專利名稱：通過添加銅離子來使植物轉(zhuǎn)化效率提高的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于通過土壤桿菌屬細菌來高效地進行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒ā?br> 背景技術(shù)：
根據(jù)土壤桿菌法的基因?qū)?，是利用土壤桿菌機能的植物轉(zhuǎn)化方法。土壤細菌土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)具有下列機能感染植物時，使作為與土壤桿菌病原性相關(guān)的Ti(tumor-inducing)質(zhì)粒的一部分的T-DNA重組到植物基因組中。根據(jù)土壤桿菌法的植物轉(zhuǎn)化方法是下述方法制備將Ti質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域置換為希望向植物染色體組中導入的基因的轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒，使用制備成具有該轉(zhuǎn)化用質(zhì)粒代替了Ti質(zhì)粒的土壤桿菌，通過利用土壤桿菌的上述機能，將希望向該植物染色體組中導入的基因?qū)氲街参锶旧w組中的方法。
由于認為土壤桿菌僅以雙子葉植物為宿主，并不寄生在單子葉植物中，當初，根據(jù)土壤桿菌法的植物轉(zhuǎn)化法主要是作為雙子葉植物轉(zhuǎn)化法來發(fā)展的。之后，進行了關(guān)于根據(jù)土壤桿菌法向單子葉植物進行基因?qū)氲母鞣N各樣的嘗試，開發(fā)了具有強病原性土壤桿菌一部分病原性基因的超級雙元載體(super binary vector)，據(jù)報告，在使用該超級雙元載體的方法中，在水稻、玉米等單子葉植物中也穩(wěn)定，可以效率比較高的進行轉(zhuǎn)化(例如參考特許第2,649,287號公報；特許第3,329,819號公報；Hiei，Y.，等，(1994)，ThePlant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)。而且，報道了根據(jù)土壤桿菌法也在小麥、大麥以及高梁這樣的單子葉植物中轉(zhuǎn)化的成功例子(例如參考Cheng，M.，等，(1997)，PlantPhysiol.，Vol.115，p.971-980；Tingay，S.，等，(1997)，Plant J.，Vol.11，p.1369-1376；以及Zhao，Z-Y.，等，(2000)，Plant Mol.Biol.，Vol.44，p.789-798)，達到了在單子葉植物中也可廣泛進行根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化法，一般的具有效率高，被導入的基因復制數(shù)少，不用將叫做T-DNA的特定結(jié)構(gòu)域片斷化就可導入，因為通過短期培養(yǎng)就可獲得轉(zhuǎn)化體所以培養(yǎng)變異少等很多優(yōu)異的特征。因此，現(xiàn)在它作為在不論雙子葉還是單子葉的很多種類的植物中最有用的轉(zhuǎn)化手段而廣泛應用。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化方法，根據(jù)植物種類，受試材料、培養(yǎng)的培養(yǎng)基的組成不同，但共同點是不管是哪種植物，都是使組織材料與土壤桿菌懸濁液接觸，在共存培養(yǎng)后，進行轉(zhuǎn)化細胞的篩選，制備出轉(zhuǎn)化植物。一般地，形成材料的植物組織，視需要進行滅菌處理，但除此之外沒有特別的處理，進行土壤桿菌的感染(例如參考Rogers，S，G.，等，(1988)，Method for PlantMolecular Biology，p.423-436，CAAcademic Press Inc.；Visser，R.G.F.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B51-9，Kluwer Academic Publishers；McCormick，S.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B61-9，Kluwer Academic Publishers；以及Lindsey，K.，等(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B71-13，KluwerAcademic Publishers)。
根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化在很多種類的植物中都有報道，但也存在其轉(zhuǎn)化效率隨植物的種類、基因型以及形成材料的組織而有很大不同(例如參考Potrykus，I.，等，(1998)，Agricultural Biotechnology，NYMercel Dekker Inc.，p.119-159)的問題。在培育導入實用基因的品種時，制備出很多的轉(zhuǎn)化植物是必要的，通過一年而高效率地穩(wěn)定地獲得轉(zhuǎn)化植物的技術(shù)開發(fā)是重要的。還有，不依賴植物的種類或基因型的轉(zhuǎn)化法，在高效率地培育實用品種方面是極為有用的。而且，不依賴于形成材料的植物組織的轉(zhuǎn)化法的開發(fā)，也在高效率地促進轉(zhuǎn)化方面是必要的。
開發(fā)象這樣地使基因?qū)胄侍岣叩姆椒ā⒒蛘呤腔驅(qū)肜щy的植物種類或基因型也能進行轉(zhuǎn)化的方法是重要的。到現(xiàn)在，為了獲得效率良好的轉(zhuǎn)化植物，培養(yǎng)基組成的研究、標記基因或者啟動子的改變、受試材料的研究、受試材料處理方法的研究等各個側(cè)面的很多技術(shù)都有報道。例如，在受試材料的處理方法方面，報道了通過破壞組織結(jié)構(gòu)來提高感染效率的方法，還有，不破壞組織結(jié)構(gòu)將植物組織離心處理(例如參考國際公開第02/12520號小冊子；特開2000-342256)、加熱處理(例如參考特開2000-342255；特開2000-342253)的方法等。此外，本發(fā)明者們發(fā)現(xiàn)了將植物組織加壓處理對提高基因?qū)胄适怯杏玫?結(jié)果還未發(fā)表)。
此外，特別是在單子葉植物中，還存在玉米在根據(jù)土壤桿菌法的轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)化效率與水稻相比較低的問題。到目前，為了提高根據(jù)土壤桿菌法的玉米轉(zhuǎn)化中的轉(zhuǎn)化效率，進行了各種各樣的嘗試(例如參考Negrotto，D.，等，(2000)，Plant Cell Reports，Vol.19，p.798-803；Zhao，Z-Y.，等，(2001)，Mol.Breed.，Vol.8，p.323-333；Frame，B.R.，等，(2002)，Plant Physiol.，Vol.129，p.13-22；以及Ishida，Y.，等，(2003)，Plant Biotechnology，Vol.14，p.57-66)。作為為了提高土壤桿菌法的玉米轉(zhuǎn)化效率的種種嘗試，進行了在N6基本培養(yǎng)基中的轉(zhuǎn)化細胞篩選(例如參考Zhao，Z-Y.，等，(2001)，Mol.Breed.，Vol.8，p.323-333)、在培養(yǎng)基中添加硝酸銀以及羧芐西林(例如參考Zhao，Z-Y.，等，(2001)，Mol.Breed.，Vol.8，p.323-333；以及Ishida，Y.，等，(2003)，Plant Biotechnology，Vol.14，p.57-66)、在共存培養(yǎng)基中添加半胱氨酸(例如參考Frame，B.R.，等，(2002)，PlantPhysiol.，Vol.129，p.13-22)等，但其效果還是較低。對于象玉米這樣的，是主要谷物而轉(zhuǎn)化效率低的植物，不只是在制備實用轉(zhuǎn)化植物的時候、而且在確認新的基因效果的時候，也希望有轉(zhuǎn)化效率更高的轉(zhuǎn)化方法。
