專利名稱：利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種內(nèi)生菌的分離方法，具體涉及一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的殺滅白蟻的藥劑均為化學(xué)藥劑，故都有很大的毒副作用，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，該方法通過微生物生產(chǎn)對人畜無毒或低毒的可以抗白蟻的化合物。本發(fā)明是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對白蟻共生菌作抑菌試驗；(四)用對白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對白蟻進(jìn)行飼喂試驗。本發(fā)明從能抗白蟻的樹木之中分離其內(nèi)生菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)獲得其代謝產(chǎn)物，利用代謝產(chǎn)物抑制白蟻體內(nèi)有較強(qiáng)木質(zhì)素、纖維素分解能力的共生菌，進(jìn)而做白蟻的飼喂試驗，結(jié)果證明能夠抑制白蟻共生菌的樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物也對白蟻有較好的抑制作用。本發(fā)明采用從白蟻體內(nèi)分離的有較強(qiáng)木質(zhì)素、纖維素分解能力的共生菌作為指示菌，先通過牛津杯法作抑菌試驗檢驗從Western Red Cedar和Port-orford-cedar中分離出內(nèi)生菌的發(fā)酵產(chǎn)物對白蟻共生菌是否有抑制作用，進(jìn)而用對白蟻的共生菌有抑制作用的發(fā)酵產(chǎn)物浸泡濾紙片對白蟻進(jìn)行飼喂試驗。經(jīng)過白蟻的藥物飼喂試驗，并且經(jīng)過統(tǒng)計分析表明試驗組白蟻取食濾紙片的量明顯比對照組少，而實(shí)驗組白蟻的死亡率明顯多于對照組，差異極其顯著；從白蟻的活動情況上來看實(shí)驗組的白蟻活動比對照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。對白蟻的共生菌有較好抑制作用的發(fā)酵產(chǎn)物對白蟻也有較好的殺滅作用，而且二者有呈線性關(guān)系的趨勢，這就為殺白蟻生物藥劑的篩選及快速檢測提供了一種簡潔而可行的新的途徑。
具體實(shí)施例方式
具體實(shí)施例方式
一本實(shí)施方式是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對白蟻共生菌作抑菌試驗；(四)用對白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對白蟻進(jìn)行飼喂試驗。所述抗白蟻樹木為Western Red Cedar和port-orford-cedar。
具體實(shí)施例方式
二本實(shí)施方式是這樣利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌從而實(shí)現(xiàn)抗白蟻方法的一、材料的選取1、Western Red Cedar(2003年9月10日取樣于美國路易斯安納州)2、port-orford-cedar(2003年9月取樣于美國俄勒岡州)3、黑翅土白蟻(Odontotermes formosanus)(取樣于中國武漢市珞珈山)4、美國白蟻(取樣于美國路易斯安納州立大學(xué))二、培養(yǎng)基的配制(一)指示菌培養(yǎng)基1、纖維素培養(yǎng)基1.1細(xì)菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na(羧甲基纖維素鈉簡稱CMC)10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、瓊脂20g、水1000ml。
1.2真菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、瓊脂20g、水1000ml。
1.3放線菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na10g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g、水1000ml。
1.4酵母菌纖維素培養(yǎng)基CMC-Na5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸鈉8.2g、瓊脂20g、水1000ml。
