專利名稱：建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立方法，用于植物基因轉(zhuǎn)化受體生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
百合是世界著名花卉，應(yīng)用廣泛。長(zhǎng)期以來(lái)其品質(zhì)的改良都是依賴于傳統(tǒng)的遺傳育種方法。植物分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，為改良植物品質(zhì)和性狀提供了全新的途徑，利用轉(zhuǎn)基因的手段改良百合性狀和品質(zhì)變得切實(shí)可行，而良好的受體系統(tǒng)是百合基因轉(zhuǎn)化的一個(gè)關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，直接決定了轉(zhuǎn)化方法的簡(jiǎn)易、轉(zhuǎn)化再生頻率的高低，高效、穩(wěn)定且再生能力強(qiáng)的植物受體系統(tǒng)的建立是實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的先決條件。百合組織培養(yǎng)曾有過(guò)不少的報(bào)道，但基于基因轉(zhuǎn)化的百合高頻再生系統(tǒng)一直未能較好建立。本發(fā)明以廣泛應(yīng)用的百合品種為對(duì)象，建立了百合基因轉(zhuǎn)化胚性愈傷組織和直接分化受體系統(tǒng)，為基因轉(zhuǎn)化獲得百合新品種奠定了良好基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法。使其通過(guò)百合離體分化條件優(yōu)化、抗生素敏感性試驗(yàn)，克服百合組織培養(yǎng)的不足，提供兩種基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立方法，為實(shí)現(xiàn)百合的遺傳轉(zhuǎn)化培育百合新品種或品系提供具有較強(qiáng)的可操作性的方法。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明選擇有代表性的百合品種，針對(duì)不同外植體優(yōu)化其離體分化條件、建立高頻再生系統(tǒng)并通過(guò)抗生素敏感性試驗(yàn)確定基因轉(zhuǎn)化中合理的選擇壓等技術(shù)來(lái)達(dá)到建立百合基因遺傳轉(zhuǎn)化最佳受體系統(tǒng)的目的。本發(fā)明先將百合鱗莖、花絲等材料經(jīng)表面消毒后置于附加不同種類和不同濃度激素的多種分化培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，在優(yōu)化離體分化條件的前提下，確定基因轉(zhuǎn)化時(shí)合適的選擇壓。
本發(fā)明的具體方法包括如下步驟
1、百合鱗莖或花絲等材料進(jìn)行表面消毒，切成5-8mm小段作為離體培養(yǎng)的外植體，備用。
2、將外植體接種在MS，WS，B5以及Nitsch培養(yǎng)基等基本培養(yǎng)基上，30天后考察其離體生長(zhǎng)情況，基本培養(yǎng)基篩選，確定基本培養(yǎng)基為富集元素平衡培養(yǎng)基MS；3、最佳離體分化培養(yǎng)基的確定。在確定基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將外植體接種在附加附加濃度為0.25-2mg/l的KT，BA，2，4-D，IAA和NAA的分化培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，30-45天后考察其分化率。
4、為在基因轉(zhuǎn)化時(shí)篩選抗性組織和細(xì)胞，在離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)，確定頭孢霉素、潮霉素和卡那霉素的篩選濃度。將百合鱗莖或胚性愈傷組織分別接種在附加卡那霉素(Km)、潮霉素(Hyg)和頭孢霉素(Cef)的選擇培養(yǎng)基上，30-45天后觀察外植體褐變情況和抑菌能力，通過(guò)外植體的褐變率來(lái)確定潮霉素和卡那霉素的篩選濃度，以褐變率達(dá)到90％以上時(shí)的濃度作為基因轉(zhuǎn)化時(shí)潮霉素和卡那霉素的選擇壓，用于篩選抗性細(xì)胞和組織；通過(guò)外植體的褐變率和抑菌能力來(lái)確定頭孢霉素的篩選濃度，以能夠抑制農(nóng)桿菌和雜菌，褐變率＜10％的濃度作為頭孢霉素的篩選濃度?？敲顾氐臐舛忍荻葹?、25、50、75、100、120、140mg/l，潮霉素的濃度梯度為0、10、20、30、40mg/l，頭孢霉素的濃度梯度為0、100、250、500、750mg/l。
5、將選擇培養(yǎng)中分化出的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。試管苗長(zhǎng)至7～8cm進(jìn)行移栽。
本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，具有突質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步。用本發(fā)明的技術(shù)可以為今后利用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等開展百合的分子育種提供良好的技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)，根據(jù)不同品種外植體的具體要求可以選擇不同的方法建立基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的靈活性和廣泛適用性。
