐溫－80等助溶劑溶解,制成含生藥50％的藥液。
文檔編號A01N65/28GK1718005SQ20051004193
公開日2006年1月11日 申請日期2005年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2005年4月11日
發(fā)明者宋曉平, 阮娜, 劉海龍, 豆傳娜, 唐賢寶, 陳杰 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)