硫酸銅作為微量無機鹽存在于植物組織培養(yǎng)的多種培養(yǎng)基中。通常，在植物組織培養(yǎng)基中含有的硫酸銅的濃度是0.1μM。近年來，有報道在單子葉植物的組織培養(yǎng)以及轉(zhuǎn)化試驗中，通過在培養(yǎng)基中添加比通常高出50～500倍或500倍以上的硫酸銅顯示出種種效果。Ghaemi們(參考Ghaemi，M.，等，(1994)，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Vol.36，p.355-359)報道，通過將小麥的花藥在含有10mg/l的硫酸銅和2.5～5mg/l的硝酸銀的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提高了胚狀體(embryoid)的形成率。Zhang們(參考Zhang，S.，等，(1999)，PlantCell Reports，Vol.18，p.959-966)報道，通過將由完全成熟的大麥種子發(fā)芽的形成的小苗在含有5μM硫酸銅和30g/l麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，提高了苗條分裂組織培養(yǎng)(shoot meristematic culturesSMCs)的誘導率。認為麥芽糖在減少褐變組織方面具有效果，硫酸銅在促進苗條分裂組織培養(yǎng)被誘導時的小苗發(fā)育方面具有效果。此外，在通過將未成熟胚在含有硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)而得的愈傷組織中，再分化率和每個愈傷組織的再分化植物數(shù)增大，這在大麥(例如參考Dahleen，L.S.，(1995)，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Vol.43，p.267-269；以及Cho，M-J，等，(1998)，Plant Science，Vol.138，p.229-244)和水稻(例如參考Sahrawat，A.K.和Chand，S.，(1999)，J.Plant Physiol.，Vol.154，p.517-522)中有報告。而且，用含有硫酸銅的培養(yǎng)基誘導的具有綠色再分化能力的組織，被認為是適合作為轉(zhuǎn)化材料(例如參考Visser，R.G.F.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B51-9，Kluwer Academic Publishers；以及McCormick，S.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B61-9，Kluwer AcademicPublishers)。
Ishida們(參考Ishida，Y.，等，(2003)，Plant Biotechnology，Vol.14，p.57-66)將接種了土壤桿菌、進行了共存培養(yǎng)的玉米(品種是H99)未成熟胚，在含有1～100μM硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，考察從未成熟胚形成的愈傷組織。用含有1～10μM硫酸銅的培養(yǎng)基，愈傷組織形成率提高，但其效果很微弱。
象上述那樣通過在培養(yǎng)基中添加高濃度的硫酸銅，在單子葉植物的組織培養(yǎng)中可見種種效果的情況有所報道。然而，添加含銅離子的金屬鹽對基因?qū)胄室约?或轉(zhuǎn)化效率帶來的效果的調(diào)查報告，現(xiàn)在還沒有。
專利文獻1特許第2,649,287號公報專利文獻2特許第3,329,819號公報專利文獻3國際公開第02/12520號小冊子專利文獻4特開2000-342256專利文獻5特開2000-342255專利文獻6特開2000-342253專利文獻7美國專利第6,235,529號說明書專利文獻8美國專利第6,541,257號說明書專利文獻9國際公開第95/06722號小冊子非專利文獻1Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282.
非專利文獻2Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750.
非專利文獻3Cheng，M.，等，(1997)，Plant Physiol.，Vol.115，p.971-980.
非專利文獻4Tingay，S.，等，(1997)，Plant J.，Vol.11，p.1369-1376.
非專利文獻5Zhao，Z-Y.，等，(2000)，Plant Mol.Biol.，Vol.44，p.789-798.
非專利文獻6Rogers，S，G.，等，(1988)，Method for Plant MolecularBiology，p.423-436，CAAcademic Press Inc.
非專利文獻7Visser，R.G.F.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B51-9，Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻8McCormick，S.，(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B61-9，Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻9Lindsey，K.，等(1991)，Plant Tissue Culture Manual，B71-13，Kluwer Academic Publishers.
非專利文獻10Potrykus，I.，等，(1998)，Agricultural Biotechnology，NYMercel Dekker Inc.，p.119-159.
非專利文獻11Negrotto，D.，等，(2000)，Plant Cell Reports，Vol.19，p.798-803.
非專利文獻12Zhao，Z-Y.，等，(2001)，Mol.Breed.，Vol.8，p.323-333.
非專利文獻13Frame，B.R.，等，(2002)，Plant Physiol.，Vol.129，p.13-22.
非專利文獻14Ishida，Y.，等，(2003)，Plant Biotechnology，Vol.14，p.57-66.
非專利文獻15Ghaemi，M.，等，(1994)，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Vol.36，p.355-359.
非專利文獻16Zhang，S.，等，(1999)，Plant Cell Reports，Vol.18，p.959-966.
非專利文獻17Dahleen，L.S.，(1995)，Plant Cell，Tissue and Organ Culture，Vol.43，p.267-269.
非專利文獻18Cho，M-J，等，(1998)，Plant Science，Vol.138，p.229-244.
非專利文獻19Sahrawat，A.K.和Chand，S.，(1999)，J.Plant Physiol.，Vol.154，p.517-522.
非專利文獻20Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)，Transgenic Research，Vol.6，p.329-336.
非專利文獻21Amoah，B.，等，(2001)，Journal of Experimental Botany，Vol.52，p.1135-1142.
非專利文獻22Hoekema，A，等，(1983)，Nature，Vol.303，p.179-180.
非專利文獻23Komari，T.和Kubo T.，(1999)，Methods of GeneticTransformationAgrobacterium tumefeciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecularimprovement of cereal crops.，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.43-82.

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的課題本發(fā)明所要解決的課題在于，開發(fā)與現(xiàn)有的通過土壤桿菌屬細菌向植物中導入基因的方法中的植物基因?qū)胄氏啾?，更高效率地進行基因?qū)氲姆椒?。還有，開發(fā)與現(xiàn)有的通過土壤桿菌屬細菌向植物中導入基因的方法中的由植物受試組織的轉(zhuǎn)化細胞增殖率相比，更高效率地進行轉(zhuǎn)化細胞增殖的方法。還有，本發(fā)明所要解決的課題在于開發(fā)使用前述方法制作出轉(zhuǎn)化植物的方法。
解決課題的手段本發(fā)明者們?yōu)榻鉀Q上述問題銳意研究努力的結(jié)果是，發(fā)現(xiàn)通過使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基以土壤桿菌屬細菌向植物進行基因?qū)?，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基時相比，獲得穩(wěn)定高效率的基因?qū)耄约坝苫驅(qū)氲慕M織的穩(wěn)定高效率的細胞增殖。而且，發(fā)現(xiàn)使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基進行基因?qū)?，再加上在使土壤桿菌屬細菌感染植物材料之前，進行加熱、離心處理的話，獲得穩(wěn)定更高效率的基因?qū)?。此外，就基因?qū)肓说闹参锊牧?，進一步進行轉(zhuǎn)化體的篩選，發(fā)現(xiàn)使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基進行基因?qū)肓说闹参锊牧?，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基時相比，轉(zhuǎn)化效率飛躍性地提高。