具體實(shí)施例方式
以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步描述。
實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)品種為東方百合，以其鱗莖作為外植體。
將鱗莖由外至內(nèi)剝開，用清水沖洗干凈，洗衣粉液浸泡30min，然后至無(wú)菌操作臺(tái)消毒75％酒精浸泡2min，無(wú)菌水沖洗3次，20％濃度的市售安替福民浸泡15-20min，無(wú)菌水沖洗3次，將其切成5mm大小作為外植體備用。
將鱗莖分別接種于MS，WS，B5以及Nitsch培養(yǎng)基等基本培養(yǎng)基上，1個(gè)月后考察生長(zhǎng)情況。確定基本培養(yǎng)基為富集元素平衡培養(yǎng)基MS。
將鱗莖接種在MS+BA 0.5-2.0mg/l+NAA 0.5-2.0mg/l+2，4-D 0.1-1.0mg/l的(pH5.8)固體分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，45天后統(tǒng)計(jì)分化率。根據(jù)結(jié)果確定其最佳分化培養(yǎng)基為MS+BA 1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D0.1mg/l(pH5.8)。
將外植體接種在附加不同濃度卡那霉素的選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)。即置于MS+BA1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D 0.1mg/l+Km(0、25、50、75、100、120、140mg/l)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，45天后統(tǒng)計(jì)外植體褐變率。結(jié)果表明卡那霉素為100mg/l時(shí)外植體的褐變率達(dá)到90％以上，據(jù)此確定卡那霉素對(duì)東方百合的篩選濃度以100mg/l為宜。
取部分鱗莖接種于MS+BA 1.0mg/l+NAA 0.5mg/l+2，4-D 0.1mg/l+Cef(0、100、250、500、750mg/l)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，45天后統(tǒng)計(jì)外植體褐變率和抑菌能力。結(jié)果表明頭孢霉素對(duì)東方百合的篩選濃度以250mg/l為宜。
將選擇培養(yǎng)中分化出的不定芽轉(zhuǎn)入MS+NAA0.2mg/L(pH5.8)生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。試管苗長(zhǎng)至7～8cm進(jìn)行移栽。
實(shí)施例2實(shí)驗(yàn)品種為麝香百合，以其花絲作為外植體。
將麝香百合整個(gè)花苞剪下，用清水沖洗干凈，洗衣粉液浸泡30min后置無(wú)菌操作臺(tái)消毒。方法如下將材料放入無(wú)菌容器中，用75％的酒精消毒30s后用20％濃度的市售次氯酸鈉溶液處理10min，用無(wú)菌水沖洗6-8次，最后用無(wú)菌吸水紙吸干水分，剝開花苞，將花絲分離出并剪成5-8mm小段作為外植體備用。
將花絲接種于MS，WS，B5以及Nitsch培養(yǎng)基等基本培養(yǎng)基上，1個(gè)月后考察生長(zhǎng)情況。確定基本培養(yǎng)基為富集元素平衡培養(yǎng)基MS。
將外植體接種在MS+BA(或KT)0.25-2.0mg/l+NAA(或IAA或2，4-D)0.25-2.0mg/l的(pH5.8)固體誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次。30天后統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率和不定芽分化率。根據(jù)結(jié)果確定其最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+BA0.5mg/l+NAA 1.0mg/l，而最佳分化培養(yǎng)基為MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l。
將胚性愈傷組織接種于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Km(0、25、50、75、100、120、140mg/l)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，30天后統(tǒng)計(jì)外植體褐變率。結(jié)果表明卡那霉素為75mg/l時(shí)外植體的褐變率達(dá)到92％，據(jù)此確定卡那霉素對(duì)麝香百合的篩選濃度以75mg/l為宜。
將胚性愈傷組織接種于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Hyg(0、10、20、30、40mg/l)固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，30天后統(tǒng)計(jì)外植體褐變率。結(jié)果表明潮霉素為20mg/l時(shí)外植體的褐變率達(dá)到95.8％，據(jù)此確定潮霉素對(duì)麝香百合的篩選濃度為20mg/l。