2、木質(zhì)素培養(yǎng)基2.1木質(zhì)素的制備稱取2g鋸末，用定性濾紙包好，放入索氏抽提器中，加入苯醇混合液(苯∶乙醇＝2∶1)，置沸水浴中抽提6小時(控制抽提液循環(huán)次數(shù)每小時4次)；抽提完后，將試樣取出風(fēng)干，轉(zhuǎn)入已預(yù)冷的12～15℃含15ml 72％的濃硫酸的250ml具塞錐形瓶中，塞緊瓶塞，搖蕩1min，使試樣全部浸漬在酸液中，然后恒溫在18～20℃下保溫2.5小時，并經(jīng)常搖動錐形瓶；保溫后轉(zhuǎn)入1000ml錐形瓶中，加345ml蒸餾水稀釋至酸濃度為3％，保持其濃度不變煮沸4小時，靜置，過濾，將濾渣烘干到恒重，即為木質(zhì)素。
2.2細(xì)菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素10g、NH4H2PO40.5g、K2HPO42.0g、MgSO42.0g、MnSO4·H2O2.5mg、FeSO4·7H2O7.5mg、NaCl0.3g、蛋白胨10g、瓊脂20g、水1000ml。
2.3真菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素10g、NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、蛋白胨4g、尿素1g、瓊脂20g、水1000ml。
2.4放線菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素5g、KNO31g、NaCl0.4g、K2HPO40.5g、MgSO40.5g、FeSO4·7H2O0.01g、瓊脂20g、水1000ml。
2.5酵母菌木質(zhì)素培養(yǎng)基木質(zhì)素5g、酵母膏1g、KCl1.8g、醋酸鈉8.2g、瓊脂20g、水1000ml。
(二)樹木內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)基1、水瓊脂浸汁培養(yǎng)基用滅過菌的解剖刀將5g紅柏木材切成小塊，加入100ml水煮沸30min，取20ml樹木浸汁，加入15～20g瓊脂，加水至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌30min后，分裝到培養(yǎng)皿內(nèi)備用。
2、查氏培養(yǎng)基NaNO32g、K2HPO41g、KCl0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、瓊脂20g、水1000ml。
3、PDA培養(yǎng)基馬鈴薯200g、蔗糖20g、水1000ml、瓊脂20g。
4、S-7培養(yǎng)基葡萄糖1g、果糖3g、蔗糖6g、醋酸鈉1g、蛋白胨1g、維生素B11mg、維生素H1mg、維生素B61mg、泛酸鈣1mg、MgSO43.6mg、Ca(NO3)26.5mg、Cu(NO3)21mg、ZnSO42.5mg、MnCl25mg、FeCl32mg、苯丙氨酸5mg、苯酸鈉100mg、1mol/l的KH2PO4緩沖液1ml、水1000ml、pH自然。
(四)抑菌試驗所用的培養(yǎng)基雙層培養(yǎng)基在平皿中傾入10ml素瓊脂，在37℃溫箱中過夜檢菌，把無菌牛津杯立在素瓊脂平板上，傾入15ml混有菌懸液的半固體培養(yǎng)基，待半固體培養(yǎng)基凝固后，用無菌鑷子拔出牛津杯。
三、方法1、從白蟻中分離共生菌a、將從蟻巢中收集的白蟻切去頭部和胸部，腹部置于已滅菌的培養(yǎng)皿中，用0.1％升汞消毒1～2min或者用75％的乙醇消毒3～4min，用無菌水沖洗3次后，無菌操作將20只白蟻腹部轉(zhuǎn)入消過毒的研缽中，研磨成勻漿，勻漿作一系列的稀釋備用，與此同時，將消過毒的白蟻腹部于計數(shù)培養(yǎng)基平板上滾動擦拭，此平板與計數(shù)平板一起培養(yǎng)，以檢驗白蟻表面消毒是否徹底，如果消毒不徹底，需要重新操作；b、用移液槍取0.2ml白蟻勻漿，分別加入細(xì)菌、真菌、酵母菌、放線菌的纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基平板中，用涂棒涂布均勻，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)，其它菌在28℃下培養(yǎng)；c、3～7d后上述纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基長出菌，用三區(qū)劃線法分離出單菌落，鑒定產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱后轉(zhuǎn)入斜面保存，從中挑選出產(chǎn)酶能力相對較高的菌株作為備用的指示菌；2、從Western Red Cedar和port-orford-cedar中分離樹木內(nèi)生菌a、用刀將樹枝切成1.0～1.5厘米的小段；b、用0.1％的升汞處理樹木小段1～4min，倒掉升汞，再用蒸餾水清洗3次除去殘留的升汞，或者用75％的乙醇處理樹木小段3～8min，再用蒸餾水清洗3次；c、把處理過的小木塊接入水瓊脂浸汁培養(yǎng)基中，3～5d分離培養(yǎng)基上的長出菌；d、用三區(qū)劃線法把菌分別接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨固體培養(yǎng)基中，分離出單菌落，然后分別把分離到的菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨斜面中，得到樹木內(nèi)生菌菌種，初步鑒定分為細(xì)菌、真菌、放線菌、酵母菌四大類。