因此，本發(fā)明是關(guān)于下述方法，其包括1)將植物材料進行處理，2)使土壤桿菌感染植物材料，通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒?，其特征在于，在上?)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
在本發(fā)明方法中，在培養(yǎng)基中高濃度添加的金屬鹽是含銅離子的金屬鹽。在本發(fā)明中使用的優(yōu)選金屬鹽是硫酸銅或葡糖酸銅，最優(yōu)選硫酸銅。硫酸銅中包括無水鹽以及含水鹽，不限定于任何一種。
在本發(fā)明方法中，所說提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基是指與作為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的N6基本培養(yǎng)基、MS(LS)基本培養(yǎng)基、B5基本培養(yǎng)基、NN基本培養(yǎng)基、NT基本培養(yǎng)基、Kao的基本培養(yǎng)基、White的基本培養(yǎng)基等基本培養(yǎng)基中含有的金屬鹽的濃度相比，含有高濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基。所說高濃度是指，比該基本培養(yǎng)基中含有的金屬鹽濃度還要高。
具體地，各基本培養(yǎng)基的金屬鹽濃度例如CuSO4·5H2O濃度是N6基本培養(yǎng)基中為0mg/l，MS(LS)基本培養(yǎng)基中為0.025mg/l，B5基本培養(yǎng)基中為0.025mg/l，NN基本培養(yǎng)基中為0.025mg/l，NT基本培養(yǎng)基中為0.025mg/l，Kao的基本培養(yǎng)基中為0.025mg/l，White的基本培養(yǎng)基中為0mg/l，在以這些基本培養(yǎng)基為基礎(chǔ)制備的培養(yǎng)基中，含有與該培養(yǎng)基中含有的硫酸銅濃度相比更高濃度的硫酸銅時，該培養(yǎng)基就是提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
本發(fā)明中的所謂含銅離子的金屬鹽是指，在所例舉的基本培養(yǎng)基中，一般不含有具有銅離子的金屬鹽，或者是含有微量的銅離子的金屬鹽。
列舉優(yōu)選濃度的例子的話，硫酸銅以及葡糖酸銅是1～100μM，優(yōu)選1～50μM，更優(yōu)選1～10μM。
在本發(fā)明的方法中，使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基的工序是1)制備植物材料的工序，以及/或2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中的任何工序。優(yōu)選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。更優(yōu)選至少在2)使土壤桿菌感染植物材料的工序中包含，在共存培養(yǎng)階段使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
在本發(fā)明的方法中，為了進一步提高基因?qū)胄剩谥苽渲参锊牧系墓ば?)、以及/或在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，也可以還包括對植物材料進行選自加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理的至少1種處理。植物材料的加壓處理是將該植物在液體培養(yǎng)基中以1.7～10atm進行加壓0.1秒～4小時，優(yōu)選以2.4～8atm進行加壓1秒～30分鐘。植物材料的熱處理可以根據(jù)文獻(特開2000-342255；以及特開2000-342253)所述的方法將植物材料進行處理，例如在33～60℃加熱5秒～24小時，優(yōu)選在46℃加熱3分鐘來進行。植物材料的離心處理，可以根據(jù)Hiei們的方法(國際公開第02/12520號小冊子；以及特開2000-342256)將植物材料進行處理，例如以100G～25萬G離心1秒～4小時，優(yōu)選以2萬G離心10分鐘來進行。關(guān)于超聲波處理，可以根據(jù)文獻(例如Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)，Transgenic Research，Vol.6，p.329-336；以及Amoah，B.，等，(200 1)，Journal ofExperimental Botany，Vol.52，p.1135-1142.)所述的方法來進行處理。
這些加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理可以任意進行1種，或者也可以多種組合進行。
本發(fā)明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之后，還可以包括以下工序3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，4)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化。
此外，本發(fā)明的方法，在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)之后，還可以包括以下工序，而且在以下的至少1個工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，4)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化。
本發(fā)明的基因?qū)敕椒?，在提高基因?qū)胄实耐瑫r，提高轉(zhuǎn)化效率，其結(jié)果是可以高效地得到轉(zhuǎn)化植物。因此，本發(fā)明是關(guān)于以使用本發(fā)明基因?qū)敕椒樘卣鞯霓D(zhuǎn)化植物的制造方法。
進一步，本發(fā)明者們就轉(zhuǎn)化植物材料方面發(fā)現(xiàn)，通過使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基使轉(zhuǎn)化體進行再分化，與使用通常濃度的含銅離子的金屬鹽的培養(yǎng)基時相比，促進再分化植物的生長。
因此，本發(fā)明是關(guān)于下述方法，它是進一步包括1)制備植物材料，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，4)將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化，以土壤桿菌屬細菌來進行植物材料轉(zhuǎn)化從而得到轉(zhuǎn)化植物的制備方法，其特征在于，在上述4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
此外，本發(fā)明是關(guān)于促進再分化植物生長的方法，其特征在于，在由脫分化的植物細胞使植物體再分化的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。在這種情況下，脫分化的植物細胞，是不是轉(zhuǎn)化細胞都可以，此外，如果是轉(zhuǎn)化細胞的情況下，是不是通過土壤桿菌法轉(zhuǎn)化的都可以。
使用土壤桿菌屬細菌進行的基因?qū)胍约稗D(zhuǎn)化方法使用土壤桿菌屬細菌進行的基因?qū)?，一般地包括以下工序a)制備植物材料的工序；b)制備含有具有期望導入基因的載體的土壤桿菌屬細菌的工序；c)使b)制備的土壤桿菌屬細菌感染工程a)制備的植物材料的工序；進一步，為了得到轉(zhuǎn)化體，在上述工序c)之后也可以實施d)篩選轉(zhuǎn)化細胞的工序；以及e)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化的工序。
具體地，在單子葉植物中，可以采用如文獻(特許第2,649,287號公報)所述的那樣，特征在于，如下的方法上述a)工序中用含有植物生長激素(例如2，4-D2，4-(二氯苯氧基乙酸))或者細胞分裂素等的培養(yǎng)基培養(yǎng)，將植物材料弄成脫分化的狀態(tài)或者在脫分化過程中的狀態(tài)，在上述c)工序中，使土壤桿菌感染植物材料；或者是采用如文獻(特許第3,329,819號公報)所述的那樣，特征在于如下的方法以該植物的未成熟胚作為植物材料，在上述a)工序中不對未成熟胚進行脫分化處理，在上述c)工序中用含有植物生長激素(例如2，4-D)或者細胞分裂素等的培養(yǎng)基培養(yǎng)。
關(guān)于工序a)在本說明書中，供基因?qū)氲摹爸参铩笔菃巫尤~植物以及雙子葉植物都包括。在單子葉植物中包括水稻、玉米、大麥、小麥、石刁柏(アスパラガス)、高梁和其他，但并不限于這些。雙子葉植物中包括煙草、大豆、馬鈴薯、棉花、向日葵和其他，但并不限于這些。優(yōu)選植物是單子葉植物，最優(yōu)選是玉米。
此外，所說“植物材料”非限定性的包括為以土壤桿菌法進行的轉(zhuǎn)化而提供的該植物的細胞、葉、根、莖、果實、及其他的任何部位的植物組織，未成熟胚，愈傷組織或者不定胚樣組織(以下在本說明書中稱作愈傷組織等，或者簡稱為愈傷組織)，或者整個植物體等植物所有的形態(tài)。
