專利名稱：一種超氧化物歧化酶蘋果及其生產(chǎn)方法與專用生物制劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種具有高含量生物保護(hù)酶的蘋果及其生產(chǎn)方法與專用生物制劑，特別是涉及一種具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)的蘋果及其生產(chǎn)方法與專用生物制劑。
背景技術(shù)：
SOD酶是生物重要保護(hù)酶之一，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力，防衰老的功能。專利號為93103774.3，發(fā)明名稱為“一種產(chǎn)生超氧化物歧化酶的芽孢桿菌及其生產(chǎn)方法”的中國發(fā)明專利中公開了一株芽孢桿菌，菌株保藏號為CGMCC 0175，該菌株具有較強(qiáng)的產(chǎn)生超氧化物歧化酶的能力。
蘋果是深受人們喜愛的水果，也是我國入世后為數(shù)不多的具有明顯國際競爭力的農(nóng)產(chǎn)品之一。目前世界蘋果年總產(chǎn)量近6000萬噸，人均蘋果占有量約10公斤，我國為15公斤，高于世界人均水平5公斤，因此對蘋果進(jìn)行品質(zhì)改進(jìn)，特別是使蘋果具有一些特殊的醫(yī)療保健作用意義非常重大。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種生產(chǎn)具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)蘋果的專用生物制劑。
該專用生物制劑的活性成分是3.0×1010cfu/g的芽孢桿菌CGMCC 0175。
所述制劑中還含有所述菌體5-7倍重量份數(shù)比的輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸，輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸的細(xì)度一般為0.08-0.1mm，優(yōu)選的為0.09mm。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種具有高含量超氧化物歧化酶(SOD)蘋果及其生產(chǎn)方法。
本發(fā)明所提供的超氧化物歧化酶(SOD)蘋果，含有20-50IU/g的超氧化物歧化酶。
所述蘋果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度為12-18kg/cm2。
一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶(SOD)蘋果的方法，是向樹冠噴霧或/和樹干注射蘋果專用SOD制劑。
在實際應(yīng)用中，所述向樹冠噴霧蘋果專用SOD制劑的方法是，每畝每次用蘋果專用SOD生物制劑40-60克，兌水100-200公斤，共噴5-7次，每次間隔25-30天。其中較優(yōu)選的是每畝每次用50克，共噴6次，所述樹干注射蘋果專用SOD制劑，包括以下步驟1)鉆孔，在根莖部鉆孔，孔深達(dá)髓心部；
2)注射，向孔中注射蘋果專用SOD制劑，每畝每次用65-85克，溶于1-3公斤水中，共注射3-5次，其中較優(yōu)選的是每畝每次用75克，溶于2公斤水中，套袋蘋果共注射4次。
上述過程中，鉆孔應(yīng)在根莖部50cm之內(nèi)，鉆孔與樹干呈45-80度的夾角，孔徑5-5.5mm，鉆孔數(shù)量2-3個。
蘋果專用SOD制劑通過芽孢桿菌在蘋果樹體內(nèi)繁殖、轉(zhuǎn)移，提高蘋果體內(nèi)的SOD活性和含量。蘋果專用SOD制劑菌株產(chǎn)生的SOD酶有較強(qiáng)的耐溫抗熱性和抗逆能力，在70℃條件下處理1小時，酶活為原酶活的47％；100℃條件下處理30分鐘，酶活為原酶活的37％；對臭氧、高溫高酸的耐性很強(qiáng)。用本發(fā)明的方法生產(chǎn)的SOD蘋果不僅保持了原有蘋果的優(yōu)良性狀，而且SOD含量明顯提高，具有增強(qiáng)人體免疫力和延緩衰老的功效，在深加工過程中仍可保持較高的SOD酶活。
蘋果專用SOD制劑可以與其它栽培管理措施結(jié)合實施，不增加工時，同時可以與其它殺蟲劑、殺菌劑(殺細(xì)菌劑除外)、植物生長調(diào)節(jié)劑、葉面肥、化學(xué)肥料等農(nóng)化物質(zhì)混合使用，不影響使用效果。
具體實施例方式