3、牛津杯法作抑菌試驗
a、發(fā)酵液的制備將分離純化所得的樹木內(nèi)生菌菌種分別接種到相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在28℃、100r/min的條件下細(xì)菌培養(yǎng)2～3d，其他菌培養(yǎng)5～6d；將培養(yǎng)液以3500r/min離心分離10～15min，取上清液，傾入無菌錐形瓶，在無菌條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃恒溫水浴、150r/min條件下濃縮至其體積的十分之一，放入4℃冰箱中保存，作為備用的發(fā)酵液。
b、用牛津杯法作抑菌實(shí)驗用從白蟻體內(nèi)分離到的有木質(zhì)纖維素分解能力的菌作為指示菌，取a步驟所述的發(fā)酵液作為抑菌物做抑菌實(shí)驗制備素瓊脂平板1000ml水加20g的瓊脂，滅菌，倒平板，每個平板倒10～15ml的素瓊脂，把牛津杯立在素瓊脂平板上。
菌懸液的制備取5ml無菌水，加到指示菌(以白蟻的內(nèi)生菌為指示菌)的斜面上，在斜面上用接種環(huán)輕輕的刮擦，再用無菌移液管吸打混勻，做系列稀釋備用。
半固體培養(yǎng)基的制備分別取查氏、牛肉膏蛋白胨、馬丁氏、麥?zhǔn)?、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入0.75％的瓊脂。
取20ml半固體培養(yǎng)基加入小錐形瓶中，待冷卻至50℃時加入2ml稀釋好的菌懸液，混勻，倒入插有牛津杯的素瓊脂平板上，得到雙層培養(yǎng)基。待培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100μl濃縮的發(fā)酵液，在4℃冰箱中放置過夜，使發(fā)酵液充分?jǐn)U散到培養(yǎng)基中，然后細(xì)菌在37℃、其他菌在28℃下培養(yǎng)72h，觀察并用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。
4.白蟻飼喂實(shí)驗從蟻巢中取30只白蟻(25只工蟻、5只兵蟻)置于大約25℃下并保濕的容器中，把濾紙片稱重后用發(fā)酵液浸泡，陰干，稱重，給白蟻喂食。將白蟻分為對照組和實(shí)驗組，對照組喂食用水浸泡的濾紙片，每天檢查實(shí)驗組和對照組白蟻的死亡數(shù)，觀察活動情況。計下死亡數(shù)，并清除死亡的白蟻。第八天把濾紙取出陰干秤重。
經(jīng)過白蟻的藥物飼喂試驗，并且對結(jié)果經(jīng)過統(tǒng)計分析表明試驗組白蟻取食濾紙片的量明顯比對照組少，而實(shí)驗組白蟻的死亡率明顯多于對照組，差異極其顯著；從白蟻的活動情況上來看實(shí)驗組的白蟻活動比對照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。
權(quán)利要求
1.利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于它按照下述步驟進(jìn)行(一)從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；(二)從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；(三)利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對白蟻共生菌作抑菌試驗；(四)用對白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對白蟻進(jìn)行飼喂試驗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述從白蟻中分離共生菌是這樣進(jìn)行的a、白蟻切去頭部和胸部，將腹部置于已滅菌的培養(yǎng)皿中進(jìn)行消毒后，用無菌水沖洗，無菌操作將白蟻腹部轉(zhuǎn)入消過毒的研缽中，研磨成勻漿；b、用移液槍取白蟻勻漿，分別加入細(xì)菌、真菌、酵母菌、放線菌的纖維素培養(yǎng)基和木質(zhì)素培養(yǎng)基平板中，用涂棒涂布均勻，細(xì)菌在37℃下培養(yǎng)，其它菌在28℃下培養(yǎng)；c、3～7d后培養(yǎng)基長出菌，用三區(qū)劃線