專利名稱：一種寶山堇菜組培快速育苗方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種重金屬超富集植物寶山堇菜(Viola baoshanensis)組織培養(yǎng)快速育苗方法。
背景技術(shù)：
寶山堇菜(Viola baoshanensis)是堇菜科一新種，也是在我國境內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的重金屬的超富集植物。寶山堇菜用于科學(xué)研究和修復(fù)水體或土壤重金屬污染方面的潛在價(jià)值，現(xiàn)已吸引了科學(xué)界、環(huán)保界和企業(yè)界人士的關(guān)注。
當(dāng)前，對寶山堇菜的研究與試驗(yàn)，需要大量用苗，而這些用苗基本上直接采集于湖南省桂陽縣寶山礦區(qū)。野外調(diào)查表明，寶山堇菜僅在寶山礦區(qū)兩平方公里以內(nèi)局部集中分布，在我國其它礦區(qū)尚未被發(fā)現(xiàn)。先前的和正在進(jìn)行的寶山堇菜研究，已消耗大量的野生寶山堇菜種質(zhì)資源，從而人為干擾了寶山堇菜種群繁衍，致使寶山堇菜種群逐步萎縮。對寶山堇菜野生種質(zhì)資源保護(hù)和下一步研究的需要，使得尋求一種新的用苗來源意義越來越大。
利用種子發(fā)芽嘗試表明，寶山堇菜的種子較小，收集不易，且發(fā)芽率較低，因而被證實(shí)不是一種理想的獲取用苗的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種寶山堇菜組織培養(yǎng)快速育苗方法。
組織培養(yǎng)快速育苗，已解決了許多其它珍貴物種的繁育問題，但各物種培養(yǎng)繁育條件各不相同，需要多重篩選試驗(yàn)，本發(fā)明解決了這一問題，提供了一種適合寶山堇菜組織培養(yǎng)快速育苗方法。本發(fā)明通過選取野生寶山堇菜的葉片或葉柄為外植體，消毒后，接種于候選的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，根據(jù)不同來源外植體響應(yīng)不同激素配比誘導(dǎo)培養(yǎng)基產(chǎn)生不同的分化效應(yīng)，以及對后續(xù)增殖培養(yǎng)、生根培養(yǎng)、移栽條件的摸索，篩選出寶山堇菜最優(yōu)化繁育方案。
本發(fā)明的寶山堇菜組織培養(yǎng)快速育苗方法的具體步驟包括1)外植體選擇及消毒處理選擇葉片或葉柄為外植體，以0.1％HgCl2為消毒劑，消毒8～12分鐘(以10分鐘效果最好)；2)不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織生成將經(jīng)上述處理的外植體接種于如下之一的添加激素的MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織生成；
a.激素比為0.5～1.0mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L NAA，接種一周后有不定芽生成，不定芽生長迅速，接種2～3周后，不定芽高約2～3厘米；b.激素比為0.5～1mg/L KT+1～1.5mg/L 2，4-D，接種2～3天后有白色愈傷生成，3～4周后，生成明顯的愈傷組織；愈傷組織接種于0.5～1.0mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L NAA配比的MS培養(yǎng)基上，接種1～2周有不定芽生成；3)生根培養(yǎng)將上述獲得的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2或1MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；上述步驟2)和3)(接種后至煉苗前)的培養(yǎng)條件為光照12～14小時/天，溫度22～25℃；4)煉苗與移栽生根培養(yǎng)2～3星期后(或待寶山堇菜苗長4～5cm)，開培養(yǎng)瓶煉苗，移種于培養(yǎng)土中，在組培苗上罩以透明薄膜，維持70～80％的相對濕度，2～4天后取走透明薄膜，得到組培苗；移栽成活率＞80％。