作為本發(fā)明方法中使用的植物形態(tài)，優(yōu)選未成熟胚和愈傷組織，最優(yōu)選未成熟胚。在本說明書中，所說的植物的細胞、組織、整個植物體采用的是在本技術(shù)領(lǐng)域中一般采用的意義。在本說明書中，所謂的未成熟胚是受粉后處于成熟過程的未成熟種子的胚。此外，供本發(fā)明方法所用的未成熟胚的階段(熟期)，沒有特別的限制，在受粉后的任何時期采摘的都可以。最優(yōu)選受粉后2天以后的未成熟胚。后述的轉(zhuǎn)化之后，以后述的方法，脫分化，優(yōu)選使用能夠誘導具有再長生成正常個體能力的愈傷組織的未成熟胚胚盤。此外，未成熟胚優(yōu)選近親交配、近親交配之間的F1、近親交配與自然受粉品種之間的F1、市售F1品種的未成熟胚。在本說明書中，所謂愈傷組織是指無秩序增殖的未分化狀態(tài)的細胞塊。為了得到愈傷組織，可以將植物組織分化的細胞置于含有植物生長激素(例如2，4-D)或者細胞分裂素等植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的培養(yǎng)基(叫做脫分化培養(yǎng)基)中培養(yǎng)得到。該為得到愈傷組織而做的處理叫做脫分化處理，該過程叫做脫分化過程。
在工序a)中，根據(jù)需要，將植物組織、未成熟胚等從植物體、種子等中取出，制備成轉(zhuǎn)化的適合材料。此外，根據(jù)期望，也可以將植物材料在用土壤桿菌感染之前培養(yǎng)。
本發(fā)明中，在工序a)中的植物材料制備過程以及/或工序c)中的使土壤桿菌感染過程中，以使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基為特征。此外，在工序a)中的植物材料制備過程中也可以進行加壓處理。
關(guān)于工序b)很久以前就已知土壤細菌的土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)引起很多雙子葉植物的冠癭病(crown gall disease)，在二十世紀70年代，發(fā)現(xiàn)Ti質(zhì)粒與病原性相關(guān)，而且作為Ti質(zhì)粒的一部分的T-DNA被重組到植物染色體組。之后明白了該T-DNA上存在與合成誘發(fā)腫瘤所必要的荷爾蒙(細胞分裂素和植物生長激素)相關(guān)的基因，盡管是細菌基因卻在植物中發(fā)現(xiàn)了。在切割T-DNA與向植物的傳遞中，在Ti質(zhì)粒上的病毒結(jié)構(gòu)域(vir結(jié)構(gòu)域)中存在的基因組是必要的，此外為了將T-DNA切出得到，T-DNA兩端上存在的邊界序列(ボ-ダ-配列)是必要的。作為其他的土壤桿菌屬細菌的毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)也具有根據(jù)Ri質(zhì)粒的同樣的系統(tǒng)(例如特開2000-342256的圖3和圖4)。
因為由于土壤桿菌的感染，T-DNA可以重組植物染色體組中，因此在T-DNA上插入期望的基因的話，期望能將該基因重組到植物染色體中。然而，因為Ti質(zhì)粒是190kb或190kb以上非常大，用標準的基因工程方法在質(zhì)粒上的T-DNA上插入基因是困難的。因此，開發(fā)了為在T-DNA上插入外源基因的方法。
首先，制備了從腫瘤性Ti質(zhì)粒的T-DNA上去除了荷爾蒙合成基因的解除型菌系(disarmed strains)LBA4404(參考Hoekema，A.，等，(1983)，Nature，Vol.303，p.179-180)、C58C1(pGV3850)、GV3Ti11SE等。通過使用這些，開發(fā)了2種方法將期望的基因?qū)氲酵寥罈U菌的Ti質(zhì)粒T-DNA中，或者將具有期望基因的T-DNA導入到土壤桿菌中。其中的一種是進行容易的基因操作就可能插入期望的基因方法，該方法通過三系雜交法(triparentalmating)，通過同源重組，將在大腸桿菌中能夠復制的中間載體導入到土壤桿菌的解除型Ti質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域中，稱作中間載體法。
還有一種是稱作雙元載體(binary vector)法，該法是基于在將T-DNA重組到植物中時，需要有病毒(vir)結(jié)構(gòu)域，但沒有必要為了機能而存在于同一質(zhì)粒上。在該vir結(jié)構(gòu)域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物生物技術(shù)事典(エンタプライズ株式會社發(fā)行(1989)))，所謂vir結(jié)構(gòu)域，是指包含全部virA、virB、virC、virD、virE以及virG。因此，雙元載體是將T-DNA重組到可在土壤桿菌和大腸菌雙方中復制的小質(zhì)粒中的東西，將其導入到具有解除型Ti質(zhì)粒的土壤桿菌中來使用。
在向土壤桿菌導入雙元載體時，可以通過電穿孔法和三系雜交法等公知的方法進行。在雙元載體中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以這些為基礎(chǔ)，構(gòu)建了大量的新型雙元載體用于轉(zhuǎn)化。此外，在Ri質(zhì)粒系統(tǒng)中，也構(gòu)建了同樣的載體用于轉(zhuǎn)化。
土壤桿菌A281是強病原性(super-virulent)菌系，其宿主范圍廣，轉(zhuǎn)化效率比其他菌系高。該特性是由于A281具有的Ti質(zhì)粒的pTiBo542。使用pTiBo542到目前開發(fā)了2種新系統(tǒng)。一種是使用了具有pTiBo542解除型Ti質(zhì)粒的菌系EHA101以及EHA105，由于適用于上述雙元載體系統(tǒng)，這些作為轉(zhuǎn)化能力高的系統(tǒng)而在各種植物的轉(zhuǎn)化中被利用。
還有一種是超級雙元載體(“super-binary”vector)(參考Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750；Komari，T.和Kubo T.，(1999)，Methods of GeneticTransformationAgrobacterium tumefaciens.In Vasil，I.K.(ed.)Molecularimprovement of cereal crops.，Kluwer Academic Publishers，Dordrecht，p.43-82；以及國際公開第95/06722號小冊子)系統(tǒng)(例如特開2000-342256的圖4)。由于該系統(tǒng)是由具有vir結(jié)構(gòu)域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也將這些各叫做“vir片斷結(jié)構(gòu)域”))的解除型Ti質(zhì)粒以及具有T-DNA的質(zhì)粒組成，因此是雙元載體系統(tǒng)的一種。但在使用超級雙元載體這點上是不同的，超級雙元載體是在具有T-DNA的端的質(zhì)粒上，即在雙元載體上，重組了基本上去除了vir片斷結(jié)構(gòu)域中至少一種vir片斷結(jié)構(gòu)域的vir結(jié)構(gòu)域片斷(其中優(yōu)選至少含有virB或virG的片斷，更優(yōu)選含有virB和virG的片斷)。此外，在具有超級雙元載體的土壤桿菌中導入重組了期望基因的T-DNA結(jié)構(gòu)域時，通過三系雜交法的同源重組可作為容易的手法來利用。
在本發(fā)明方法中，作為成為宿主的的土壤桿菌屬細菌，沒有特別的限制，可以優(yōu)選使用土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens)(例如上述的土壤桿菌LBA4404(參考Hoekema，A，等，(1983)，Nature，Vol.303，p.179-180)以及EHA101。
根據(jù)本發(fā)明的方法，只要是基于土壤桿菌屬細菌中病原性(vir)結(jié)構(gòu)域的基因組的表達的基因?qū)胂?，可以沒有特別的限制就得到有意義的效果。因此，對于上述的中間載體、雙元載體、強病原性雙元載體、超級雙元載體等中的任何載體系統(tǒng)都可以使用，可以取得本發(fā)明的效果。在使用將這些載體改變的不同載體系統(tǒng)時，也是同樣的(例如將土壤桿菌屬細菌vir結(jié)構(gòu)域的一部分或者全部切除，然后重組到質(zhì)粒中，將vir結(jié)構(gòu)域的一部分或者全部切除，作為新的質(zhì)粒的一部分導入到土壤桿菌中等)。此外，根據(jù)本發(fā)明的方法，在野生型的土壤桿菌屬細菌中，也可以提高野生型T-DNA結(jié)構(gòu)域向植物的導入效率，事實上提高感染效率。
期望向植物中導入的基因可以基于以下適當?shù)倪x擇標準來選擇可以通過常規(guī)方法重組到上述質(zhì)粒的T-DNA結(jié)構(gòu)域中的限制酶部位中，對在該質(zhì)粒上同時或者是以別的途徑重組的卡那霉素、巴龍霉素等藥物具有耐藥性的基因等。由于體積大，具有多數(shù)限制部位的，以通常亞克隆手法將期望的DNA導入到T-DNA結(jié)構(gòu)域內(nèi)不是都容易。在這樣的情況下，可以通過三系雜交法，利用土壤桿菌屬細菌細胞內(nèi)的同源重組，將目的DNA導入。盡管沒有限定，但被導入的基因的大小優(yōu)選是大約100bp～200kbp。
