專利名稱：番茄純合體的快速培育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種番茄純合體的快速培育方法，用于番茄、茄子、辣椒等茄果類蔬菜新品種培育，屬于農(nóng)作物育種技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
番茄為嚴(yán)格的自花授粉植物，長(zhǎng)期的人工馴化和有性雜交，使其基因背景越來(lái)越窄，一些耐逆境基因及一些不易被人們味覺感知的品質(zhì)基因已很難在其栽培種中找到，但能在其野生近緣種中找到。例如，秘魯番茄的維生素C含量為栽培番茄的100倍之多；秘魯番茄、奇士曼尼番茄、潘那利番茄、醋栗番茄都表現(xiàn)出一定的耐鹽性等。
雖說(shuō)許多研究證明上述野生材料都能與栽培種通過(guò)有性雜交實(shí)現(xiàn)基因的轉(zhuǎn)移和重組，但由于后代遺傳性狀的分離必須進(jìn)行多代自交才能獲得純系，大大延長(zhǎng)了育種時(shí)間。通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)獲得單倍體植株，再經(jīng)染色體自然或人工加倍能快速得到純合二倍體。這種純合二倍體在遺傳上穩(wěn)定，不易發(fā)生性狀分離，因此，通過(guò)花藥或花粉培養(yǎng)能極早穩(wěn)定分離后代、縮短育種年限(倪丕沖，我國(guó)水稻花培育種及其應(yīng)用，農(nóng)業(yè)科技通迅，1991，(5)5～6)。
在蔬菜作物中，番茄自發(fā)的單倍體植株首先被發(fā)現(xiàn)，其次是石刁柏和辣椒。但由于單倍體的自然發(fā)生率極低(通常為0.002％-0.02％)，因此，人為地誘導(dǎo)形成單倍體植株引起了不少研究者的關(guān)注(董艷榮，龔義勤.茄果類蔬菜花藥和花粉培養(yǎng)研究進(jìn)展.長(zhǎng)江蔬菜，2001，530-32)。
在以往的研究中，大家習(xí)慣于通過(guò)核型分析的染色體計(jì)數(shù)來(lái)區(qū)別真假單倍體，有時(shí)會(huì)誤將花藥或花粉培養(yǎng)過(guò)程中自然加倍的純合二倍體丟棄，而忽略了培育單倍體的最終目的是為了獲得純合體這個(gè)事實(shí)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種新的番茄純合體的快速培育方法，能夠縮短育種周期，快速獲得番茄純合體。
為實(shí)現(xiàn)這樣的目的，本發(fā)明通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察后，選取適宜花藥進(jìn)行培養(yǎng)，獲得培養(yǎng)苗，再用SSR(Simple Sequence Repeats，簡(jiǎn)單序列重復(fù))分子標(biāo)記驗(yàn)證篩選出純合體。本發(fā)明方法的各個(gè)步驟如下①細(xì)胞學(xué)觀察將不同長(zhǎng)短的番茄花藥用碘-碘化鉀染色壓片檢查花粉發(fā)育時(shí)期，以確定用于花藥培養(yǎng)所需要的適宜花藥。
②外植體的制備于晴天10:00-15:00采集6-8mm長(zhǎng)的花蕾，置于4℃預(yù)處理2-5天。接種前將花蕾用70％酒精消毒30秒，然后用飽和的漂白粉上清液消毒5-7分鐘，然后經(jīng)無(wú)菌水沖洗3-4次。接著，在無(wú)菌條件下將花藥從花蕾取出，選取2-5mm長(zhǎng)的花藥(其內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核靠邊期)用于花藥培養(yǎng)。
③花藥培養(yǎng)將上述花藥接種于MS(Murashige and Skoog的基本培養(yǎng)基)，附加KT(激動(dòng)素)1.0mg/L，NAA(萘乙酸)0.5mg/L，蔗糖4％，瓊脂0.7％，pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期。
4-8周后，當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí)，將其接種于MS培養(yǎng)基附加BA(芐基腺嘌呤)2.0mg/L，IAA(吲哚乙酸)0.2mg/L，蔗糖2％，瓊脂0.7％，pH5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期。
④完整植株的獲得分化培養(yǎng)4周，當(dāng)愈傷組織分化出小植株時(shí)，切取小植株，并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)。兩周左右獲得完整植株。
⑤SSR分子標(biāo)記檢測(cè)篩選出純合體。
因?yàn)镾SR為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分純合體和雜合體。純合體的帶型應(yīng)該比雜合體(對(duì)照)少一條帶。雜合體的帶型則與對(duì)照相同。
本發(fā)明與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，有一定優(yōu)勢(shì)在番茄上常規(guī)育種技術(shù)從F1代開始到獲得純合體需要2-3年的時(shí)間，而本發(fā)明僅需要2.5-3個(gè)月，大大縮短了育種周期；與傳統(tǒng)的核型分析相比，本發(fā)明利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)純合體，大大提高了檢測(cè)效率，且不會(huì)丟失自然加倍的純合二倍體。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1于晴天上午10:00，采集鮮豐‘98-7’(Lycopersicon esculentum Mill.)×奇士曼尼番茄(Lycopersicon cheesmanii LA166)的F1代植株上長(zhǎng)度為6-8mm的花蕾，并將其置于4℃預(yù)處理3天。用碘-碘化鉀染色壓片確定花粉發(fā)育時(shí)期。將上述花蕾浸入70％酒精30秒，然后用10％～13％漂白粉飽和溶液表面消毒5-7分鐘，再用無(wú)菌水沖洗3-4次。在無(wú)菌條件下將花藥取出，選取2-5mm長(zhǎng)的花藥(其內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核期)接種于MS+KT1.0mg/L+NAA0.5mg/L+蔗糖4％+瓊脂0.7％，pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期。