法分離出單菌落，鑒定產(chǎn)酶能力的強(qiáng)弱后轉(zhuǎn)入斜面保存，從中挑選出指示菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述分離樹木內(nèi)生菌的方法是這樣實(shí)現(xiàn)的用刀將抗白蟻樹木的樹枝切成1.0～1.5厘米的小段，把處理過的小木塊接入水瓊脂浸汁培養(yǎng)基中，3～5d分離培養(yǎng)基上長出菌；用三區(qū)劃線法分別把菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基，分離出單菌落，然后分別把分離到的菌接入相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨斜面中，得到樹木內(nèi)生菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述采用牛津杯法作抑菌試驗是這樣進(jìn)行的取20ml半固體培養(yǎng)基加入小錐形瓶中，待冷卻至50℃時加入2ml指示菌菌懸液，混勻，倒入插有牛津杯的素瓊脂平板上；待培養(yǎng)基凝固后拔出牛津杯，用移液槍向小孔中加入100μl發(fā)酵液，在4℃冰箱中放置過夜，然后細(xì)菌在37℃、其它菌在28℃下培養(yǎng)72h。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述菌懸液是這樣制備的取5ml無菌水，加到指示菌的斜面上，在斜面上用接種環(huán)輕輕的刮擦，再用無菌移液管吸打混勻。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述發(fā)酵液是這樣制備的將分離純化所得的樹木內(nèi)生菌菌種分別接種到相應(yīng)的牛肉膏蛋白胨、查氏、馬丁氏、高氏、PDA、S-7液體培養(yǎng)基中，在28℃、100r/min的條件下細(xì)菌培養(yǎng)2～3d，真菌培養(yǎng)5～6d；將培養(yǎng)液以3500r/min離心分離10～15min，取上清液，傾入無菌錐形瓶，在無菌條件下，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在40℃恒溫水浴、150r/min條件下濃縮至其體積的十分之一，放入4℃冰箱中保存，作為備用的發(fā)酵液。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于半固體培養(yǎng)基是這樣制備的分別取查氏、牛肉膏蛋白胨、馬丁氏、麥?zhǔn)?、PDA、S-7、葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基，加入0.75％的瓊脂。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述素瓊脂平板是這樣制備的1000ml水加20g的瓊脂，滅菌，倒平板，每個平板倒10～15ml的素瓊脂，把牛津杯立在素瓊脂平板上。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，其特征在于所述抗白蟻樹木為Western Red Cedar和port-orford-cedar。
全文摘要
利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法，它涉及一種利用樹木內(nèi)生菌的代謝產(chǎn)物抑制白蟻共生菌的抗白蟻方法。本發(fā)明是這樣進(jìn)行的從白蟻體內(nèi)分離具有木質(zhì)素和/或纖維素分解能力的共生菌作為指示菌；從抗白蟻樹木中分離樹木內(nèi)生菌，對其進(jìn)行發(fā)酵，得到樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物；利用樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物采用牛津杯法對白蟻共生菌作抑菌試驗；用對白蟻的共生菌有抑制作用的樹木內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物浸泡濾紙片，對白蟻進(jìn)行飼喂試驗。經(jīng)過統(tǒng)計分析表明試驗組白蟻取食濾紙片的量明顯比對照組少，而實(shí)驗組白蟻的死亡率明顯多于對照組，差異極其顯著；從白蟻的活動情況上來看實(shí)驗組的白蟻活動比對照組弱，從而說明發(fā)酵液中含有能抗白蟻的化合物。
文檔編號A01G23/00GK1608431SQ20041004408
公開日2005年4月27日 申請日期2004年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月26日
發(fā)明者周東坡, 平文祥, 許中允, 李強(qiáng), 劉軍, 周剛, 韓雅紅, 蘇泊 申請人:黑龍江大學(xué)