此外，將質(zhì)粒導入到Agrobactorium tumefaciens等土壤桿菌屬細菌中的操作可以通過現(xiàn)有方法進行，舉例的話包括上述的三系雜交法和電穿孔法、電子注射法、PEG等化學處理的方法。
要導入到植物中的基因，與現(xiàn)有技術(shù)一樣，基本上是配置在T-DNA的左右邊界序列之間的。然而，因為質(zhì)粒是環(huán)狀的，邊界序列的數(shù)可以是1，在要將多個的基因配置在不同部位上時，邊界序列也可以是3個或3個以上。此外，在土壤桿菌屬細菌中，可以配置在Ti和Ri質(zhì)粒上，或者也可以配置在其他質(zhì)粒上。甚至，也可以配置在多種類的質(zhì)粒上。
關(guān)于工序c)通過土壤桿菌屬細菌進行基因?qū)氲姆椒?，可以通過使植物材料與土壤桿菌屬細菌單獨的接觸來進行。例如，可以通過制備大約106～1011細胞/ml程度的細胞濃度的土壤桿菌屬細菌懸濁液，將植物材料在該懸濁液中浸漬3～10分鐘左右，在固體培養(yǎng)基上進行數(shù)日的共存培養(yǎng)來進行。
優(yōu)選在使土壤桿菌感染植物材料的同時，或者感染之后除去土壤桿菌之前，將植物材料與土壤桿菌共存培養(yǎng)。在共存培養(yǎng)中使用公知的培養(yǎng)基。例如，在實施例中使用的LS-AS培養(yǎng)基、nN6-As培養(yǎng)基、或者其他、N6S3-AS培養(yǎng)基、2N6-AS培養(yǎng)基(參考Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282)等培養(yǎng)基是已知的。
在本發(fā)明中，在使土壤桿菌感染植物材料的工序c)之前或者進行中時，也可以對植物材料進行選自以下的至少一種處理加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理。已知這些處理在通過土壤桿菌屬細菌向植物材料導入基因的方法中也會提高基因的導入效率。例如，關(guān)于離心處理，在文獻(例如國際公開第02/12520號小冊子；以及特開2000-342256)中被記載，優(yōu)選以100G～25萬G、進行離心1秒～4小時。關(guān)于熱處理，在文獻(例如特開2000-342255)中被記載，優(yōu)選在33℃～60℃的溫度范圍內(nèi)，進行熱處理5秒～24小時。進一步，關(guān)于超聲波處理，在文獻(例如Trick，H.N.和Finer，J.J.，(1997)，Transgenic Research，Vol.6，p.329-336；以及Amoah，B.，等，(2001)，Journal of Experimental Botany，Vol.52，p.1135-1142)中被記載。
這些加壓、加熱、離心、以及超聲波處理，可以進行任意1種，也可以多種組合來進行。例如Rogers，S，G.，等，(1988)，Method for Plant MolecularBiology，p.423-436，CAAcademic Press Inc.記載了關(guān)于將熱處理和離心處理組合來進行。
關(guān)于工序d)以及e)進一步根據(jù)期望，為了得到轉(zhuǎn)化體，在上述工序c)之后，必需進行d)篩選轉(zhuǎn)化細胞的工序；以及e)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化的工序即，一般地，為了進行植物的轉(zhuǎn)化，在將外源基因?qū)氲街参锛毎?，篩選外源基因穩(wěn)定地重組到染色體上的植物細胞是必要的。
在本發(fā)明中，在工序d)中的篩選轉(zhuǎn)化細胞的工序，以及/或在工序e)中的根據(jù)期望將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化的工序中，也可以使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
篩選被轉(zhuǎn)化細胞的工序是指，通過表型的數(shù)據(jù)以及/或者物理數(shù)據(jù)，篩選具有目的性狀的細胞。
表型的數(shù)據(jù)例如轉(zhuǎn)化效率可以通過進行以下評價來得到與期望導入到植物中的基因一起，導入標記基因以及/和選擇標記基因，評價其表達。作為標記基因以及/和選擇標記基因，可以使用例如GUS(β-葡糖醛酸酶)基因，以及/或耐抗生素基因(例如耐PPT(フオスフイノスライシン)基因，耐卡那霉素基因)等。作為標記基因使用GUS時，轉(zhuǎn)化的評價可以通過由X-gulc(5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸)的GUS的切割而伴隨的顯色來評價。作為選擇標記基因使用耐抗生素基因時，在轉(zhuǎn)化后，可以由在加有抗生素的選擇培養(yǎng)基上生長的情況來評價。
進一步，為了確認外源基因穩(wěn)定地重組到染色體上，也可以得到等的DNA印跡物理數(shù)據(jù)。此外，也可以進行向有性生殖后代的傳遞的工序、以及基于向后代基團的遺傳性以及分子性分析的選擇的工序。
也可以根據(jù)期望進行篩選的轉(zhuǎn)化體的再分化，培育再分化個體，然后得到完整的植物體。在由篩選的轉(zhuǎn)化細胞再生長成完整的植物體中，可以根據(jù)公知的方法(例如Hiei，Y.，等，(1994)，The Plant Journal，Vol.6，p.271-282；以及Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)進行。
本發(fā)明方法，與使用含有通常濃度金屬鹽的培養(yǎng)基的情況相比較，提高了基因?qū)胄室约?或轉(zhuǎn)化效率，以及/或促進再分化植物的生長?；?qū)胄士梢酝ㄟ^例如評價導入到基因的暫時性表達(一過的発現(xiàn))范圍來進行評價。在后面的實施例中，將未成熟胚的胚盤中的GUS基因的暫時性表達評價為1(分散地看到點狀的表達)～5(整個胚盤均見表達)的5個階段指數(shù)?；蛘撸谌w的表達量較低的情況下，也可以通過數(shù)所有的點數(shù)來評價。
轉(zhuǎn)化效率可以通過例如將由接種的未成熟胚得到的再分化植物中顯示了GUS基因表達的作為轉(zhuǎn)化體來計數(shù)，以接種的未成熟胚的數(shù)除其總數(shù)來算出?；蛘咭部梢酝ㄟ^將再分化植物中對于篩選壓力顯示出抵抗性的作為轉(zhuǎn)化體來計數(shù)，以接種的未成熟胚的數(shù)除其總數(shù)來算出。
再分化植物的生長促進可以通過例如在使用含有通常濃度金屬鹽的培養(yǎng)基的情況與使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基的情況時，比較其再分化植物的葉長、葉面積、以及/或重量來評價。
以下通過實施例具體地說明本發(fā)明，但本發(fā)明不被這些實施例所限制。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員基于本說明書的描述可以容易的在本發(fā)明上追加修飾、變更，這些也包含在本發(fā)明的技術(shù)范圍內(nèi)。
附圖的簡單說明


圖1為顯示通過向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，對玉米(A188)的GUS基因的暫時性表達方面帶來的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時性表達的部位的范圍進行數(shù)值化了的值，在0(沒有表達)～4(幾乎全部的胚盤都表達)的范圍內(nèi)進行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的“Cu x”(此處，x表示數(shù)字)，是表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度是xμM。
圖2為顯示對共存培養(yǎng)后玉米(H99)的愈傷組織形成方面，共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度帶來的效果圖。在圖的橫軸中的“Ag x”以及“Cu x”(此處，x表示數(shù)字)，是分別表示共存培養(yǎng)基中硝酸銀以及硫酸銅的濃度是xμM。
圖3為顯示對共存培養(yǎng)后玉米(A188)的抗フオスフイノスライシン(PPT)的愈傷組織形成方面，共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度帶來的效果圖。縱軸是將愈傷組織形成進行數(shù)值化了的值，在0(沒有愈傷組織形成)～3(整個胚盤都愈傷組織化)階段進行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的“Cu x”(此處，x表示數(shù)字)，是表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度是xμM。