實施例1、蘋果專用SOD生物制劑的生產(chǎn)一、菌株的發(fā)酵生產(chǎn)1、生產(chǎn)中的技術(shù)指標(biāo)滅菌條件溫度121-125℃，壓力0.11-0.14mpa，時間30min培養(yǎng)條件溫度28-34℃，壓力0.05mpa，通氣值1∶1，pH值7-7.5放罐指標(biāo)含菌量≥50億/ml，芽孢形成≥70％，雜菌率≤0.3％2、菌種生產(chǎn)從芽孢桿菌CGMCC 0175原菌種斜面上挑取少許在備用斜面試管內(nèi)劃線，置于28-30℃溫箱中培養(yǎng)24h，取出檢查，確認(rèn)無雜菌污染，菌體生長整齊時，再繼續(xù)培養(yǎng)24-48h，然后涂片、染色，并在油鏡下觀察，無雜菌污染，孢子整齊時，作為發(fā)酵生產(chǎn)的菌種。
3、發(fā)酵生產(chǎn)發(fā)酵生產(chǎn)分種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)兩部分進(jìn)行，發(fā)酵液達(dá)到規(guī)定指標(biāo)時及時放罐。
二、制備生物制劑1、添加吸附劑向得到的發(fā)酵液中投入6倍菌體重量細(xì)度為0.09mm的輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸，然后機(jī)械攪拌3-6小時，使芽孢桿菌充分被載體吸附。
2、壓濾采用明流式或暗流式板扛壓濾機(jī)濾去多余水份。
3、干燥低溫干燥(不超過70℃)，使含水率≤5％。
4、粉碎用超細(xì)度粉碎機(jī)粉碎，細(xì)度要求為100％通過0.09mm孔徑篩，控制細(xì)度的目的是為防止使用時堵塞噴頭。
5、包裝實施例2、采用樹冠噴霧法生產(chǎn)SOD蘋果選用蘋果樹長勢旺盛，已進(jìn)入生產(chǎn)期的富士蘋果果園。
每畝每次用蘋果專用SOD生物制劑50克，一般兌水100-200公斤，混和稀釋均勻，視樹體大小、栽培密度調(diào)整用水量。套袋富士，共噴6次，現(xiàn)蕾期噴1次，套袋前幼果期噴1次，套袋后噴3次，每次間隔25-30天，在取袋后噴1次；噴灑應(yīng)達(dá)到葉片、樹干、果實等部位稀釋液均勻附著，一般應(yīng)在上午10點(diǎn)前或下午3點(diǎn)后噴施。果園進(jìn)行正常的栽培管理，收獲時得到的蘋果即是超氧化物歧化酶蘋果，該種蘋果的超氧化物歧化酶為20-50IU/g，蘋果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度為12-18kg/cm2。
該實施例的方法也適用于新紅星、花冠等品種，對于這些品種，在現(xiàn)蕾期至采收期共噴6次，每次至少間隔25天。
實施例3、采用樹干注射法生產(chǎn)SOD蘋果選用蘋果樹長勢旺盛，已進(jìn)入生產(chǎn)期的果園。
1、鉆孔，在根莖部50cm之內(nèi)，鉆與樹干夾角45-80度的孔，孔徑5-5.5mm，鉆孔數(shù)量2-3個，深度達(dá)髓心部。
2.注射，每畝每次用蘋果專用SOD制劑75克，一般溶于2公斤水中，套袋蘋果共注射4次，現(xiàn)蕾期(4月底)1次，套袋后3次，時間分別為6月底、7月底、8月底。將單株所需蘋果專用SOD制劑稀釋液裝入滴注袋，垂直掛于距地面1.5米左右高的中心枝杈上，并排出管道中的氣體，然后將滴注針頭插入鉆孔即可進(jìn)行注射。注射完畢，注孔用干樹枝塞緊，與樹皮剪平，并堆土保護(hù)注孔。在天氣晴朗時注射時間一般為2-12小時。注射時，蘋果專用SOD制劑至少提前4小時溶解。果園進(jìn)行正常的栽培管理，收獲時得到的蘋果即是超氧化物歧化酶蘋果，該種蘋果的超氧化物歧化酶為20-50IU/g，蘋果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度為12-18kg/cm2。
實施例4、本發(fā)明超氧化物歧化酶蘋果SOD酶活的測定一、SOD酶活的測定SOD酶活的測定采用NBT光化學(xué)法1、NBT反應(yīng)液的制備配制pH7.8，50mmol/L的磷酸緩沖液1000ml，加入1.933mg的L-甲硫氨酸(L-Met)，待完全溶解后，放入45.8mg氯化硝基氮藍(lán)四唑(NBT)，0.47mg核黃素(配成0.47mg/ml溶液，吸取1ml加入)和29.0mg乙二胺四乙酸(EDTA)，溶液終濃度Met為13mmol/L；NBT為6.3×10-3mmol/L；核黃素(VB2)為1.3×10-3mmol/L；EDTA為0.1mmol/L，置于棕色試劑瓶中，用黑布罩遮光，于4℃冰箱中可保存1個月。
