專利名稱：一種松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)方法，尤其是一種適合非實驗室操作的實驗方法。
背景技術(shù)：
松口蘑[Tricholoma matsutake(S.Ito.et.Imai)Sing.]—世界上最名貴的菌根型食用菌之一，是國家二級保護植物。在我國主要分布于東北地區(qū)的吉林、黑龍江，西南地區(qū)的云南、四川，其它如山西、安徽、臺灣、西藏等省區(qū)也有零星分布。國外主要分布于日本、朝鮮、俄羅斯等國。松口蘑是一種富含蛋白質(zhì)、多種維生素和大量糖類的美味食品，世界上以日本人最喜歡食用松口蘑，近年來由于環(huán)境的惡化和需求量的擴大，日本本土產(chǎn)量已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足其國內(nèi)市場的需要，因此每年都大量從外國進口。松口蘑出口已成為其產(chǎn)地的一個重要產(chǎn)業(yè)，經(jīng)濟效益相當(dāng)可觀。
關(guān)于松口蘑的人工栽培研究已經(jīng)進行了一個世紀(jì)之久，但是迄今為止，除了形成幾個子實體原基(Ogawa&Hamada，1975)外，尚沒有栽培成功的例子見諸報端。近年來，關(guān)于無菌條件下松口蘑人工菌根苗誘導(dǎo)成功的報導(dǎo)有很多(Yamada et al.，1999a；Guerin-Laguette et al.，2000a；Vaario et al.，2000)，這種人工菌根苗可以進行野外栽培，然而，盡管大多數(shù)菌根真菌在侵染宿主植物根部后都能夠進行擴展生長(Read，1991；Guerin-Laguette et al.，2000b；Wu et al.，2001)，可松口蘑菌絲體即便是其在宿主植物根內(nèi)形成哈蒂氏網(wǎng)后仍很難進一步生長，移栽后的菌根苗會出現(xiàn)菌絲退化現(xiàn)象，并且菌根也僅能存活4個月左右(Yamada et al.，2001)。這種有限生長的外延菌絲根本無法形成天然條件下松口蘑子實體形成的關(guān)鍵場所—菌塘，因而也就無法繼續(xù)進行子實體的誘導(dǎo)實驗。
菌塘是由密生的白色或灰白色菌絲體與植物根系及土壤顆粒相互交錯紐結(jié)而成的團狀結(jié)構(gòu)(Ogawa，1975a；Hosford et al.，1997；Yamada et al.，1999b)，松口蘑整個生活史及其子實體的產(chǎn)生都是在菌塘上完成的(弓明欽等，2002)。Ogawa(1975a)在觀察野外松口蘑菌塘的擴展生長時發(fā)現(xiàn)，為了維持菌落的進一步生長發(fā)育，與宿主植物相連的菌絲體需要有一個臨界生物量。由此可見，人工菌根苗形成后菌絲體在基質(zhì)中能否順利生長擴展形成可以滿足子實體發(fā)生的菌塘，對于松口蘑人工栽培的成功與否是十分關(guān)鍵的問題。
日本東京大學(xué)的研究人員對于快速誘導(dǎo)松口蘑人工菌根及工人菌塘的形成作了很深入的研究(Ogawa et al.，1974，1975b；Guerin-Laguette et al.，2001)，他們已報道在無菌土壤或人工基質(zhì)條件下，將松口蘑菌液接種于發(fā)芽1個月的赤松苗木上3～4個星期后，赤松的側(cè)根上就能形成很典型的哈蒂氏網(wǎng)，誘導(dǎo)出人工菌根。他們這一快速人工菌根誘導(dǎo)技術(shù)還獲得了日本國專利(鈴木和夫等，1999)。同時，他們還發(fā)現(xiàn)，界面活性劑及植物油對于松口蘑菌絲體的生長具有促進作用(Vaario et al.，2002；Guerin-Laguette et al.，2003)，這一發(fā)現(xiàn)對于松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)有著很大的意義。然而，這些誘導(dǎo)方法都存在著一定的缺陷—如Yamada(1999b)和Guerin(2003)等都是對誘導(dǎo)用容器使用了高壓滅菌法進行消毒，由于大容量的塑料容器或比較廉價的塑料器皿大都不耐高溫，用γ-射線消毒是一種解決問題的辦法(寺村智，2000)，但費用高，一般實驗室或?qū)嶒炚静豢赡苡羞@樣的設(shè)施。