當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí)，將其接種于MS+BA2.0mg/L+IAA0.2mg/L+蔗糖2％+瓊脂0.7％，pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行分化培養(yǎng)。培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期。
分化培養(yǎng)28天后，愈傷組織分化出小植株時(shí)，切取小植株，并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的培養(yǎng)基進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)2周獲得完整植株。SSR分子標(biāo)記檢測(cè)篩選出純合體基因組DNA(脫氧核糖核酸)提取和純化，參照方宣鈞等的CTAB(溴代十六烷基三甲胺)方法(方宣鈞，黃育民，陳啟鋒，等.若干水稻品種(組合)的等位酶和RAPD遺傳分析.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué).1999，32(2)1-8)。
SSR反應(yīng)SSR反應(yīng)體系為20～40ng左右模板DNA，MgCl2(氯化鎂)2.0mmol·L-1，dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)0.2mmol·L-1，引物0.4umol·L-1，Taq聚合酶0.65U，1×Taq Buffer(緩沖液)，總體積15μl。PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))反應(yīng)具體程序?yàn)?4℃ 2分鐘；94℃ 25秒，50℃ 25秒，68℃ 25秒，35循環(huán)；72℃ 8分鐘。
PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法一擴(kuò)增產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(6％，8mol·L-1尿素，1×TBE buffer(三氨基甲烷，乙酸，乙二胺四乙酸緩沖液))分離。預(yù)電泳30分鐘后上樣，電泳時(shí)使用60W恒功率，電泳1.5～2小時(shí)。銀染顯色固定液為0.5％的冰醋酸和10％的無(wú)水乙醇混合液，固定15分鐘左右；水洗；染色液為0.2％的AgNO3(硝酸銀)，染色時(shí)間為20分鐘；水洗，時(shí)間不超過(guò)10秒；顯影液為1.5％NaOH(氫氧化鈉)和0.5％甲醛；最后0.75％Na2CO3(碳酸鈉)定影。方法二擴(kuò)增產(chǎn)物用3％的瓊脂糖檢測(cè)，在紫外透射儀上觀察、拍照。
因?yàn)镾SR為共顯性標(biāo)記，能夠區(qū)分純合體和雜合體。純合體的帶型應(yīng)該比雜合體(對(duì)照)少一條帶。雜合體的帶型則與對(duì)照相同。
權(quán)利要求
1.一種番茄純合體的快速培育方法，其特征在于包括如下步驟1)將不同長(zhǎng)短的番茄花藥用碘-碘化鉀染色壓片檢查花粉發(fā)育時(shí)期，以確定用于花藥培養(yǎng)所需要的適宜花藥；2)于晴天10:00-15:00采集6-8mm長(zhǎng)的花蕾，置于4℃預(yù)處理2-5天，接種前將花蕾用70％酒精消毒30秒，再用飽和的漂白粉消毒5-7分鐘，然后經(jīng)無(wú)菌水沖洗，在無(wú)菌條件下將花藥從花蕾取出，選取2-5mm長(zhǎng)的花藥用于花藥培養(yǎng)，花藥內(nèi)的花粉發(fā)育時(shí)期為單核期；3)將上述花藥接種于MS培養(yǎng)基附加激動(dòng)素KT1.0mg/L、萘乙酸NAA0.5mg/L、蔗糖4％、瓊脂0.7％、pH5.8的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，10小時(shí)光/14小時(shí)暗的光周期；4-8周后，當(dāng)愈傷組織大小為2-3mm時(shí)，將其接種于MS培養(yǎng)基附加芐基腺嘌呤BA2.0mg/L、吲哚乙酸IAA0.2mg/L、蔗糖2％、瓊脂0.7％、pH5.8的培養(yǎng)基中進(jìn)行分化培養(yǎng)，培養(yǎng)室的條件25±1℃，光強(qiáng)25μmol.m-2.s-1，14小時(shí)光/10小時(shí)暗的光周期；4)分化培養(yǎng)4周，當(dāng)愈傷組織分化出小植株時(shí)，切取小植株，并將其接入MS+IAA0.2mg/L+蔗糖2％的生根培養(yǎng)基中，進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整植株；5)SSR分子標(biāo)記檢測(cè)篩選出純合體。
全文摘要
一種番茄純合體的快速培育方法，通過(guò)細(xì)胞學(xué)觀察選取適宜花藥進(jìn)行培養(yǎng)；將花藥接種于MS基本培養(yǎng)基+激動(dòng)素KT+萘乙酸NAA+蔗糖+瓊脂的培養(yǎng)基進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)培養(yǎng)；將具有一定大小的愈傷組織接種于MS+芐基腺嘌呤BA+吲哚乙酸IAA+蔗糖+瓊脂的培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)；切取分化的小植株，再接入MS+IAA+蔗糖的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整植株；再用簡(jiǎn)單序列重復(fù)SSR分子標(biāo)記驗(yàn)證篩選出純合體。本發(fā)明與傳統(tǒng)育種技術(shù)相比，大大縮短了育種周期，利用SSR分子標(biāo)記檢測(cè)純合體可提高檢測(cè)效率，且不會(huì)丟失自然加倍的純合二倍體。
文檔編號(hào)A01G1/00GK1650697SQ20051002403
公開日2005年8月10日 申請(qǐng)日期2005年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2005年2月24日
發(fā)明者陳火英, 張建華, 劉楊, 朱麗萍, 莊天明 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)