專利名稱：改良植物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于改良植物的方法，更具體地說是一種用于增加植物中某些類異戊二烯化合物，特別是甾醇的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)已提出了多種用于改變植物中類異戊二烯產(chǎn)物的方法。
盡管只有少數(shù)幾種甾醇存在于動(dòng)物中，而且膽甾醇顯然是其中主要的一種，但是植物中卻發(fā)現(xiàn)了很多種甾醇。這些甾醇間結(jié)構(gòu)差別是由于側(cè)鏈中的不同取代以及四元環(huán)骨架中雙鍵的數(shù)目與位置所引起的。
植物甾醇可以根據(jù)一種或多種官能團(tuán)存在與否分組。例如根據(jù)C4上的甲基化水平可將甾醇分類如下4-脫甲基甾醇或終產(chǎn)物甾醇、4-單甲基甾醇和4，4-二甲基甾醇。天然存在的4-脫甲基甾醇包括谷甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、Δ7-燕麥甾醇和菜油甾醇。4，4-二甲基甾醇包括環(huán)阿屯醇和24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24-methylenecycloartanol)，4-單甲基甾醇包括24-亞甲基4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24-methylene lophenol)和2 4-亞乙基4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24-ethylidene lophenol)。大多數(shù)較高等植物中，帶有一個(gè)游離3-羥基的甾醇(游離甾醇)是主要終產(chǎn)物。但是，甾醇也會(huì)生成偶聯(lián)形式，例如，當(dāng)3-羥基被脂肪酸鏈、石碳酸或糖基酯化生成甾醇酯。在本說明書中甾醇是指游離甾醇和偶聯(lián)甾醇。但是，在本申請中甾醇水平、量或百分比是指甾醇基團(tuán)的總重量，而偶聯(lián)基團(tuán)如脂肪酸、石碳酸或糖基的重量不計(jì)算在內(nèi)。
迄今為止，大部分以操作植物內(nèi)甾醇為目的的研究都涉及除4-脫甲基甾醇之外的甾醇，以增強(qiáng)植物對(duì)害蟲或殺真菌劑的抗性。
WO 98/45457描述了調(diào)節(jié)植物甾醇組合物以賦予對(duì)昆蟲、線蟲、真菌和/或環(huán)境脅迫的抗性，和/或者通過使用雙鏈DNA分子以提高植物的營養(yǎng)價(jià)值，這種DNA分子中含有啟動(dòng)子、編碼第一種酶的DNA序列和3′非翻譯區(qū)，所述第一種酶能夠結(jié)合第一種甾醇從而產(chǎn)生第二種甾醇，所述3′非翻譯區(qū)可使得RNA 3′末端聚腺苷酸化。優(yōu)選地，所述酶選自S-腺苷-L-甲硫氨酸-Δ24(25)-甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶、C-4脫甲基酶、cycloeucalenol鈍葉醇(obtusifoliol)-異構(gòu)酶、14-α-甲基酶、Δ8-Δ7-異構(gòu)酶、Δ7-C-5-去飽和酶和24，25-還原酶。該文中唯一提及C-4甲基酶是抑制該酶以其賦予對(duì)昆蟲的抗性。該文獻(xiàn)中沒有描述C-4甲基酶在營養(yǎng)方面的用途。US 5,306,862中描述了通過增加編碼具有HMG-CoA還原酶活性多肽的基因的拷貝數(shù)提高植物中甾醇積聚量從而提高植物對(duì)害蟲抗性的方法。類似地，US 5,349,126描述了通過增加編碼具有HMG-CoA還原酶活性多肽的基因的量提高轉(zhuǎn)基因植物中角鯊烯和甾醇積聚量從而提高轉(zhuǎn)基因植物害蟲抗性的方法。
Gondet等在Plant Physiology(1994)105509-518分離出了一種煙草突變種，該突變株葉片組織中的甾醇組合物明顯改變，環(huán)丙基甾醇(cyclopropylsterols)所占比例明顯增加，HMGR活性提高了三倍。
Re等在The Plant Journal(1995)7(5)，771-784指出擬南芥(Arabidopsis thaliana)HMG CoA還原酶(HMG 1)的過表達(dá)不足以改變植物類異戊二烯途徑的大量合成以及終產(chǎn)物積聚量。
植物中，在甾醇轉(zhuǎn)移酶1(SMT1)作用下由環(huán)阿屯醇生成24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇是類異戊二烯生物合成中的一個(gè)步驟。
Bouvier-Nave等在Eur.J.Biochem.256，88-96(1988)中描述了甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶(SMTs)的兩個(gè)家族，其中第一家族(SMT1)作用于環(huán)阿屯醇，第二家族(SMT2)作用于24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇。
Schaller等在Plant Physiology(1998)118461-169中描述了在煙草中過表達(dá)來自擬南芥屬的SMT2導(dǎo)致煙草葉片中24-甲基膽甾醇與谷甾醇之間的比例改變。
Diener等在The Plant Cell(2000)12853-870中描述了擬南芥屬SMT1基因的功能特性，并且指出缺乏該基因的突變體生長遲緩繁殖力低。
Schaeffer等在Lipids(2000)35263-269中描述了在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)煙草(Nicotiana tabacum)SMT1和SMT2基因的效果。SMT1的過表達(dá)導(dǎo)致葉片中環(huán)阿屯醇水平的變化，并且伴隨著24-乙基甾醇比例的改變。SMT 2的過表達(dá)使得24-甲基膽甾醇與谷甾醇之間比例改變從而導(dǎo)致生長減緩。