取部分胚性愈傷組織接種于MS+KT 1.0mg/l+NAA 0.2mg/l+Cef(0、100、250、500、750mg/l)的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，每2周繼代一次，30天后統(tǒng)計(jì)外植體褐變率和抑菌能力。確定頭孢霉素對(duì)麝香百合的篩選濃度為250-500mg/l。
將選擇培養(yǎng)中分化出的不定芽轉(zhuǎn)入MS+NAA0.2mg/L生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根。試管苗長(zhǎng)至7～8cm進(jìn)行移栽。
權(quán)利要求
1.一種建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法，其特征在于，將百合鱗莖或花絲經(jīng)表面消毒后切段置于分化培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，通過(guò)抗生素敏感性試驗(yàn)確定基因轉(zhuǎn)化時(shí)頭孢霉素、潮霉素和卡那霉素的篩選濃度，將分化出的不定芽誘導(dǎo)生根，移栽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法，以下對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步限定，具體步驟如下①百合鱗莖或花絲材料進(jìn)行表面消毒，切成5-8mm小段作為外植體，作為離體培養(yǎng)，備用；②將外植體接種在MS，WS，B5以及Nitsch培養(yǎng)基基本培養(yǎng)基上，30天后根據(jù)其離體生長(zhǎng)情況，經(jīng)篩選，確定基本培養(yǎng)基為富集元素平衡培養(yǎng)基MS；③在確定最佳基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，將外植體接種在附加濃度為0.25-2mg/l的KT，BA，2，4-D，IAA和NAA的分化培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)，30-45天后考察其分化率；④為在基因轉(zhuǎn)化時(shí)篩選抗性組織和細(xì)胞，在離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)的基礎(chǔ)上進(jìn)行抗生素敏感性試驗(yàn)；⑤將選擇培養(yǎng)中分化出的不定芽轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中誘導(dǎo)生根，試管苗長(zhǎng)至7～8cm進(jìn)行移栽。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法，其特征是，所述的抗生素敏感性試驗(yàn)，是指將百合鱗莖或胚性愈傷組織分別接種在卡那霉素Km、潮霉素Hyg和頭孢霉素Cef的選擇培養(yǎng)基上，30-45天后觀察外植體褐變情況，統(tǒng)計(jì)外植體褐變率。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法，其特征是，所述的抗生素敏感性試驗(yàn)，是指通過(guò)外植體的褐變率來(lái)潮霉素和卡那霉素的篩選濃度，以褐變率達(dá)到90％以上時(shí)的濃度作為基因轉(zhuǎn)化時(shí)潮霉素和卡那霉素的選擇壓，用于篩選抗性細(xì)胞和組織；通過(guò)外植體的褐變率和抑菌能力來(lái)確定頭孢霉素的篩選濃度，以能夠抑制農(nóng)桿菌和雜菌，褐變率＜10％的濃度作為頭孢霉素的篩選濃度。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或者4所述的建立百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的方法，其特征是，卡那霉素的濃度梯度為0、25、50、75、100、120、140mg/l；潮霉素的濃度梯度為0、10、20、30、40mg/l；頭孢霉素的濃度梯度為0、100、250、500、750mg/l。
全文摘要
一種百合基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)的建立方法，用于植物基因受體生物技術(shù)領(lǐng)域。將百合鱗莖或花絲經(jīng)表面消毒后切段置于分化培養(yǎng)基上離體培養(yǎng)建立高頻再生系統(tǒng)，通過(guò)抗生素敏感性試驗(yàn)確定基因轉(zhuǎn)化時(shí)頭孢霉素、潮霉素和卡那霉素的篩選濃度，將分化出的不定芽誘導(dǎo)生根，移栽。本發(fā)明的方法簡(jiǎn)單易行，用本發(fā)明的技術(shù)可以為今后利用基因槍法、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法等開展百合的分子育種提供良好的技術(shù)平臺(tái)。同時(shí)，根據(jù)不同品種外植體的具體要求可以選擇不同的方法建立基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)，具有較強(qiáng)的靈活性和廣泛適用性。
文檔編號(hào)A01H4/00GK1561697SQ200410017688
公開日2005年1月12日 申請(qǐng)日期2004年4月15日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月15日
發(fā)明者唐東芹, 楊學(xué)軍, 錢虹妹, 黃丹楓 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)