開培養(yǎng)瓶煉苗時，最好是先在無菌室內(nèi)培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)1天后，再將苗從培養(yǎng)瓶中移出，沖洗干凈根部瓊脂，移種于培養(yǎng)土中。
本發(fā)明具有以下突出效果1)縮短寶山堇菜繁殖周期，成活率較高。
野生寶山堇菜結(jié)實(shí)種子有性繁殖周期較長，而本發(fā)明的組培方法可快速繁殖寶山堇菜，從接種、煉苗、移栽到獲得健壯可用成苗周期僅2～3個月。利用優(yōu)化方案繁育出的寶山堇菜苗在培養(yǎng)基上和土壤中均能完成生活史，移栽成活率大于80％。
2)提高繁殖系數(shù)，育苗受外界條件影響較少。
野外生長的寶山堇菜種子具休眠特性，萌發(fā)率較低，而組織培養(yǎng)中每個外植體誘導(dǎo)的不定芽數(shù)量平均為6-10個，繁殖系數(shù)較高，組培工作可在一般無菌室內(nèi)操作，因而繁育過程受外界條件影響較少。
3)促進(jìn)我國對重金屬超富集植物寶山堇菜科學(xué)研究及環(huán)保應(yīng)用。
利用本發(fā)明建立的方法，可簡單、快速、大量培育重金屬超富集植物寶山堇菜。本發(fā)明建立的方法不僅繁育出幼苗，也獲得了愈傷組織，以此為材料，利用分子生物學(xué)技術(shù)與手段加以改良，將可能優(yōu)化寶山堇菜修復(fù)土壤或水體重金屬污染應(yīng)用，同時也為植物對有毒金屬耐性與富集機(jī)理方面的科學(xué)研究提供了理想可靠的材料，因而本發(fā)明的應(yīng)用推廣，將會促進(jìn)我國對寶山堇菜的相應(yīng)科學(xué)研究及環(huán)保應(yīng)用。
以下通過實(shí)施例和附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。


圖1是寶山堇菜葉柄外植體分化圖，在添加1mg/L KT+1mg/L 2，4-D激素配比的MS培養(yǎng)基上，外植體被誘導(dǎo)出大量毛狀根；圖2是寶山堇菜葉片外植體分化圖，在添加1mg/L KT+1mg/L 2，4-D激素配比的MS培養(yǎng)基上，外植體被誘導(dǎo)出明顯的愈傷組織；圖3是寶山堇菜葉片外植體不定芽誘導(dǎo)生成圖，葉片外植體在加以1mg/L 6-BA+1mg/L NAA配比的MS培養(yǎng)基可生成不定芽；圖4是寶山堇菜組培苗結(jié)實(shí)種子圖，轉(zhuǎn)接于1/2MS培養(yǎng)基不定芽，可以在培養(yǎng)基上完成生活史，說明組培階段較好的保持了寶山堇菜的遺傳性狀；圖5是寶山堇菜組培苗煉苗后移栽成活圖，煉苗后移栽入營養(yǎng)土中的寶山堇菜組培苗可茁壯成長，成活率大于80％。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取野生寶山堇菜的葉柄為外植體，流水沖洗干凈，切成0.5cm2的小塊，0.1％HgCl2中浸泡10分鐘，然后，用無菌水沖洗4～5次，接種于1mg/L 6-BA+1mg/L NAA的MS基本培養(yǎng)基上，此操作在紫外滅菌的超凈工作臺上進(jìn)行。接種后至煉苗前的培養(yǎng)條件為22～25℃，光照長12小時。接種一周后不定芽生成(如圖3)，不定芽高約2厘米時轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基上促其長根，生根培養(yǎng)2周后，開瓶蓋煉苗，移入培養(yǎng)土中，上罩塑料袋以維持一定濕度，兩天后拿掉，每天澆水。成活率大于80％。移入培養(yǎng)土4～5周后，組培苗形態(tài)和野生苗相同，生長健壯，開隱花，結(jié)種，能完成整個生活史(如圖4)。該實(shí)施例培育的寶山堇菜，可直接用于相應(yīng)科學(xué)試驗(yàn)，以及應(yīng)用于修復(fù)重金屬污染土壤或水體。