WO 01/31027公開了非-反饋調(diào)控HMGR基因在甾醇生產(chǎn)中的用途。
WO 01/79513描述了SMT1基因在甾醇生產(chǎn)中的用途。
過量-生成甾醇的煙草變種已經(jīng)表現(xiàn)出環(huán)阿屯醇(CA)、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)和24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)的過量積聚(Maillot-Vernier等.Mol.Biol.Genet.23133-40，1991)。
24MCA轉(zhuǎn)化為cycloeucalenol是發(fā)生在甾醇生物合成的過程中的三個(gè)C4脫甲基反應(yīng)中的第一步(


圖1)。這其中包括去除甾醇骨架C4位上的α-甲基。另兩個(gè)去甲基化步驟是去除C4β甲基，將24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)轉(zhuǎn)化為表甾醇(episterol)以及將24Eloph轉(zhuǎn)化為Δ7-燕麥甾醇(
圖1)。
在動(dòng)物和酵母系統(tǒng)中，甾醇C4甲基去除已進(jìn)行了很好地定性(Faust等.，Biology of Cholesterol，ed.Yeagle，P.L.(CRC，Boca Raton，F(xiàn)L，USA)p.19-38，1988；Bard等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93186-190，1996)。酵母中4，4-二甲基酵母甾醇(4，4-DMZ)C4脫甲基中的第一步是被C4甾醇甲基氧化酶(ERG25)催化的，其中包括C4α甲基氧化生成羧酸。在隨后步驟中，羧基基團(tuán)被C4脫羧基酶(ERG26)移去得到C3位置上的酮基(Gachotte等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，9612655-12660，1999)。最后，C3-酮基還原酶(ERG27)還原酮基得到C3位的醇基(Gachotte等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，961810 1999)。這些催化步驟重復(fù)進(jìn)行除去甾醇骨架上的C4β甲基。與酵母不同，植物中脫去C4位上兩個(gè)甲基的機(jī)制還未充分闡明。但是，現(xiàn)已查明植物具有至少兩種特有的微粒體C4脫甲基化復(fù)合體參與了甾醇生物合成(Pascal等，J.Biol.Chem.26811639-11654，1993)。
WO 02/42477描述了將編碼特異性HMG-還原酶(HMGR)的基因與編碼甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶1的基因聯(lián)合表達(dá)可以有益地進(jìn)一步提高植物的營養(yǎng)價(jià)值，特別是其種子的營養(yǎng)價(jià)值。具體而言，非-反饋調(diào)控的HMGR與甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶1的過表達(dá)結(jié)合使得植物的營養(yǎng)有益甾醇與僅有1種上述基因表達(dá)的植物相比進(jìn)一步提高，例如所述植物的種子。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用上述技術(shù)過表達(dá)HMGR和HMGR/SMT1導(dǎo)致積聚量增加的不僅是終產(chǎn)物甾醇，還有一些甾醇中間體。這些中間體中的一部分是C4二甲基或單甲基類型(例如24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇，24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇和24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(2 4-ethylidene lophenol))。因此如果將這些甾醇中間體也能轉(zhuǎn)化為終產(chǎn)物甾醇(4-脫甲基甾醇)的話將是很有價(jià)值的。C4二-或單-甲基甾醇是在三-步驟反應(yīng)中在三種獨(dú)立的酶(C4-甾醇甲基氧化酶，C4-甾醇脫羧基酶和C3-甾醇酮基還原酶)催化下脫甲基的。
本發(fā)明的目的是改變植物中的甾醇水平，特別是植物種子中的甾醇水平，這種改良能使(有益)甾醇的水平升高或者(次期望)甾醇如膽甾醇的水平降低。
本發(fā)明還有一個(gè)目的是提高植物中甾醇水平，其中所述甾醇優(yōu)選為營養(yǎng)學(xué)上受親睞的4-脫甲基甾醇如谷甾醇、豆甾醇、 菜子甾醇、Δ7-燕麥甾醇或菜油甾醇，而且該甾醇優(yōu)選表達(dá)在種子。
本發(fā)明的另一目的是通過過表達(dá)HMGR和/或SMT1，使經(jīng)修飾植物中的4-脫甲基甾醇水平與相應(yīng)野生型植物相比升高。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種提高植物中4-脫甲基甾醇水平的方法，其中包括增強(qiáng)4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的酶促脫甲基化。
另一方面，本發(fā)明涉及一種與野生型植物相比4-脫甲基甾醇水平升高的植物，其中4-脫甲基甾醇水平升高是通過本發(fā)明的方法實(shí)現(xiàn)的。另一方面本發(fā)明還提供了可從本發(fā)明植物獲得的植物物質(zhì)。
本發(fā)明的另一方面是一種轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞，該DNA構(gòu)建體中含有編碼具有C4SMO活性多肽的DNA節(jié)段和驅(qū)動(dòng)所述多肽在所述植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子；(b)使上述轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)選取與同種植物野生型株系相比4-脫甲基甾醇水平升高的轉(zhuǎn)基因植物。
