專利名稱：蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法。
背景技術(shù)：
通常所言飼料蛋白(Feeding protein)即單細(xì)胞蛋白(Single cellprotein，SCP)，又稱微生物蛋白或菌體蛋白，是指酵母菌、真菌、霉菌、及非病性細(xì)菌等單細(xì)胞生物體內(nèi)所含蛋白質(zhì)，含量高達(dá)45％-74％，且各種氨基酸搭配合理、種類齊全，維生素和微量元素豐富，不含膽固醇等，這些優(yōu)點(diǎn)都是一般農(nóng)作物飼料所不能比擬的。
中國是世界上最大的蘋果產(chǎn)地，年產(chǎn)量2200多萬噸，比世界總產(chǎn)量的三分之一還多。陜西省又是我國最大的蘋果生產(chǎn)基地，目前全省蘋果種植總面積達(dá)602萬畝，年總產(chǎn)量550多萬噸，居全國第一位。從上世紀(jì)90年代以來，全國大量引進(jìn)蘋果濃縮汁加工生產(chǎn)線，僅陜西省就有二十多條，2003年生產(chǎn)蘋果濃縮汁達(dá)30萬噸，幾乎占到世界貿(mào)易總量的三分之一，出口三十多個(gè)國家和地區(qū)，成為全國最大的蘋果濃縮汁集中產(chǎn)區(qū)。在生產(chǎn)大量濃縮果汁的同時(shí)，每年僅陜西就要排放60多萬噸的蘋果渣。除少量曬干后，作為簡單飼料添加利用外，絕大部分因?yàn)樗趾扛?，蛋白含量低，營養(yǎng)價(jià)值低，極易腐爛發(fā)臭，無法全部利用。特別是水果加工旺季，果汁加工廠周圍，渣皮堆積如山，經(jīng)微生物分解，酸臭難聞，不但嚴(yán)重污染環(huán)境，而且造成巨大纖維素和半纖維素資源的浪費(fèi)。
利用果渣生產(chǎn)蛋白飼料是一條廢物利用的良好途徑，當(dāng)前利用(果渣)纖維素資源轉(zhuǎn)化為蛋白飼料的研究比較多。Joshi，VK(Bioresourcetechnology.1996，56，251-255)、Rahmat，H(World journal ofmicrobiology & biotechnology.1995，11(2)168-170)、Roussos，S.(Advances in solid-state fermentation.1997257-271)、Sandhu，D.K(Journal of Scientific & Industrial Research.1997，(56)286-90)等，以及張玉臻(食品與發(fā)酵工業(yè)，1996，329-32)、籍保平(生物工程進(jìn)展，1999，19(5)30-33)、張長霞(山東食品發(fā)酵，2003，420-22)、高再興(西北大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，33(6)701-704)、李巨秀(西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，31(增)79-81)、常顯波(西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)32(1)40-46)、張乃鋒(農(nóng)業(yè)新技術(shù)，2004，246-47)、王艷華(中國飼料，2004，835-35)、羅雯(科學(xué)技術(shù)與工程，2004，4(5)371-374)等分別報(bào)道了他們利用篩選的單菌種或混合菌種，采用單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵法以蘋果渣為主要原料發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的研究，由于初始培養(yǎng)基成分、采用菌種以及單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的不同，因此產(chǎn)物的蛋白含量不盡相同，從15％到35％均有報(bào)道。蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的過程是“氮素”的濃縮過程，例如發(fā)酵原料從20％的粗蛋白含量發(fā)酵到40％的含量，就需要一半質(zhì)量的碳水化合物在發(fā)酵過程中變成H2O和CO2，同時(shí)由于微生物的生長環(huán)境的客觀要求，蛋白含量不可能太高，蛋白含量在此沒有可比性。同時(shí)，對(duì)于發(fā)酵時(shí)間的選取也不盡相同，一般在48-108h之間。如中國專利申請(qǐng)03127919.8公開了一種蘋果渣雙菌發(fā)酵制備飼料蛋白的方法，其發(fā)酵時(shí)間也長達(dá)48-72h。總體考慮，單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵法存在種子培養(yǎng)基消耗多、接種量大、設(shè)備應(yīng)用相對(duì)較多及發(fā)酵時(shí)間較長等不足，從經(jīng)濟(jì)角度而言，投資與生產(chǎn)成本較高，對(duì)于生產(chǎn)飼料蛋白這種附加值較低的產(chǎn)品，工業(yè)化生產(chǎn)難于實(shí)施，目前仍處于實(shí)驗(yàn)研究和初步產(chǎn)業(yè)化階段。