所以這些誘導(dǎo)法雖然在理論上可行，但實際操作上卻存在很大難度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服了上述技術(shù)中存在的不足之處，提出一種在以橄欖油為主要添加物的土壤中誘導(dǎo)菌絲體生長且適合非實驗室操作的松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是a)容器先用洗滌劑洗凈、沖洗并晾干；b)在經(jīng)70％酒精表面消毒的工作臺上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先后對容器內(nèi)壁以及容器蓋進行噴霧消毒，并保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置于經(jīng)表面消毒的工作臺上，自然干燥30-40分鐘；d)容器干燥后，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v干土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/干土v)并經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)土直接裝入容器中，再接入松口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
所述的培養(yǎng)土包含自然土與人工基質(zhì)混合物。
所述的人工基質(zhì)包含蛭石和珍珠巖。
根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)土含有0.5％-2.0％橄欖油，優(yōu)選為1％。
所述的培養(yǎng)土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續(xù)40-60分鐘的條件下進行消毒。
本發(fā)明的優(yōu)點是1)成功的進行了松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)2)方法簡便，適合非實驗室操作3)成本低廉，適合在松口蘑產(chǎn)區(qū)進行實際推廣應(yīng)用，以增加該食用菌的產(chǎn)量4)添加物為自然食用物質(zhì)，適合應(yīng)用于松口蘑人工子實體誘導(dǎo)的研究具體實施方式
下面對本發(fā)明的實施例做進一步詳細(xì)描述a)容器先用洗滌劑洗凈、沖洗并晾干；b)在經(jīng)70％酒精表面消毒的工作臺上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先后對容器以及容器蓋進行噴霧消毒，并保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置于經(jīng)表面消毒的工作臺上，自然干燥30-40分鐘；d)容器干燥后，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，無水乙醇v/v干土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/干土v)并經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)土直接裝入容器中，再接入松口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
所述的培養(yǎng)土包含自然土與人工基質(zhì)混合物。
所述的人工基質(zhì)包含蛭石和珍珠巖。
所述的培養(yǎng)土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續(xù)40-60分鐘的條件下進行消毒。
1)容器消毒將試管(Φ3.5mm×L17mm)先用洗滌劑洗凈、沖洗并晾干。在經(jīng)70％酒精表面消毒的超凈工作臺上，首先用70％酒精噴灑內(nèi)壁并放置5分鐘后，晾30分鐘，然后再分別用0.05-1.0％次氯酸鈉溶液噴灑內(nèi)壁并放置5分鐘，同樣晾30分鐘。兩次操作中消毒液用量為5ml/100ml容器。
2)檢測消毒液濃度對種子發(fā)芽的影響將上述方法消毒的試管作為培養(yǎng)容器，在每個試管中倒入經(jīng)高壓滅菌的含葡萄糖5g/l的瓊脂(1.0g/l)培養(yǎng)基30ml，每個濃度四個重復(fù)。首先觀察五周試管內(nèi)的污染情況，然后在試管中接入種子進行發(fā)芽實驗，每個管中接入消毒后的赤松種子2粒，分別觀察其污染率以及種子的發(fā)芽旅。
從表1中可以看出，次氯酸鈉溶液濃度為零時，一周后四個管中有三個產(chǎn)生了污染，兩周后所有試管全部污染；而當(dāng)溶液濃度為0.05-1.0％時，所有試管到第五周末都沒有產(chǎn)生污染，且到第八周結(jié)束時，發(fā)芽率分別為1.0％--50％；0.5％-62.5％；0.1％-72.5％；0.05％-87.5％。