本發(fā)明的另一方面是一種用于制備含4-脫甲基甾醇的油的方法，該方法包括從本發(fā)明所述植物中提取甾醇。
另一方面，本發(fā)明提供了一種含有用本發(fā)明方法制備的油的產(chǎn)品。
本發(fā)明的另一方面是使用表達(dá)C4SMO的基因提高植物中甾醇水平。
發(fā)明詳述類異戊二烯是一個(gè)很大的化合物家族，它們存在于較高等的植物，具有不同作用。它們包括甾醇、植物激素赤霉素和脫落酸、促光合作用色素成分、植物抗毒素和多種其他專門的類萜。
甾醇，尤其是4-脫甲基甾醇吸引人們注意力是因?yàn)樗鼈儧Q定著水果和蔬菜油的營養(yǎng)品質(zhì)、口味和顏色。讓人特別感興趣的是營養(yǎng)有益的化合物如脂溶性甾醇。這些甾醇可以有效地減少冠心病，例如，當(dāng)一些植物甾醇在食物中含量增加時(shí)表現(xiàn)出降低血清膽甾醇水平，維生素E可以通過減少LDL氧化減少動(dòng)脈粥樣硬化的斑塊。
在植物種子中表達(dá)這類化合物，特別是含油種子，具有商業(yè)價(jià)值，因?yàn)閺姆N子中收獲這類成分是很方便的，一些情況下，可以將從種子中提取油與提取甾醇結(jié)合起來同時(shí)進(jìn)行，得到含高水平甾醇的油，這樣的話就可以避免或減少為獲得營養(yǎng)價(jià)值而單獨(dú)添加甾醇。
優(yōu)選的甾醇是4-脫甲基甾醇及其混合物，最優(yōu)選的是β谷甾醇、谷甾烷醇、豆甾醇、菜子甾醇、異巖藻甾醇(isofucosterol)、菜油甾醇、表甾醇，甚至更優(yōu)選的甾醇是谷甾醇、豆甾醇、菜子甾醇、avenosterol和菜油甾醇。另外優(yōu)選地，至少部分甾醇，例如占種子中甾醇總重量至少70wt％的甾醇為甾醇與C10-24脂肪酸生成的酯。
如上所述，現(xiàn)已提出了幾種改變植物中類異戊二烯水平的方法。
現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可以通過增強(qiáng)4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的酶促脫甲基化提高植物中4-脫甲基甾醇的水平。此前還未曾認(rèn)識(shí)到4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的脫甲基化是合成4-脫甲基甾醇的限速步驟，因此提高4-脫甲基甾醇產(chǎn)量的其他方法得到的是中間體4-單甲基和4，4-二甲基甾醇而不是期望的4-脫甲基甾醇。
本發(fā)明中4-單甲基和4，4-二甲基甾醇脫甲基的增強(qiáng)可以通過多種方法處理和/或修飾植物進(jìn)行，這些方法使得與未經(jīng)處理和/或修飾的植物相比脫甲基化增強(qiáng)。該方法還包括，例如，提高負(fù)責(zé)脫甲基的同源酶的表達(dá)和/或活性以及/或者編碼脫甲基酶異源基因的表達(dá)。
優(yōu)選地，通過提高植物中C-4甾醇甲基氧化酶(C4SMO)活性來增加酶促脫甲基反應(yīng)。特別優(yōu)選的是通過提高C4SMO編碼基因的表達(dá)來提高植物中C4SMO的活性。
本發(fā)明中使用的C4SMO及相關(guān)術(shù)語是指具有C-4甾醇甲基氧化酶活性的任意多肽，包括酶、該酶的片段或變體(例如，通過插入、缺失或取代1個(gè)或多個(gè)(例如1-5個(gè))氨基酸殘基得到的等位變體或突變體)或前體。測定多肽是否顯示C-4甾醇甲基氧化酶活性對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說可以很容易完成。
如果本發(fā)明的方法包括提高植物中天然存在的C4SMO基因(即同源基因)的表達(dá)，那么就改變控制表達(dá)的參數(shù)及其他因素從而使得C4SMO表達(dá)提高，優(yōu)選植物種子中的表達(dá)提高。例如，合適的方法包括將促進(jìn)分子，如轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)。替代地或追加地，可以強(qiáng)特異性啟動(dòng)子插入植物基因組確保C4SMO基因表達(dá)上調(diào)。合適方法的另一實(shí)例包括增加“同源”C4SMO基因的拷貝數(shù)從而增強(qiáng)其表達(dá)。
替代地，所述C4SMO基因可以是異源基因，例如源自其它植物、動(dòng)物和微生物，例如C4SMO基因可以來自擬南芥、煙草或酵母。編碼C4SMO的基因優(yōu)選源自Arabidopsis，例如擬南芥。本發(fā)明使用的編碼C4SMO的DNA節(jié)段可以適當(dāng)?shù)孬@自動(dòng)物、微生物或植物。
替代地，可以從基因文庫中分離等價(jià)基因，例如通過使用DNA探針的雜交技術(shù)。C4SMO及編碼C4SMO基因的一實(shí)例見圖2。
編碼C4SMO的基因序列可操作地(即，定位以確保功能)與一個(gè)或多個(gè)合適啟動(dòng)子連接從而使得該DNA得以被轉(zhuǎn)錄。合適的啟動(dòng)子與該基因可以是同源的也可以是異源的，這些可用于植物表達(dá)的啟動(dòng)子已為本領(lǐng)域所熟知，例如Weising等，(1988)，Ann.Rev.Genetics，22，421-477)中所述的啟動(dòng)子。用于本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是誘導(dǎo)型的、組成型的或組織特異性的，或者這些特征的各種結(jié)合。有用的啟動(dòng)子包括，但不限于，組成型啟動(dòng)子如康乃馨蝕環(huán)病毒(CERV)、花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子，或者更具體地為雙倍增強(qiáng)的花椰菜花葉病毒啟動(dòng)子，其中含有前后串聯(lián)在一起的兩個(gè)CaMV 35S啟動(dòng)子(稱為″雙35S″啟動(dòng)子)。