圖4為顯示通過向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，對水稻(IR64)的GUS基因的暫時性表達方面帶來的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時性表達的部位的范圍進行數(shù)值化了的值，在0(沒有表達)～4(幾乎整個胚盤都表達)范圍內(nèi)進行數(shù)值化。圖的橫軸中顯示的“Cu 5”是表示共存培養(yǎng)基中的硫酸銅濃度是5μM。
圖5為顯示通過向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對玉米(A188)的GUS基因的暫時性表達方面帶來的效果圖?？v軸是將顯示出GUS基因暫時性表達的部位的范圍進行數(shù)值化了的值，在0(沒有表達)～4(幾乎整個胚盤都有表達)內(nèi)進行數(shù)值化。
圖6為顯示通過向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對玉米(A188)形成愈傷組織方面帶來的效果圖?？v軸是將愈傷組織形成進行數(shù)值化了的值，在0(沒有愈傷組織形成)～3(胚盤全部都愈傷組織化)的階段進行數(shù)值化。
圖7為顯示通過向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅，對水稻“雪光”品種的未成熟胚的增殖方面帶來的效果圖?？v軸是愈傷組織化的未成熟胚的重量，為每1個未成熟胚的平均值。橫軸的實驗1、2、3是顯示各自獨立進行的實驗。cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。Cu以及CG后面的數(shù)值表示各自共存培養(yǎng)基中的濃度(μM)。
圖8為顯示通過向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對從玉米(A188)轉(zhuǎn)化愈傷組織再分化生長成轉(zhuǎn)化植物方面帶來的效果圖?？v軸是再分化植物的葉長平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養(yǎng)基中的濃度中以10μM添加。
圖9為顯示通過向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅或者葡糖酸銅，對從水稻“雪光”品種轉(zhuǎn)化愈傷組織再分化生長成轉(zhuǎn)化植物方面帶來的效果圖?？v軸是再分化植物的葉長平均值。橫軸cont.表示不含硫酸銅或葡糖酸銅的對照、Cu表示硫酸銅、CG表示葡糖酸銅。硫酸銅以及葡糖酸銅在各自共存培養(yǎng)基中的濃度中以10μM添加。
實施例實施例1向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對玉米的轉(zhuǎn)化帶來的效果材料和方法無菌方式摘取受粉后第7天～第14天的玉米(品種A188、H99)的未成熟胚(大小為1.0～1.5mm)，用LS-inf液體培養(yǎng)基(LS無機鹽、0.5mg/L煙酸、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、1mg/L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇、1g/L酪蛋白水解物、1.5mg/L 2，4-D、68.5g/L蔗糖、36g/L葡萄糖、pH5.2；參考Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)洗凈1次。在一部分的未成熟胚中進行為了提高基因?qū)胄实那疤幚?46℃、3分鐘的熱處理以及15,000rpm、10分鐘的離心處理)。在含有100μM乙酰丁香酚(アセトシリンゴン)的LS-inf液體培養(yǎng)基中，混懸入大約1.0×109cfu/mL的Agrobacteriumtumefaciens LBA4404(pSB131)(具有在T-DNA結(jié)構(gòu)域中以菜花花葉病毒35S啟動子驅(qū)使的PPT(フオスフイノスライシン)耐性基因，以及在菜花花葉病毒35S啟動子上結(jié)合有蓖麻過氧化氫酶內(nèi)含子的GUS基因；參考Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)作為接種源。向摘取、洗凈的未成熟胚以及熱、離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。在含有5μM的AgNO3的LS-AS培養(yǎng)基(LS無機鹽、0.5mg/L煙酸、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、1mg/L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇、700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L 2，4-D、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、500mg/L MES、100μM乙酰丁香酚、8g/L瓊脂、pH5.8；參考Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750，固化劑是8g/L瓊脂)中添加了0～10μM濃度CuSO4.5H2O的共存培養(yǎng)基中，使接種了土壤桿菌的未成熟胚胚盤朝上地接種。
于25℃黑暗下培養(yǎng)3天后，將一部分的未成熟胚于含有0.1％的TritonX-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)中浸漬，37℃靜止1小時。用磷酸緩沖液除去土壤桿菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)以及20％甲醇的磷酸緩沖液。于37℃處理24小時后，于顯微鏡下觀察，考察呈藍色的組織的范圍。
將在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天的未成熟胚于LSD1.5培養(yǎng)基(LS無機鹽、0.5mg/L煙酸、0.5mg/L鹽酸吡哆醇、1mg/L鹽酸硫胺素、100mg/L肌醇700mg/L L-脯氨酸、1.5mg/L 2，4-D、20g/L蔗糖、500mg/L MES、8g/L瓊脂、pH5.8；參考Ishida，Y.，等，(1996)，Nature Biotechnology，Vol.4，p.745-750)上接種，于25℃黑暗下培養(yǎng)大約4周后，測定增殖的愈傷組織的直徑。另外，將在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7天的未成熟胚在含有5mg/L的フオスフイノスライシン(PPT)的LSD1.5培養(yǎng)基上接種，于25℃黑暗下培養(yǎng)1周后，于顯微鏡下觀察，考察愈傷組織形成的程度。進一步，將這些愈傷組織在含有10mg/L PPT的同樣培養(yǎng)基中，以同樣的條件培養(yǎng)6周。將增殖的抗PPT的愈傷組織在LSZ再分化培養(yǎng)基(從LSD1.5培養(yǎng)基中除去2，4-D，添加5mg/L玉米素)上接種，于25℃照明下培養(yǎng)2～3周。切取再分化的植物葉片，通過X-gluc考察GUS基因表達。
結(jié)果將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3天的未成熟胚(品種A188)通過X-gluc染色，將顯示GUS基因的暫時性表達的部位(呈藍色的部位)的范圍以0(沒有表達)～4(幾乎全部胚盤都有表達)5個階段來評價。
在含有1、5以及10μM的硫酸銅的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3天的未成熟胚，與在對照培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚相比，在胚盤的大部分范圍內(nèi)顯示出GUS基因的一過性發(fā)現(xiàn)。認為由于在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅而顯示GUS基因的一過性發(fā)現(xiàn)的范圍的增大是與有沒有熱、離心的前處理無關(guān)(
圖1)。由這些可知，通過在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅可提高基因?qū)胄省?br> 將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3天的未成熟胚(品種H99)在不含選擇壓力的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大約4周后，考察形成的愈傷組織的直徑。在含有5μM硝酸銀的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚，顯示與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的幾乎同樣的愈傷組織增殖。與此相對比的，在添加了10μM硫酸酮以及5μM硝酸銀的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚顯示，直徑的平均值比在對照共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚的大2mm或2mm以上，通過添加硫酸銅促進愈傷組織的增殖(圖2)。