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種設(shè)備投資低、混合菌種共生與協(xié)同能力強(qiáng)、發(fā)酵時(shí)間短、蛋白含量等營養(yǎng)價(jià)值高、生產(chǎn)成本低廉、經(jīng)濟(jì)可行、適合工業(yè)化生產(chǎn)的蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法。本方法能克服現(xiàn)有的單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的種子培養(yǎng)基用量多，菌種純培養(yǎng)復(fù)雜，設(shè)備投資和生產(chǎn)成本高，發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較長的不足。、蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法(1)首先將粉碎的蘋果渣配料成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)然后接入種子培養(yǎng)成熟的混合菌種進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵；(3)最后將深層發(fā)酵液再接入到蘋果渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。
液態(tài)深層發(fā)酵參數(shù)為種子接種量5％-20％(v/v)；液態(tài)深層發(fā)酵時(shí)間24-48h；液態(tài)深層發(fā)酵溫度30-34℃。
固態(tài)發(fā)酵參數(shù)為轉(zhuǎn)接量15-40(mL/100g固態(tài)底物)；料層厚度3-5.5cm；固態(tài)發(fā)酵溫度30-34℃；固態(tài)發(fā)酵時(shí)間72-96h。
液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要由粉碎的蘋果渣、尿素、無機(jī)鹽和水組成。液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中固態(tài)成分及含量為蘋果渣78％-91％，蔗糖5％-10％，尿素1％-4％，(NH4)2SO41％-4％，KH2PO41％-4％，加入10-15倍固態(tài)物料的水成為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
蘋果渣固態(tài)培養(yǎng)基成分及含量為蘋果渣75％-85％，麩皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH4)2SO41％-3％，KH2PO42％-4％，加水調(diào)節(jié)初始含水量為50％-75％。
混合菌種含有產(chǎn)朊假絲酵母、果酒酵母、綠色木霉。菌種的體積混合比是產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母＝(3-4.5)∶(2-4)∶(1-2)；菌種的體積混合比也可以是產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母∶康寧木霉＝(2-4)∶(1-2)∶(6-8)∶(1-3)。
蘋果渣粒徑對(duì)液態(tài)發(fā)酵效果有顯著影響。粒徑越小，果渣在溶液中的分散越好，其營養(yǎng)物質(zhì)越有利于被微生物利用，在對(duì)數(shù)增長期，菌種生長繁殖的更加旺盛。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過60目篩的原料適宜生產(chǎn)應(yīng)用。
在菌種處于對(duì)數(shù)增長期時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)接，活菌種數(shù)量較多，分裂生長旺盛，適宜轉(zhuǎn)接。經(jīng)過深層液態(tài)的混合發(fā)酵，菌種之間的共生與協(xié)同能力變強(qiáng)，在固態(tài)發(fā)酵過程中，生長旺盛、速度快，能縮短停滯期和發(fā)酵時(shí)間。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在36h以前粗蛋白含量迅速增加，而后趨于平緩。即此時(shí)為較佳轉(zhuǎn)接時(shí)間。
減少轉(zhuǎn)接量意味著生產(chǎn)便利和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)量的增加，應(yīng)該在允許的范圍內(nèi)盡可能降低接種量。但太少，使發(fā)酵時(shí)間延長，蛋白含量低，同時(shí)發(fā)揮不了菌種優(yōu)勢(shì)，容易感染其他雜菌，產(chǎn)生異味，影響發(fā)酵產(chǎn)物的品質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明15-40mL/100g固態(tài)發(fā)酵底物即可滿足生產(chǎn)需要。