特定情況下可以使用組織特異性或發(fā)育調(diào)控啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子。組織特異性啟動(dòng)子可以使得在特定組織中過表達(dá)而同時(shí)又不影響其他組織中的表達(dá)。例如，一種用于在種子組織中過表達(dá)酶的優(yōu)選啟動(dòng)子為WO 92/18634中所述的ACP啟動(dòng)子。
所述啟動(dòng)子和終止調(diào)控區(qū)域在宿主植物細(xì)胞中發(fā)揮作用，它們與植物細(xì)胞和基因可以是異源的(即，非天然存在的)或者同源的(源自宿主植物的種)。可以使用的合適啟動(dòng)子如上所述。
終止調(diào)控區(qū)域可以源自獲取所述啟動(dòng)子的那個(gè)基因的3′區(qū)域或者源自另一基因?？梢允褂玫暮线m終止區(qū)域?yàn)楸绢I(lǐng)域熟知，包括根癌農(nóng)桿菌胭脂堿合成酶終止子(Tnos)、根癌農(nóng)桿菌甘露氨酸合成酶終止子(Tmas)和CaMV 35S終止子(T35S)。用于本發(fā)明的特別優(yōu)選的終止區(qū)域包括豌豆核酮糖二磷酸羧化酶小亞基終止區(qū)域(TrbcS)或Tnos終止區(qū)域。
合適地可以通過下述操作對(duì)所述基因構(gòu)建體進(jìn)行活性篩選通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化入宿主植物，然后篩選4-脫甲基甾醇水平升高的構(gòu)建體。
合適地，基因的核苷酸序列可以取自Genbank核苷酸數(shù)據(jù)庫，尋找不能對(duì)其進(jìn)行切割的限制性酶?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法將這些限制性位點(diǎn)添加入基因，例如將這些位點(diǎn)引入PCR引物或者通過亞-克隆引入。
優(yōu)選地，可用于本發(fā)明的DNA構(gòu)建體包含在載體內(nèi)，更合適的是適于在合適宿主(植物)細(xì)胞中表達(dá)的表達(dá)載體。可以理解的是任何可以生產(chǎn)含有導(dǎo)入DNA序列的植物的載體都可以。
合適的載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，描述見普通的技術(shù)文獻(xiàn)如Pouwels等，cloning vector.Alaboratory manual，Elsevier，Amsterdam(1986)。特別優(yōu)選的合適載體包括Ti質(zhì)粒載體。
用于將本發(fā)明DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)化技術(shù)為本領(lǐng)域熟知，包括農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、顯微注射、使用聚乙二醇、電穿孔或者高速彈道穿進(jìn)(high velocity ballistic penetration)。
植物細(xì)胞或植物轉(zhuǎn)化后，已經(jīng)引入目的DNA的那些植物細(xì)胞或植物可以用，例如抗生素抗性、殺蟲劑抗性、對(duì)氨基酸類似物的耐受或使用表型標(biāo)記物等方法來篩選。
可以使用各種測定方法測定植物細(xì)胞是否表現(xiàn)基因表達(dá)的增加，例如，Northern印跡或定量逆轉(zhuǎn)錄酶PCR(RT-PCR)。可以通過常規(guī)方法從轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞再生出完整的轉(zhuǎn)基因植物。類異戊二烯水平升高的這類轉(zhuǎn)基因植物可以繁殖并且自體授粉生成純合系。所述植物生產(chǎn)含具有導(dǎo)入特性基因的種子，可以被培育生產(chǎn)出具有選擇表型的植物。
優(yōu)選地，植物中4-單甲基甾醇和4，4-二甲基甾醇的水平降低。因此， 優(yōu)選地，與未增加酶促脫甲基反應(yīng)的植物相比，4-脫甲基甾醇相對(duì)于4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的比例提高，。
優(yōu)選地，基于總的甾醇的重量4-脫甲基甾醇的水平，例如植物種子中的水平，與未經(jīng)根據(jù)甾醇總重增加酶促脫甲基化的相應(yīng)植物中的水平相比高出至少5wt％，更優(yōu)選高出7wt％以上?；诳偟溺薮嫉闹亓?，4-單甲基甾醇的水平，例如植物種子中的水平，優(yōu)選低于未經(jīng)增強(qiáng)酶促脫甲基反應(yīng)的相應(yīng)植物中水平的75wt％，更優(yōu)選低于50wt％。植物種子中4-脫甲基甾醇的總水平優(yōu)選占甾醇總重的至少80wt％，更優(yōu)選至少85wt％。
可以使所述植物中甾醇中間體的水平，例如所述植物種子或葉片中的水平相對(duì)于野生型植物發(fā)生改變。本發(fā)明所述植物中環(huán)阿屯醇(CA)與24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)重量比，例如葉片中，優(yōu)選為至少3∶1，更優(yōu)選至少4∶1，甚至更優(yōu)選至少5∶1，最優(yōu)選在6∶1-20∶1的范圍。
本發(fā)明還涉及來自4-單甲基和4，4-二甲基甾醇酶促脫甲基反應(yīng)已增加的植物的種子。特別優(yōu)選的含油種子為煙草種子、加拿大雙低油菜-卡諾拉(canola)種子、油菜種子、向日葵種子和大豆種子?？梢允褂萌我环椒◤倪@些種子中提煉油。
本發(fā)明的植物優(yōu)選為煙草、加拿大雙低油菜-卡諾拉、向日葵、油菜或大豆。
本發(fā)明方法優(yōu)選用于提高植物中4-脫甲基甾醇水平，該植物已經(jīng)修飾與野生型植物相比提高了4-單甲基和/或4，4-二甲基甾醇的產(chǎn)量。例如，所述植物可以具有與野生型植物相比提高了的HMGR活性。
替代提高HMGR活性或再附加，所述植物可以具有與野生型植物相比提高了的SMT1活性。