表1次氯酸鈉溶液消毒試管觀察記錄表

“----”四個試管都無污染；“-+++”三個有污染，一個沒有；“++++”四個都有污染當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度為0.05％時，赤松種子的發(fā)芽率為87.5％，這個數(shù)值非常接近于高壓滅菌時的發(fā)芽率(90％，實驗數(shù)據(jù))，但當(dāng)溶液濃度為1.0％時發(fā)芽率僅為50％。由此可見，當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度為0.05％時，種子的發(fā)芽率幾乎沒有受到影響，且發(fā)芽用容器的消毒效果也達(dá)到了最佳。
3)松口蘑菌絲體生長的誘導(dǎo)取培養(yǎng)土若干(60℃，24小時)，加入蒸餾水—使土壤含水量為20％(v/v)、及事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v干土)混溶過的橄欖油—使土壤中油的含量分別達(dá)到0％，0.5％，1.0％，2.0％(油v/干土v)等四個濃度梯度。攪拌均勻后，121℃高壓滅菌40分鐘。超凈工作臺中量取滅菌后的混合培養(yǎng)土10ml直接倒入1)所述方法消毒后的直徑6cm的玻璃培養(yǎng)皿中，同時接入直徑8mm的兩個圓形菌塊，供試菌株為W2，F(xiàn)2和A，每種處理四個重復(fù)，用保鮮膜封纏3圈，封好后進行暗培養(yǎng)(23±2℃)。兩個月后測定菌絲體麥角固醇含量。
菌塊接入土壤中三天后即可觀察到菌絲的生長。一個月后，每個培養(yǎng)皿中都以兩個菌塊為中心形成了兩個圓形菌落，對照與油/土培養(yǎng)條件下都是如此，所不同的是，對照培養(yǎng)土中的菌絲生長稀疏，而添加橄欖油的培養(yǎng)土中菌絲生長致密。兩個月后收集菌絲體時發(fā)現(xiàn)，油/土培養(yǎng)基質(zhì)中的菌絲與土壤緊密結(jié)合在一起，兩個菌塊都形成了兩個圓形團狀物，生長狀況極其酷似野外的松口蘑菌塘。另外，麥角固醇含量測定結(jié)果也顯示(見表2)，油/土混合培養(yǎng)基質(zhì)中的菌絲體生物量明顯高于對照。且隨著橄欖油濃度的增加，麥角固醇含量呈正相關(guān)。所以，當(dāng)土壤中添加橄欖油濃度為0.5-2.0％時，對松口蘑菌絲體的生長都有良好的促進作用，且濃度越高促進作用越強。
表2不同橄欖油濃度的培養(yǎng)土中菌種的麥角固醇含量(μg/g干土)

注數(shù)據(jù)來源于四個重復(fù)的平均值4)檢測不同濃度橄欖油的油/土混合基質(zhì)對赤松苗生長的影響橄欖油/土壤混合培養(yǎng)基質(zhì)設(shè)置0％，0.5％，1.0％，2.0％，(油v/干土v)四個濃度梯度。將無菌赤松苗移入消毒后并裝有經(jīng)滅菌的各混合基質(zhì)的玻璃管(Φ3.5mm×L17mm)中，每種處理四個重復(fù)，用塑料薄膜將管口封好后，放入組培室培養(yǎng)架上，光照強度2000lux，溫度24±3℃，光照12h/天，四周后記錄赤松苗生長情況并稱量其地上部與地下部干重。
赤松苗在土壤中培養(yǎng)兩周后，橄欖油濃度為0.0-1.0％的試管中幼苗均長勢良好，而濃度為2.0％的則部分苗的葉尖有些變黃。到第四周結(jié)束時，0％濃度的四棵苗長勢良好；0.5％的四棵苗中兩株葉尖部分發(fā)黃，其余長勢良好；1.0％濃度的苗生長情況同0.5％的相類似；而2.0％濃度的四棵苗則葉尖全部發(fā)黃，且部分苗的莖也變黃。另如表3所示，當(dāng)添加橄欖油的濃度為2.0％時，赤松苗地上部和地下部的干重值比其它幾種情況下的都低，且差異顯著。另外兩個濃度條件下，苗的地上部和地下部干重值與不加油的基質(zhì)相比不存在顯著性差異。所以，盡管當(dāng)土壤中橄欖油添加濃度為2.0％與0.5％和1.0％相比松口蘑菌絲體生長量最大，但是這個濃度卻對赤松苗的生長有負(fù)面影響，而濃度為0.5％和1.0％時，赤松苗的生長與0.0％相比卻沒有受到影響。
表3在不同濃度的橄欖油/土壤混合基質(zhì)中生長四周后的赤松苗干重記錄表