發(fā)酵時(shí)間是生產(chǎn)控制的重要參數(shù)。時(shí)間短，達(dá)不到理想的蛋白含量；但太長，蛋白增加不顯著，而生產(chǎn)周期變長，生產(chǎn)成本變大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明發(fā)酵72h以后，粗蛋白含量不再有明顯上升趨勢(shì)，即72h較佳時(shí)間選擇。而單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵需要96h以上，與單獨(dú)固態(tài)相比時(shí)間縮短24h，明顯縮短了生產(chǎn)周期，且粗蛋白含量有所增加。
與單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵相比較，該液固態(tài)發(fā)酵工藝的主要優(yōu)點(diǎn)1.種子培養(yǎng)基用量少，菌種純培養(yǎng)少，可以降低生產(chǎn)成本。
2.將三個(gè)或四個(gè)菌種進(jìn)行的單獨(dú)放大培養(yǎng)改變成為一個(gè)大發(fā)酵罐的混合培養(yǎng)，可以簡化生產(chǎn)工藝，減少設(shè)備投資。
3.提前將菌種進(jìn)行混合放大培養(yǎng)，既使混合工藝變得簡單，又使菌種之間提前相互適應(yīng)，共生與協(xié)同作用能力變強(qiáng)。
4.在進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵時(shí)，單位接種變大及混合菌種較強(qiáng)的共生和協(xié)同作用能力，能明顯縮短發(fā)酵時(shí)間和生產(chǎn)周期，設(shè)備利用率高，產(chǎn)量大。
5.同時(shí)生產(chǎn)的飼料蛋白產(chǎn)品，蛋白含量高，營養(yǎng)豐富，成本較低，更適合蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)和推廣應(yīng)用，為短缺的蛋白飼料提供一條新途徑。


附圖1為蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的液固態(tài)發(fā)酵工藝流程圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1種子培養(yǎng)基馬鈴薯200g，蔗糖20g，水若干；其制作方法為將馬鈴薯切成小塊，加適量的自來水沸煮20-30min，過濾，取濾液并加自來水至1000mL。
種子菌種的培養(yǎng)取300mL種子培養(yǎng)基置入500mL錐形瓶并在121℃下保持20min滅菌，冷卻室溫后接入每一個(gè)斜面菌種，在空氣浴搖床30-32℃，120-140rpm培養(yǎng)36-54h，得到培養(yǎng)成熟的種子菌種。
液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基組成為干蘋果渣90％，蔗糖5％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO41％。并加入10倍固態(tài)物料的水。
接入的混合菌種及比例產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母＝4∶3∶1.5，固態(tài)培養(yǎng)基組成為干蘋果渣75％，麩皮20％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO41％，加水調(diào)節(jié)初始含水量為60％。
鮮濕蘋果渣經(jīng)過熱風(fēng)干燥線75℃干燥并粉碎過篩后，取過60目的原料配制成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置入大型發(fā)酵罐，同時(shí)按10％(v/v)的量接入種子罐培養(yǎng)成熟的混合菌種，在32℃下，液態(tài)深層發(fā)酵36h，然后將深層發(fā)酵液按30mL/100g固態(tài)底物的量倒入配好的蘋果渣固態(tài)培養(yǎng)基中，在初始含水量65％不滅菌條件下，32℃固態(tài)培養(yǎng)72h后取出發(fā)酵樣品，經(jīng)干燥、造粒、包裝即得到蘋果渣飼料蛋白產(chǎn)品。
對(duì)比的單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)鮮濕蘋果渣經(jīng)過熱風(fēng)干燥線75℃干燥并粉碎后配料成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，其組成為干蘋果渣75％，麩皮20％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO41％。按10％(v/v)的量接入種子罐培養(yǎng)成熟的混合菌種(混合比例產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母＝4∶3∶1.5)，初始含水量65％，不滅菌條件下，32℃固態(tài)培養(yǎng)96h后取出發(fā)酵樣品，經(jīng)干燥、造粒、包裝即得到蘋果渣飼料蛋白產(chǎn)品。