例如，所述植物已經(jīng)修飾從而將非反饋抑制的HMGR基因與甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶1聯(lián)合引入，將這種基因聯(lián)合與本發(fā)明方法一起使用，對(duì)提高4-脫甲基甾醇水平特別有好處，因?yàn)檫@樣可以降低終產(chǎn)物中中間體化合物相對(duì)于期望的4-脫甲基甾醇的比例。
所述非反饋抑制的HMG還原酶可以是一種由截短的非植物HMGR基因表達(dá)的酶，優(yōu)選地所述截短導(dǎo)致酶不含膜結(jié)合區(qū)，但是該基因的HMGR功能優(yōu)選仍然保留。所述基因的實(shí)例是截短的倉鼠或酵母HMGR基因。
非反饋抑制的HMG還原酶的第二個(gè)實(shí)例是由來自類異戊二烯高產(chǎn)植物的HMGR基因表達(dá)的酶，例如橡膠(Hevea brasiliensis)。特別優(yōu)選的是來自橡膠等類異戊二烯高產(chǎn)植物基因制備的截短形式的HMGR，最優(yōu)選的截短形式是所述HMGR不含膜結(jié)合區(qū)。
完整的HMGR酶含有三個(gè)區(qū)含酶活性位點(diǎn)的催化區(qū)、將酶錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的膜結(jié)合區(qū)以及將酶的催化區(qū)及膜結(jié)合區(qū)連接在一起的連接區(qū)。
所述膜結(jié)合區(qū)位于酶的N末端區(qū)域，而所述催化區(qū)位于C末端區(qū)域。大部分植物中的反饋抑制通常需要酶的膜結(jié)合區(qū)的存在。因此，優(yōu)選使用表達(dá)含有滅活膜結(jié)合區(qū)或不含膜結(jié)合區(qū)的酶的HMGR基因，從而優(yōu)選所述基因用于提高植物組織中，例如植物種子的4-脫甲基甾醇水平。
合適的截短的HMGR基因的描述見WO 01/31027，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考。
優(yōu)選地，所述HMGR基因分離自橡膠。可以使用所述植物基因的特別優(yōu)選的截短形式?？梢詫⑻禺愋詥?dòng)子插入植物基因組以確保HMGR基因的表達(dá)被上調(diào)，優(yōu)選在植物的種子組織內(nèi)。
所述植物可已經(jīng)過修飾以使得SMT1活性升高。SMT1活性升高的植物的描述見WO 01/79513，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考。
合適地，所述SMT1基因可以天然存在于植物中。然后改變環(huán)境使SMT1的表達(dá)升高，優(yōu)選在植物的種子區(qū)域發(fā)生表達(dá)升高。實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)可行的方法是上調(diào)促進(jìn)分子(facilitating molecules)，例如轉(zhuǎn)錄因子。替代地，可以將特異性啟動(dòng)子插入植物基因組確保SMT1基因上調(diào)。替代地，可以增加“同源”SMT1基因的拷貝數(shù)從而提高其表達(dá)。
替代地，所述SMT1基因可以是異源基因，例如源自其他植物或微生物。例如，所述SMT1基因可源自Arabidopsis、煙草或酵母。
可以修飾植物使之具有提高的HMGR活性和提高的SMT1活性。例如，WO 02/42477(該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考)公開了將編碼特異性HMG-還原酶(HMGR)的基因與編碼甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶1的基因聯(lián)合表達(dá)的植物。
膽甾醇食物制品中不受消費(fèi)者歡迎的成分，消費(fèi)者想要減少其膽甾醇的攝入量。降低血清膽甾醇水平可以減少心血管病的發(fā)病危險(xiǎn)。因此，本發(fā)明優(yōu)選導(dǎo)致植物組織，特別是植物種子中膽甾醇水平降低，具體為三酰甘油占干重10wt％以上的含油種子。
本發(fā)明的植物具有與野生型植物相比水平升高了的4-脫甲基甾醇。優(yōu)選地，與野生型植物相比所述植物中4-脫甲基甾醇相對(duì)于4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的比例升高。更優(yōu)選地，水平和比例的升高發(fā)生在葉片和/或種子，特別是種子。
制備本發(fā)明所述油的方法包括從本發(fā)明所述植物中提取甾醇。用于從植物中提取甾醇的方法已為本領(lǐng)域熟知。優(yōu)選地，所述油提取自植物種子。所述種子是通過培育該植物一代或多代然后收獲種子獲得的。
除甾醇外，所述油還含有經(jīng)常出現(xiàn)于植物中的其他化合物，例如甘油三酯。替代地，可以對(duì)所述油進(jìn)行一步或多步純化從而提高油中甾醇的含量，特別是4-脫甲基甾醇的含量。
可獲自本發(fā)明植物的植物物質(zhì)可以是植物的任一部分，包括根、葉、莖和種子。優(yōu)選地，所述植物物質(zhì)是葉或種子，更優(yōu)選為種子。所述植物物質(zhì)可以是直接取自植物的葉或種子，或者是經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)附加處理步驟得到的，例如洗滌、干燥、切削、研磨以及熱處理中的一種或多種。
含有本發(fā)明油的制品可適合用于多種不同用途中的一種或多種。例如，所述制品可以是食物制品、食品加工中使用的油、潤滑油、燃料油或者制備碳?xì)浠衔锸褂玫脑?。所述制品中可含有適于該制品所需用途的添加劑，例如，當(dāng)所述制品是食物制品時(shí)為食品防腐劑和/或穩(wěn)定劑。所述制品可以是單一的油相，或者所述油可以分散、懸浮或乳化于另一種液體，例如，油包水或者水包油乳劑。
現(xiàn)在用下列非限制性實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。在實(shí)施例和本說明書全文中，提到的百分比除另有說明外都是占總重量的重量百分比。