在共存培養(yǎng)1周后，將在含有PPT的選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1周的未成熟胚(品種A188)以0(沒有愈傷組織形成)～3(胚盤全部都愈傷組織化)4個階段來評價增殖的愈傷組織。在添加了硫酸銅的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚，與在對照培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚相比，顯示高的愈傷組織形成，可知通過添加硫酸銅可提高轉(zhuǎn)化愈傷組織形成的效率(圖3)。進一步，通過將在含有PPT的培養(yǎng)基中進行選擇得到的愈傷組織，在含有PPT的再分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到抗PPT性植物。切取這些植物的葉片，研究GUS基因的表達。其結(jié)果為，在含有5以及10μM硫酸酮的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚中，與在不含硫酸銅的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未成熟胚相比較，顯示2～3倍高的轉(zhuǎn)化效率。
表1在共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對轉(zhuǎn)化效率帶來的效果

如上所示，向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅，具有提高通過土壤桿菌法的基因?qū)胄?、促進愈傷組織形成以及增殖、提高轉(zhuǎn)化效率的效果。
實施例2向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅對向水稻導入基因帶來的效果材料及方法將在含有50mg/L潮霉素(ハイグロマイシン)和50mg/L壯觀霉素(スペクチノマイシン)的AB培養(yǎng)基(3g/L KH2PO4、1g/L NaH2PO4、1g/L NH4Cl、300mg/L MgSO4.7H2O、150mg/L KCl、10mg/L CaCl2、2.5mg/L FeSO4.7H2O、5g/L葡萄糖、15g/L瓊脂、pH7.0；參考Chilton，M.-D.，等，(1974)，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，713672-3676)上培養(yǎng)了3～4天的Agrobacteriumtumefaciens超級雙元載體LBA4404(pSB134)(具有在T-DNA結(jié)構(gòu)域上結(jié)合有玉米泛激素啟動子驅(qū)使的泛激素(ユビキチン)內(nèi)含子的HPT基因(潮霉素耐性基因)，以及具有結(jié)合了以菜花花葉病毒35S啟動子驅(qū)使的蓖麻過氧化氫酶內(nèi)含子的GUS基因；pSB134的制備是在pKY205(參考WO 03/027290)上，通過將作為表達標記的由pSB32得來的35S-intron GUS-nos片斷插入到Hind III部位中來進行的)以白金接種環(huán)挑取，混懸于含有100μM乙酰丁香酚的大約109cfu/ml濃度的AA1液體培養(yǎng)基(AA主要無機鹽、LS微量無機鹽、MS維生素、AA氨基酸、0.2g/L酪蛋白水解物、4g/L蔗糖、2g/L葡萄糖，pH5.2)1ml中。向放入了無菌摘取的未成熟胚(品種IR64)的埃彭道夫管中加入土壤桿菌懸濁液1ml，用旋渦混合器攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。將未成熟胚在nN6-As培養(yǎng)基(N6無機鹽、N6維生素、0.5g/L酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L蔗糖、10g/L葡萄糖、10μM AgNO3、100μM乙酰丁香酚、8g/L瓊脂糖、pH5.2)以及含有5μM的CuSO4.5H2O的nN6-As培養(yǎng)基上接種，于黑暗下在25℃培養(yǎng)1周。
結(jié)果將共存培養(yǎng)后的未成熟胚通過X-gluc染色，將顯示GUS基因的一過性發(fā)現(xiàn)的部位(呈藍色的部位)的范圍以0(沒有表達)～4(幾乎全部胚盤都有表達)5個階段來評價。
在含有5μM的硫酸銅的共存培養(yǎng)基中培養(yǎng)了1周的未成熟胚，與在對照培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚相比，在胚盤的大部分范圍內(nèi)顯示出GUS基因的一過性發(fā)現(xiàn)(圖4)。由這些可知，通過向共存培養(yǎng)基中添加硫酸銅提高基因?qū)胄?，不僅是在玉米中而且在水稻中也可見。
實施例3向共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸銅對向玉米導入基因帶來的影響材料及方法無菌方式摘取受粉后第7天～第14天的玉米(品種A188)的未成熟胚大小1.0～1.5mm，用LS-inf液體培養(yǎng)基洗凈1次。進行為了提高基因?qū)胄实那疤幚?46℃、3分鐘的熱處理以及15,000rpm、10分鐘的離心處理)。在含有100μM乙酰丁香酚的LS-inf液體培養(yǎng)基中，混懸入大約1.0×109cfu/mL的Agrobacterium tumefaciens LBA4404(pSB131)作為接種源。向熱、離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。在含有5μM的AgNO3的LS-AS培養(yǎng)基中添加了0～10μM濃度葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基中，使接種了土壤桿菌的未成熟胚胚盤向上接種。
于25℃黑暗下培養(yǎng)3天后，將一部分的未成熟胚于含有0.1％的TritonX-100的0.1M磷酸緩沖液(pH6.8)中浸漬，于37℃靜置1小時。在磷酸緩沖液中除去土壤桿菌后，添加含有1.0mM 5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)以及20％甲醇的磷酸緩沖液。于37℃處理24小時后，于顯微鏡下觀察，考察呈藍色的組織的范圍。
另外，將在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了7天的未成熟胚中的愈傷組織形成，以0(無愈傷組織形成)、1(胚盤的一部分愈傷組織化)、2(胚盤的大約一半愈傷組織化)、3(胚盤的3/4以上愈傷組織化)的指數(shù)進行評價。
結(jié)果將在各種培養(yǎng)基中培養(yǎng)了3天的未成熟胚(品種A188)通過X-gluc染色，將顯示GUS基因的一過性發(fā)現(xiàn)的部位(呈藍色的部位)的范圍以0(沒有表達)～4(在胚盤的幾乎全部都有表達)5個階段來評價。在含有1、5以及10μM的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3天的未成熟胚，與在對照培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚相比，在胚盤的大部分范圍內(nèi)顯示出GUS基因的暫時性表達(圖5)。
考察了在共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)了1周的未成熟胚的愈傷組織形成。在含有1、5以及10μM的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基上培養(yǎng)的未成熟胚，與在不含葡糖酸銅的培養(yǎng)基共同培養(yǎng)的未成熟胚相比，每種都顯示高愈傷組織形成。尤其是在含5以及10μM的葡糖酸酮的共存培養(yǎng)基中的，與對照相比，顯示有意義的高愈傷組織形成(圖6)。
由這些可知，通過在共存培養(yǎng)基中添加葡糖酸酮，與添加硫酸銅時一樣，可提高基因?qū)胄室约坝鷤M織形成率。
實施例4向接種源液體培養(yǎng)基中添加硫酸銅以及葡糖酸銅對向水稻導入基因帶來的影響材料及方法將在含有50mg/L潮霉素和50mg/L壯觀霉素的AB培養(yǎng)基上培養(yǎng)了3～4天的Agrobacterium tumefaciens超級雙元載體LBA4404(pSB134)以白金接種環(huán)挑取，混懸于含有100μM乙酰丁香酚以及0～50μM的CuSO4.5H2O或者葡糖酸銅的大約109cfu/ml濃度的AA1液體培養(yǎng)基1ml中。向放入了無菌摘取的未成熟胚(品種“雪光”)的埃彭道夫管中加入土壤桿菌懸濁液1ml，用旋渦混合器攪拌30秒后，于室溫靜置5分鐘。將未成熟胚在nN6-As培養(yǎng)基上接種，于黑暗下在25℃培養(yǎng)1周。
結(jié)果測定了共存培養(yǎng)后未成熟胚的重量。盡管進行了3次試驗，但在每個試驗中，當在接種源液體培養(yǎng)基中加入硫酸銅或者葡糖酸銅的情況下，與沒有添加的對照未成熟胚相比，顯示出旺盛的增殖(圖7)?？芍?，通過添加硫酸銅以及葡糖酸銅對愈傷組織增殖的促進，不只是在共存培養(yǎng)基而且是在接種源的液體培養(yǎng)基中添加時也同樣可見。