2、材料的預(yù)處理蘋果果肉用研缽研碎，按照果肉∶50mM磷酸緩沖液＝1∶2的比例加入緩沖液，10000rpm離心10分鐘，取上清液進(jìn)行SOD酶活測定。
3、測定方法吸取30μl樣品，放入10ml透明玻璃小燒杯中，加入3mlNBT反應(yīng)液，混勻，在28℃SOD光化反應(yīng)室中，2×15W日光燈光照20分鐘(光照為4000勒克司)，在560nm處測定吸光度，以NBT反應(yīng)液作空白對照，每組設(shè)3次重復(fù)，整個測定過程除光化反應(yīng)外，均在避光或弱光條件下進(jìn)行。同時測試過程中以美國″Sigma″公司、上海寶安公司的標(biāo)準(zhǔn)酶和貴州老來福藥業(yè)公司生產(chǎn)的SOD口服液作為測試對照。
4、計算SOD酶活(IU/g)＝(OD對照-OD樣品)/(1/2OD對照)×稀釋倍數(shù)二、本發(fā)明超氧化物歧化酶蘋果SOD酶活的測定測定實施例1和實施例2生產(chǎn)的SOD蘋果中的SOD酶活性，結(jié)果如表1所示，表明SOD蘋果中SOD酶活顯著高于普通蘋果，且在a＝0.05水平差異顯著。說明通過該項技術(shù)可以生產(chǎn)出具有高含SOD酶活的SOD保健功能蘋果。
表1、SOD蘋果中SOD酶活測定結(jié)果

實施例5、本發(fā)明超氧化物歧化酶(SOD)蘋果SOD的抗熱性測定將SOD蘋果樣品在100℃中保持20分鐘，測定SOD蘋果和對照蘋果的SOD酶活性。
測定結(jié)果如表2所示，表明，經(jīng)過熱處理后，SOD蘋果中仍保持較高的SOD酶活，但對照含有的SOD酶活極低。說明通過該項技術(shù)生產(chǎn)的SOD蘋果，適于在常溫下保存和進(jìn)行深加工，仍能保持較高的SOD活性。
表2、SOD蘋果中SOD的抗熱性測定

權(quán)利要求
1.一種蘋果專用SOD制劑，它的活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g的芽孢桿菌CGMCC 0175。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SOD制劑，其特征在于所述制劑中還含有所述菌體5-7倍重量份數(shù)比的輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的SOD制劑，其特征在于所述輕質(zhì)碳酸鈣或草炭或腐植酸的細(xì)度為0.08-0.1mm。
4.一種超氧化物歧化酶蘋果，其特征在于它含有20-50 IU/g的超氧化物歧化酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的蘋果，其特征在于所述蘋果的可溶性固形物大于等于14.7％；可滴定酸小于等于0.27g/100ml；硬度為12-18kg/cm2。
6.一種生產(chǎn)超氧化物歧化酶蘋果的方法，是向樹冠噴霧或/和樹干注射蘋果專用SOD制劑，該制劑的活性成分是2.5-3.5×1010cfu/g的芽孢桿菌CGMCC 0175。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述向樹冠噴霧蘋果專用SOD制劑的方法是，每畝每次用蘋果專用SOD生物制劑40-60克，兌水100-200公斤，共噴5-7次，每次間隔25-30天。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述樹干注射蘋果專用SOD制劑，包括以下步驟1)鉆孔，在根莖部鉆孔，孔深達(dá)髓心部；2)注射，向孔中注射蘋果專用SOD制劑，每畝每次用65-85克，溶于1-3公斤水中，套袋蘋果共注射3-5次。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述鉆孔在根莖部50cm之內(nèi)，鉆孔與樹干呈45-80度的夾角，孔徑5-5.5mm，鉆孔數(shù)量2-3個。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種超氧化物歧化酶(SOD)蘋果及其生產(chǎn)方法與專用生物制劑，本發(fā)明所提供的專用生物制劑的活性成分是3.0×10
文檔編號A01H3/00GK1559196SQ200410006548
公開日2005年1月5日 申請日期2004年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月8日
發(fā)明者王 琦, 彭增康, 楊占江, 梅汝鴻, 王 琦 申請人:三門峽市農(nóng)業(yè)科技咨詢服務(wù)中心