實(shí)施例結(jié)合下列附圖
圖1表示的是環(huán)阿屯醇后的甾醇生物合成途徑，突出顯示C4-脫甲基步驟。實(shí)線代表一種的催化轉(zhuǎn)化，虛線代表不止一種的催化轉(zhuǎn)化。
圖2表示的是AtC4SMO的推定的開放閱讀框以及相應(yīng)翻譯出的蛋白。富含組氨酸的基序用下劃線標(biāo)出。
圖3表示的是對(duì)代表性選取的NH65品系的葉片組織中AtC4SMO轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR分析。
圖4表示的是選取的NH65品系成熟種子中CA24MCA、CA24Mloph和CA24Eloph的比值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
圖5表示的是對(duì)NH65和MH7xNH65品系葉片組織中AtC4SMO轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR分析。
圖6A表示的是選取的MH7xNH65品系的成熟葉片組織中CA/24MCA、CA/24Mloph和CA/24Eloph的比值。
圖6B表示的是選取的MH7xNH65品系的成熟種子組織中CA/24MCA、CA/24Mloph和CA/24Eloph的比值。誤差線表示標(biāo)準(zhǔn)偏差。
實(shí)施例實(shí)驗(yàn)方法菌株和質(zhì)粒所有克隆方法中都使用大腸桿菌DH5a(Gibco BRL)作為宿主菌株。37℃下，將大腸桿菌培養(yǎng)于置于旋轉(zhuǎn)搖床上的LB培養(yǎng)基(10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl)中，該培養(yǎng)基添加了合適的篩選壓力(氨芐青霉素100μg/mL或卡那霉素50μg/mL)。
PCR克隆載體pGEM-T easy獲自Promega。雙元載體pSJ35是通過用Klenow酶將pGPTV-HYG中的BamHI限制性酶切位點(diǎn)填滿制得的(Becker等.，Plant Mol.Biol.20，1195-1197，1992).
質(zhì)粒pNH2中含有康乃馨蝕環(huán)病毒(CERV)啟動(dòng)子和胭脂堿合成酶(NOS)終止子，此前已有描述見WO 01/31027(參見實(shí)施例4)。
酶及化學(xué)藥品限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、分子標(biāo)志(X，XIV和XVII)和Taq DNA聚合酶都購自Roche。Pfu DNA聚合酶獲自Stratagene。酶的使用遵照供應(yīng)者的建議。生化藥劑購自Sigma Chemical Co.。使用的所有化學(xué)藥品和試劑都是分析純的，獲自Fisher Scientific UK或BDH。
植物材料煙草SR1(Petite Havana)生長在MS-培養(yǎng)基或堆肥/珍珠巖混合物(2∶1)(Murashige and Skoog，Physiol Plant 15，473-497，1962)。生長室溫度保持在22℃，使用的晝/夜循環(huán)為16h/8h。光強(qiáng)度為40μmolm-2s-1。
寡核苷酸的合成所有的寡核苷酸都是合成的，匯集于表1。
表1.寡核苷酸引物(按從5′到3′端的方向)
a，引入一個(gè)HindIII位點(diǎn)(下劃線)。b，引入酵母翻譯起始位點(diǎn)(斜體)。C，引入一個(gè)EcoRI位點(diǎn)(下劃線)。d，Af1III位點(diǎn)(下劃線)。e，SacI位點(diǎn)(下劃線)。
從擬南芥克隆C4SMO
用來自酵母的ERG25蛋白的一級(jí)序列作為BLAST的查詢序列搜索Arabidopsis數(shù)據(jù)庫(位于Stanford)中的所有非冗余蛋白。由該方法得到登記號(hào)為At2g29390的推定的擬南芥C4SMO。
用Pharmacia QuickPrep micro mRNA純化試劑盒按照供應(yīng)商的推薦方法從12日齡的擬南芥(Columbia生態(tài)型)幼苗中分離信使RNA。用oligo(dT)包被的纖維素親和分離mRNA。通過將Poly-A RNA(1μg)與引物RoRidT17(10pmol)混合于11.34μL DEPC處理后的水中，合成出第一鏈DNA。將混合物在70℃下混合10分鐘然后在濕冰上放置2分鐘。加入第一鏈緩沖液(1X)、DTT(0.1μmol)、RNA酶蛋白抑制劑(RNAsin)(22U)、dNTP(20nmol)和Superscript(200U)至終體積20μl。將混合物在37℃下孵育60分鐘得到ArabidopsiscDNA庫。
使用PCR和基因特異性引物C4S01和C4S02(表1)，從Arabidopsis cDNA或基因組DNA庫中擴(kuò)增出推定的AtC4SMO基因。使用如下擴(kuò)增程序1個(gè)循環(huán)94℃(2min)，5個(gè)循環(huán)94℃(30s)，40℃(30s)，72℃(2min)，30個(gè)循環(huán)94℃(30s)，40℃(30s)，72℃(90s)和1個(gè)循環(huán)72℃(7min)，4℃(存放)。使用校讀酶Pfu Turbo DNA聚合酶將引入的錯(cuò)配數(shù)目減至最低。將擴(kuò)增片段(來自cDNA或基因組DNA)克隆入PCR產(chǎn)物克隆載體pGEM-T Easy，按照供應(yīng)商推薦的方法(Promega)。選取含推定AtC4SMO CDNA或基因組AtC4SMO片段的克隆，使用引物M13/pUC通配正向和反向引物，C4SO1和C4SO2測序。