實施例5向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對玉米轉(zhuǎn)化植物的生長帶來的影響材料和方法在玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0～1.5mm)上接種Agrobacteriumtumefaciens LBA4404(pSB131)，通過在含有PPT的LSD1.5培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化愈傷組織。將轉(zhuǎn)化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，于含有10μM的CuSO4.5H2O或者葡糖酸銅以及PPT的LSZ再分化培養(yǎng)基上接種。在照明下，于25℃培養(yǎng)3周，測定再分化植物的葉長。
結(jié)果在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養(yǎng)基中再分化的植物的葉長，與在對照再分化培養(yǎng)基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長，硫酸銅或者葡糖酸銅顯示促進再分化植物生長的效果(圖8)。
實施例6向再分化培養(yǎng)基中添加硫酸銅、葡糖酸銅對水稻轉(zhuǎn)化植物的生長帶來的影響材料和方法在水稻(品種“雪光”)的未成熟胚上接種Agrobacterium tumefaciensLBA4404(pSB134)，通過在含有潮霉素的nN6CC培養(yǎng)基(N6無機鹽、N6維生素、0.5g/L酪蛋白水解物、0.5g/L L-脯氨酸、1mg/L 2，4-D、0.5mg/L NAA、0.1mg/L 6BA、20g/L蔗糖、55g/L山梨醇、250mg/L頭孢噻肟(セフオタキシム)、250mg/L羧芐西林、5g/L凝膠劑(ゲルライト)、pH5.8)中培養(yǎng)得到轉(zhuǎn)化愈傷組織。將轉(zhuǎn)化愈傷組織切碎為大約2mm的大小，于含有10μM的CuSO4.5H2O或者葡糖酸銅以及潮霉素的N6R再分化培養(yǎng)基(主要無機鹽減到1/2的N6無機鹽、N6維生素、AA氨基酸、1g/L酪蛋白水解物、0.5mg/L激動素、20g/L蔗糖、30g/L山梨糖醇、4g/L凝膠劑(ゲルライト)、pH5.8)上接種。在照明下，于25℃培養(yǎng)3周，測定再分化植物的葉子長度。
結(jié)果在含有硫酸銅或者葡糖酸銅的再分化培養(yǎng)基中再分化的植物的葉長，與在對照再分化培養(yǎng)基中再分化的植物相比，顯示有意義的加長，硫酸銅或者葡糖酸銅具有促進再分化植物生長的效果，在水稻中也顯示出來(圖9)。
產(chǎn)業(yè)上的利用性本發(fā)明開發(fā)了比現(xiàn)有土壤桿菌法更高效率地進行基因?qū)氲牧畠r簡單的方法。此外，提供對認為用現(xiàn)有土壤桿菌法進行基因?qū)肜щy的植物種以及品種也適用的方法。本發(fā)明的方法，與使用含有通常濃度的金屬鹽的培養(yǎng)基的情況相比，可提高基因?qū)胄室约?或轉(zhuǎn)化效率，以及/或可促進再分化植物的生長。
如
圖1顯示的，通過使用含有高濃度硫酸銅的共存培養(yǎng)基，關(guān)于單子葉植物玉米的基因?qū)胄?，與使用不含硫酸銅的培養(yǎng)基相比較，提高了2～2.5倍。此外，還由于增加了加熱、離心處理，與使用不含硫酸銅的培養(yǎng)基以及未處理的植物材料時相比，基因?qū)胄侍岣吡?.5～3倍。
根據(jù)本發(fā)明，從提高植物土壤桿菌法的基因?qū)胄蔬@點，對以下做出了貢獻可以高效地得到多種轉(zhuǎn)化植物，容易地有效地培育導入有實用基因的品種。尤其，單子葉植物其中有玉米，由于用現(xiàn)有土壤桿菌法轉(zhuǎn)化效率低，通過本發(fā)明方法提高了轉(zhuǎn)化效率，意義很大。
權(quán)利要求
1.一種通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒ǎ?)制備植物材料，然后2)使土壤桿菌感染植物材料，其特征在于，在上述1)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中金屬鹽是硫酸銅或葡糖酸銅。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中金屬鹽是硫酸銅。
4.權(quán)利要求1～3中任一項所述的方法，其中至少在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，使用提高了金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
5.權(quán)利要求1～4中任一項所述的方法，其中至少在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，使用提高了硫酸銅或葡糖酸銅濃度的培養(yǎng)基。
6.權(quán)利要求1～5中任一項所述的方法，其中至少在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，使用含有1～50μM、優(yōu)選1～10μM的硫酸銅或葡糖酸銅的培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求1～6中任一項所述的方法，其中在制備植物材料的工序1)、以及/或使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中，還包括對植物材料進行選自以下的至少1種處理加壓處理、熱處理、離心處理、以及超聲波處理。
8.權(quán)利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物是單子葉植物。
9.權(quán)利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物是玉米。
10.權(quán)利要求1～7中任一項所述的方法，其中植物是水稻。
11.權(quán)利要求1～10中任一項所述的方法，其中植物材料是未成熟胚。
12.權(quán)利要求1～11中所述的方法，其中在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中+之后，還包括以下工序3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，4)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化。
13.權(quán)利要求1～11中所述的方法，其中在使土壤桿菌感染植物材料的工序2)中之后，還包括以下工序并且至少在以下的1個步驟中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，4)根據(jù)期望，將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化。
14.轉(zhuǎn)化植物的制備方法，其特征在于，使用權(quán)利要求12或13所述的方法。
15.一種以土壤桿菌屬細菌來進行植物材料轉(zhuǎn)化從而得到轉(zhuǎn)化植物的制備方法，包含1)制備植物材料，2)使土壤桿菌感染植物材料，3)篩選轉(zhuǎn)化細胞，且4)將篩選的轉(zhuǎn)化體進行再分化，其特征在于，在上述4)的工序中使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
16.權(quán)利要求15所述的方法，其中金屬鹽是硫酸銅或葡糖酸銅。
17.權(quán)利要求15或16所述的方法，其中金屬鹽濃度是1～50μM，優(yōu)選1～10μM。
18.權(quán)利要求15～17中任一項所述的方法，其中植物是單子葉植物。
19.權(quán)利要求15～17中任一項所述的方法，其中植物是玉米。
20.權(quán)利要求15～17中任一項所述的方法，其中植物是水稻。
21.權(quán)利要求15～20中任一項所述的方法，其中植物材料是未成熟胚。
22.一種促進再分化植物生長的方法，其特征在于，在由脫分化植物細胞再分化成植物體的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。
全文摘要
本發(fā)明提供一種包含1)將植物材料進行處理，然后2)使土壤桿菌感染植物材料，通過土壤桿菌屬細菌來進行將基因?qū)氲街参锊牧现械姆椒?，其特征在于在上?)以及/或2)的工序中，使用提高了含銅離子的金屬鹽濃度的培養(yǎng)基。本發(fā)明還提供以采用基因?qū)敕樘卣鞯霓D(zhuǎn)化植物的制造方法。
文檔編號A01H4/00GK1836040SQ20048002322
公開日2006年9月20日 申請日期2004年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者石田佑二 申請人:日本煙草產(chǎn)業(yè)株式會社