進(jìn)行上述兩種不同發(fā)酵形式的產(chǎn)品主要成分、微量元素和氨基酸組成測(cè)定結(jié)果如表1、表2和表3所示表1 主要成分含量(％)粗蛋白 真蛋白粗脂肪 粗纖維 灰分發(fā)酵原料16.2810.02 8.94 16.684.25單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物28.4326.59 13.4710.846.52液固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物 29.0826.63 13.5610.327.85
表2 微量元素含量(mg/kg)Ca(％) Mg(％) Fe ZnMnCu SePb CdAs蘋果0.113 0.061 169.2 14.6 13.1 9.8 0.18 0.6 0.02 0.17渣發(fā)酵0.493 0.204 276.8 31.3 20.8 16.7 0.29 1.6 0.68 0.59產(chǎn)物表3 氨基酸含量(％)

測(cè)定方法粗蛋白的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T6432-86，即微量凱氏定氮法。
真蛋白的測(cè)定采用改進(jìn)的微量凱氏定氮法——稱取固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物5g，用40mL 75％乙醇浸提24h，充分?jǐn)嚢瑁闉V，濾渣再用40mL 75％乙醇反復(fù)洗滌2次，以洗去無機(jī)氮和尿素，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)。將沉淀于65℃下干燥至恒重，準(zhǔn)確稱取1g左右進(jìn)行硝化，再用微量凱氏定氮法測(cè)定，即上述國標(biāo)GB/T6432-86。
粗脂肪含量的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T6433-86，即索氏提抽法。
粗纖維含量的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T6434-86，即酸堿洗滌法。
灰分含量的測(cè)定采用國標(biāo)GB/T6438-86，即化灰法。
氨基酸的測(cè)定由西北農(nóng)林科技大學(xué)分析測(cè)試中心121-MB型氨基酸分析儀測(cè)定。
由上述測(cè)定結(jié)果可知，以蘋果渣為主要原料，經(jīng)混合菌種液固態(tài)發(fā)酵后，產(chǎn)物主要成分都發(fā)生明顯變化，粗蛋白、真蛋白、粗脂肪、灰分含量分別提高了78.62％、165.76％、51.67％和84.70％，而粗纖維則降低了38.13％，經(jīng)17種必要的氨基酸測(cè)定分析，其含量急劇提高且豐富、齊全，尤其是對(duì)于禽畜生長十分重要的絲氨酸、賴氨酸、酪氨酸和精氨酸等分別比發(fā)酵原料增率高達(dá)162.3％、275.2％、81.3％和89.4％，營養(yǎng)價(jià)值顯著增加。
由兩種不同工藝形式的發(fā)酵產(chǎn)品主要成分和氨基酸含量的比較可知，液固態(tài)發(fā)酵比單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵營養(yǎng)成分有所增加，也再次說明液固態(tài)發(fā)酵優(yōu)于單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵。
由微量元素的測(cè)定可知，有益元素含量豐富，而重金屬元素含量符合國家同類飼料基料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求。經(jīng)權(quán)威部門農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)中心(西安)檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)品，沙門氏菌均未檢出，黃曲霉毒素B10.0034mg/kg遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于同類飼料基料如麩皮、玉米(0.05mg/kg)等國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB13078-91)的要求。經(jīng)陜西省疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行毒理檢驗(yàn)，產(chǎn)品屬實(shí)際無毒級(jí)，可作為蛋白飼料廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖領(lǐng)域。
實(shí)施例2鮮濕蘋果渣經(jīng)過熱風(fēng)干燥線65℃干燥并粉碎過篩后，取過40目的原料按液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基置入大型發(fā)酵罐，液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為干蘋果渣90％，蔗糖4％，尿素2％，(NH4)2SO42％，KH2PO42％，并加入12倍固態(tài)物料的水分。同時(shí)按8％(v/v)的量接入種子罐培養(yǎng)成熟的混合菌種，其接入的菌種比例產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母∶康寧木霉＝2∶1.5∶6∶3，在33℃下，液態(tài)深層發(fā)酵36h，然后將發(fā)酵液按20mL/100g固態(tài)底物的量倒入配好的蘋果渣固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的組成為干蘋果渣84％，麩皮10％，尿素3％，(NH4)2SO42％，KH2PO41％。在含水量70％不滅菌條件下，33℃下固態(tài)培養(yǎng)78h后取出發(fā)酵樣品，干燥、造粒、包裝即得到蘋果渣飼料蛋白產(chǎn)品。其粗蛋白含量可達(dá)27.69％，真蛋白含量25.21％。