植物表達(dá)載體使用引物對(duì)c1C4SOp1/c1C4SOp2通過PCR擴(kuò)增AtC4SMO，將限制性酶切位點(diǎn)Af1III和SacI分別導(dǎo)入基因的5′和3′末端。該擴(kuò)增反應(yīng)在常規(guī)條件下進(jìn)行，使用校讀酶Pfu Turbo DNA聚合酶將錯(cuò)配減至最低。將得到的擴(kuò)增產(chǎn)物純化，用Af1III和SacI切割，然后插入pNH2，位于康乃馨蝕環(huán)病毒(CERV)啟動(dòng)子的下游和胭脂堿合成酶(NOS)終止子上游，得到pNH64。通過消化(HindIII和EcoRI)切割出pNH64中的表達(dá)框，然后插入pSJ35的相應(yīng)位點(diǎn)得到pNH65。使用引物CERV1S、c1C4Sop1、c1C4Sp2和NosAs對(duì)載體pNH64測序，使用引物CERV1S和NosAs對(duì)pNH65測序，以證實(shí)其真實(shí)性。
測序測序使用的所有質(zhì)粒DNA都用Qiagen mini spin試劑盒進(jìn)行了純化。測序使用熒光標(biāo)記核苷酸在ABI 377測序儀上進(jìn)行。
植物轉(zhuǎn)化用電穿孔方法將二元載體轉(zhuǎn)化入根癌農(nóng)桿菌LBA4404(Shen andForde，Nucl.Acids Res.17，8385，1989)。煙草cv.SR1使用An等，Plant Physiol.88547-552(1988)中描述的葉盤(leaf disc)法轉(zhuǎn)化。使用引物對(duì)CERV1S/NosAs通過PCR篩選含有轉(zhuǎn)化基因的植物。將這些植物轉(zhuǎn)移入土壤。
轉(zhuǎn)錄分析使用Rnaqueous試劑盒按照供應(yīng)商推薦的方法(Ambion，Austin，USA)，從幼小(7-8葉期)的NH65和SR1植株中分離總RNA。將總RNA用Dnase處理除去其中污染的任何基因組DNA，然后用獲自Gibco-BRL的3′-RACE系統(tǒng)(Life Technologies Ltd.，UK)轉(zhuǎn)化為cDNA。用Primer Express軟件設(shè)計(jì)針對(duì)AtC4SMO(TaqC4S1和TaqC4S2)和煙草tac9肌動(dòng)蛋白(TaqA1和TaqA2)基因的Taqman引物對(duì)。這些引物對(duì)與Sybr Green(Applied Biosystems，USA)一起用于Taqman PCR反應(yīng)檢測轉(zhuǎn)基因樣本和對(duì)照樣本中AtC4SMO及tac9的轉(zhuǎn)錄本水平。按照Applied Biosystems提供的手冊，相對(duì)于SRI煙草中的轉(zhuǎn)錄本水平計(jì)算轉(zhuǎn)基因煙草中的AtC4SMO轉(zhuǎn)錄本水平。
甾醇分析將成熟的葉片和種子組織凍干，80℃下用氯仿/甲醇2∶1(v/v)抽提。過濾并除去溶劑后，將液態(tài)殘留物溶于甲苯，然后用甲醇鈉濃縮為0.33M。將混合物在80℃下加熱30分鐘，然后在5.6％(w/v)三氟化硼存在條件下80℃繼續(xù)加熱10min。在二乙醚抽提和水洗滌后，蒸發(fā)去醚，通過加入三甲基氯硅烷/N，O-雙(三甲基硅烷基)乙酰胺(5∶95)然后50℃加熱10分鐘將游離甾醇硅烷基化。用裝配有BPX5柱的Perkin Elmer 8420 GC進(jìn)行了GC分析。溫度程序?yàn)?0-230℃的升溫速率為45℃/分鐘，然后230-280℃的升溫速率4℃/分鐘，355℃保持6分鐘。使用Turbochrom軟件對(duì)峰值區(qū)進(jìn)行自動(dòng)計(jì)算。使用連接于Quadrapole 5972A MSD的Hewlett Packard 5890 GC鑒定甾醇。
實(shí)施例1從Arabidopsis克隆C4SMO用來自酵母(ERG25)的C4SMO的一級(jí)序列作為探針對(duì)擬南芥蛋白組進(jìn)行搜索鑒定同源蛋白。發(fā)現(xiàn)了一種與ERG25具有37％同一性的推定的C4SMO(At2g29390)。設(shè)計(jì)PCR引物從cDNA庫或基因組DNA擴(kuò)增出相應(yīng)的AtC4SMO基因。cDNA克隆含有一個(gè)762bp的開放閱讀框(ORF)，該閱讀框編碼一253個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)(圖2)。AtC4SMO的預(yù)期分子量為29.5-kDa。該蛋白不僅與ERG25蛋白(36.5-kDa)類似，而且類似于純化自大鼠肝的29-kDa C4SMO(Maitra等.，Biochem.Biophys.Res.Commun.108517-525，1982)。AtC4SMO的一級(jí)序列含有4個(gè)富含組氨酸的基序(H139RILH，H152SVHH，H210CGYH，H232DYHH)，表明為非-亞鐵血紅素的含鐵酶(Shanklin等，Biochem.3312787-12794，1994)。此前已提出ERG25屬于同一類酶(Bard等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93186-190，1996)，這進(jìn)一步支持了AtC4SMO是ERG25的植物同系物。
將基因組序列與推定的AtC4SMO ORF比對(duì)，AtC4SMO ORF揭示出拼接模式，其中含有6個(gè)外顯子和5個(gè)內(nèi)含子。用SeqWeb軟件包(Genetic Computer Group Inc)分析AtC4SMO中是否存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)AtC4SMO具有一可能的氨基-末端信號(hào)肽，該信號(hào)肽引導(dǎo)多肽遷移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。但是，羧基末端不含有停留于ER內(nèi)腔必需的特征性的KDEL基序。用疏水標(biāo)繪(hydrophobicity plots)沒有鑒定出明確的切割位點(diǎn)，但是鑒定出了三個(gè)可能的跨膜結(jié)構(gòu)域(第64-86位、第99-121位、154-176位氨基酸)。綜合分析，這些論斷表明AtC4SMO是一種定位于ER膜的整合膜蛋白(integral membraneprotein)。這與甾醇生物合成中涉及的其他酶的定位一致，例如HMGR(Bach等.，Crit.Rev.Biochem.Mol.Biol.34107-122，1999)。