注數(shù)據(jù)來源于四個重復(fù)的平均值5)通過松口蘑人工菌根苗的誘導(dǎo)驗證人工菌塘的功能取消毒后的長方形塑料培養(yǎng)平板(145mm×100mm×18mm)若干，向其中加入用3)方法配制并誘導(dǎo)1％濃度的橄欖油/土壤混合基質(zhì)與松口蘑菌絲體的混合物60ml(約占平板容量的1/2)，并將組織培養(yǎng)一個月的無菌赤松苗移入，用保鮮膜封好，再用錫泊紙將生長有菌絲體的土壤部分包嚴(yán)，以防光線影響菌根合成，使培養(yǎng)平板呈75度角斜放于組培室培養(yǎng)架上，培養(yǎng)條件為2000lux光照強度，24±3℃，12h光照/天。
在油/土混合基質(zhì)中生長三個月的菌絲體進一步蔓延覆蓋了整個土壤表面，并與土壤緊密扭結(jié)在一起形成了團塊狀結(jié)構(gòu)。接入的赤松苗兩個月后依然長勢良好，Olympus顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，苗的某些側(cè)根上沒有根毛，顔色呈暗棕色，且有疏松的菌絲連接于其上，表明有菌根形成。
權(quán)利要求
1一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于a)容器先用洗滌劑洗凈、沖洗并晾干；b)在經(jīng)70％酒精表面消毒的工作臺上，用70％酒精和0.05-1.0％次氯酸鈉溶液先后對容器內(nèi)壁以及容器蓋進行噴霧消毒，并保留消毒液5-20分鐘，用量為5-20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置于經(jīng)表面消毒的工作臺上，自然干燥30-40分鐘；d)容器干燥后，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v干土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5-2.0％(油v/干土v)并經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)土直接裝入容器中，再接入松口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20-30℃黑暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。
2根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)土包含自然土與人工基質(zhì)混合物。
3根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的人工基質(zhì)包含蛭石和珍珠巖。
4根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)土含有0.5％-2.0％橄欖油，優(yōu)選為1％。
5根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種松口蘑菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于，所述的培養(yǎng)土是在高壓滅菌鍋中溫度為121度、時間持續(xù)40-60分鐘的條件下進行消毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)方法，其特征在于a)容器先用洗滌劑洗凈、沖洗并晾干；b)在經(jīng)70％酒精表面消毒的工作臺上，用70％酒精和0.05－1.0％次氯酸鈉溶液先后對容器以及容器蓋進行噴霧消毒，并保留消毒液5－20分鐘，用量為5－20ml消毒液/100ml容器；c)將容器口朝下，放置于經(jīng)表面消毒的工作臺上，自然干燥30－40分鐘；d)容器干燥后，將含水量為20％(v/v)、添加了事先用無水乙醇(1.4％，v無水乙醇/v干土)混溶過橄欖油—油濃度為0.5－2.0％(油v/干土v)并經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)土直接裝入容器中，再接入松口蘑菌塊或菌液，加蓋或封口，在20－30℃黑暗條件下進行誘導(dǎo)培養(yǎng)。本發(fā)明成功地進行了松口蘑人工菌塘的誘導(dǎo)，它具有方法簡便，適合非實驗室操作；成本低廉，適合在松口蘑產(chǎn)區(qū)進行實際推廣應(yīng)用，以增加該食用菌的產(chǎn)量。
文檔編號A01G1/04GK1754422SQ20041004390
公開日2006年4月5日 申請日期2004年9月28日 優(yōu)先權(quán)日2004年9月28日
發(fā)明者李玉花, 倫志明, 邢樹堂, 孫雪, 傅祿敏 申請人:東北林業(yè)大學(xué), 李玉花