測(cè)定方法同上。
權(quán)利要求
1.蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于(1)首先將粉碎的蘋果渣配料成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基；(2)然后接入種子培養(yǎng)成熟的混合菌種進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵；(3)最后將深層發(fā)酵液再接入到蘋果渣固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于液態(tài)深層發(fā)酵參數(shù)為種子接種量5％-20％(v/v)；液態(tài)深層發(fā)酵時(shí)間24-48h；液態(tài)深層發(fā)酵溫度30-34℃。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于固態(tài)發(fā)酵參數(shù)為轉(zhuǎn)接量15-40(mL/100g固態(tài)底物)；料層厚度3-5.5cm；固態(tài)發(fā)酵溫度30-34℃；固態(tài)發(fā)酵時(shí)間72-96h。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意之一所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基和固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基主要由粉碎的蘋果渣、尿素、無機(jī)鹽和水組成。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中固態(tài)成分及含量為蘋果渣78％-91％，蔗糖5％-10％，尿素1％-4％，(NH4)2SO41％-4％，KH2PO41％-4％，加入10-15倍固態(tài)物料的水成為液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于蘋果渣固態(tài)培養(yǎng)基成分及含量為蘋果渣75％-85％，麩皮10％-20％，尿素2％-4％，(NH4)2SO41％-3％，KH2PO42％-4％，加水調(diào)節(jié)初始含水量為50％-75％。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意之一所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于混合菌種含有產(chǎn)朊假絲酵母、果酒酵母、綠色木霉。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于菌種的體積混合比是產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母＝(3-4.5)∶(2-4)∶(1-2)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法，其特征在于菌種的體積混合比是產(chǎn)朊假絲酵母∶綠色木霉∶果酒酵母∶康寧木霉＝(2-4)∶(1-2)∶(6-8)∶(1-3)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種蘋果渣液固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的方法。其生產(chǎn)工藝過程如下首先將粉碎的蘋果渣配料成液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，然后接入種子培養(yǎng)成熟的混合菌種進(jìn)行液態(tài)深層發(fā)酵，最后將深層發(fā)酵液再接入到蘋果渣的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。與單獨(dú)固態(tài)發(fā)酵相比較，該液固態(tài)發(fā)酵工藝具有種子培養(yǎng)基用量少，菌種純培養(yǎng)少，降低生產(chǎn)成本；生產(chǎn)的飼料蛋白產(chǎn)品，蛋白含量高，營養(yǎng)豐富，成本較低，更適合蘋果渣發(fā)酵生產(chǎn)飼料蛋白的工業(yè)規(guī)?；a(chǎn)和推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23K1/14GK1663421SQ20051004180
公開日2005年9月7日 申請(qǐng)日期2005年3月18日 優(yōu)先權(quán)日2005年3月18日
發(fā)明者宋紀(jì)蓉, 徐抗震, 黃潔, 馬海霞 申請(qǐng)人:西北大學(xué)