實(shí)施例2取野生寶山堇菜的葉片為外植體，流水沖洗干凈，切成0.5cm2的小塊，0.1％HgCl2中浸泡10分鐘，然后，用無菌水沖洗5次，接種于激素比為1mg/L KT+1mg/L 2，4D時，接種3天后有白色愈傷生成，3周后，生成明顯的愈傷組織(如圖2)。愈傷組織接種于1mg/L 6-BA+1mg/L NAA配比的MS培養(yǎng)基上，1～2周有不定芽生成。接種后至煉苗前的培養(yǎng)條件為22～25℃，光照長14小時。生成的不定芽高約2厘米時轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基上促其長根，生根培養(yǎng)3周后，開瓶蓋煉苗，噴施少許水，無菌室內(nèi)培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)1天后，將苗從培養(yǎng)瓶中移出，沖洗干凈根部瓊脂，移種入培養(yǎng)土中，在組培苗上罩以透明薄膜，維持70～80％的相對濕度，3天后取走透明薄膜。移入培養(yǎng)土3～4周后，寶山堇菜組培苗形態(tài)學(xué)特征和野生苗相同，生長健壯(如圖5)。
權(quán)利要求
1.一種寶山堇菜組織培養(yǎng)快速育苗的方法，具體步驟包括1)外植體選擇及消毒處理選擇葉片或葉柄為外植體，以0.1％HgCl2為消毒劑，消毒8～12分鐘；2)不定芽誘導(dǎo)和愈傷組織生成將經(jīng)上述處理的外植體接種于如下之一的添加激素的MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織生成a.激素比為0.5～1.0mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L NAA，接種一周后有不定芽生成，不定芽生長迅速，接種2～3周后，不定芽高約2～3厘米；b.激素比為0.5～1mg/L KT+1～1.5mg/L 2，4-D，接種2～3天后有白色愈傷生成，3～4周后，生成明顯的愈傷組織；愈傷組織接種于0.5～1.0mg/L 6-BA+0.5～1.5mg/L NAA配比的MS培養(yǎng)基上，接種1～2周有不定芽生成；3)生根培養(yǎng)將上述獲得的不定芽轉(zhuǎn)接于1/2或1MS基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根；上述步驟2)和3)的培養(yǎng)條件為光照12～14小時/天，溫度22～25℃；4)煉苗與移栽生根培養(yǎng)2～3星期后或待寶山堇菜苗長4～5cm，開培養(yǎng)瓶煉苗，移種于培養(yǎng)土中，在組培苗上罩以透明薄膜，維持70～80％的相對濕度，2～4天后取走透明薄膜，得到組培苗。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征是步驟1)外植體消毒處理的時間為10分鐘。
3.按照權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征是步驟4)開培養(yǎng)瓶煉苗時，最好是先在無菌室內(nèi)培養(yǎng)2天，轉(zhuǎn)移到溫室培養(yǎng)1天后，再將苗從培養(yǎng)瓶中移出，沖洗干凈根部瓊脂，移種于培養(yǎng)土中。
全文摘要
本發(fā)明提供一種寶山堇菜(Viola baoshanensis)組織培養(yǎng)快速育苗方法。該方法選取野生寶山堇菜的葉片或葉柄為外植體，消毒后接種于添加的激素配比為0.5～1.0mg/L 6－BA+0.5～1.5mg/L NAA或0.5～1mg/L KT+1～1.5mg/L 2，4－D的MS誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)不定芽和愈傷組織生成，再經(jīng)生根培養(yǎng)及煉苗、移栽，得到組培苗。繁育的寶山堇菜苗在培養(yǎng)基上和土壤中均能完成生活史，移栽成活率大于80％，從接種到馴化，周期2～3個月，繁殖系數(shù)高。利用本發(fā)明的方法，可快速、大量培育重金屬超富集植物寶山堇菜。
文檔編號A01H4/00GK1554229SQ20031011744
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月22日
發(fā)明者鄧冬梅, 束文圣, 廖斌, 藍(lán)崇鈺, 陳同斌, 張軍, 彭光天 申請人:中山大學(xué)