野生型煙草中的AtC4SMO過表達(dá)將AtC4SMO置于位于胭脂堿合成酶(NOS)終止子上游的組成型康乃馨蝕環(huán)病毒(CERV)啟動(dòng)子的調(diào)控之下，得到二元載體pNH65。用該載體通過葉盤法轉(zhuǎn)化野生型煙草，用潮霉素(25mg/L)篩選轉(zhuǎn)化株。對(duì)30個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR篩選。用實(shí)時(shí)PCR對(duì)選取的轉(zhuǎn)基因品系中AtC4SMO轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行了分析。如圖3所示，被分析的NH65品系都顯示AtC4SMO表達(dá)升高。最高的表達(dá)品系NH6516展現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄水平比野生型對(duì)照平均水平高23倍。
對(duì)NH65品系葉片和種子組織中的甾醇含量進(jìn)行了分析。為了評(píng)估AtC4SMO的表達(dá)效果，計(jì)算環(huán)阿屯醇(CA)與24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)，24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)或24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)的比例。葉片中甾醇的積聚高度地依賴于組織的齡期(Chappell等，Plant Physiol.109，1337-1343，1995；Schaller等，Plant Physiol.118461-469，1995)，這在成熟煙草葉片中總甾醇含量不同上得到清楚反映，但是比值計(jì)算克服了這一情況。另外，由于CA是第一個(gè)甾醇-中間體，所以CA的量能夠反映劃分給甾醇生物合成的碳的通量。因此，如果C4SMO的任一種底物的相對(duì)水平降低的話，那么CA與24MCA、24Mloph或24Eloph的比值將增大。
對(duì)5個(gè)獨(dú)立SR1和3個(gè)NH65品系的葉片組織中的CA、24MCA、24Eloph及總甾醇進(jìn)行了測量(表2)。
表2野生型煙草葉片及表達(dá)AtC45M O的煙草葉片中環(huán)阿屯醇(CA)、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)、24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)和總甾醇的水平
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立SR1植株計(jì)算得到的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，干重的％。c，檢測下限＜0.001％干重。d，使用0.001％干重計(jì)算CA24MCA和CA24Eloph之比。
24Mloph的水平低于檢測下限(＜0.001％干重)，因此被排除在外。根據(jù)高的AtC4SMO轉(zhuǎn)錄水平選擇3個(gè)NH65品系(圖3)。在所有被分析的NH65品系中，24MCA的絕對(duì)含量全部降低(表2)。NH65品系的CA24MCA比值為4.5(NH6518)和10.3(NH657)，明顯高于野生型(SR1)的數(shù)值(2.6)。這表明推定的AtC4SMO能夠?qū)?4MCA轉(zhuǎn)化為下游產(chǎn)物。所有3個(gè)NH65品系葉片中24Eloph的量都無法檢測(＜0.001％ of dry weight)，而野生型對(duì)照的該數(shù)值為干重的0.0037％(表2)。當(dāng)24Eloph無法檢測時(shí)，使用檢測下限0.001％干重估計(jì)CA24Eloph的比值。與野生型對(duì)照(2.9)相比，NH65品系中的CA24Eloph比值明顯增大(達(dá)到11.3)(表2)。這表明AtC4SMO還能催化24Eloph轉(zhuǎn)化為下游的甾醇產(chǎn)物。
另外，還對(duì)10個(gè)獨(dú)立的NH65品系的種子組織中的甾醇組成進(jìn)行了分析。如表3所示，在所有10個(gè)NH65品系中，24MCA和24Eloph的水平都明顯降低，而24Mloph水平卻無明顯變化。計(jì)算CAC4SMO底物之比也反映了這樣的變化。CA24MCA之比排名前5位的NH65品系中的這一比值比野生型煙草高出兩倍多，排名首位的NH65品系中CA24Eloph之比比野生型高出4倍多(圖4)。但是，NH65品系中的CA24Mloph比值卻與對(duì)照保持不變。
表3野生型煙草和表達(dá)AtC4SMO的煙草種子中環(huán)阿屯醇(CA)，24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)、24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)，24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)及總甾醇的水平
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立的SR1植株計(jì)算處的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，干重的％種子中，AtC4SMO優(yōu)選催化24MCA和4Eloph的轉(zhuǎn)化，而24Mloph的水平保持不變。葉片中，AtC4SMO還催化24MCA和24Eloph向下游甾醇的轉(zhuǎn)化，但是由于該組織中24Mloph沒有達(dá)到可檢測水平，所以不能確定24Mloph的轉(zhuǎn)化是否發(fā)生。
過表達(dá)C4SMO的煙草種子中4，4-二甲基-，4-單甲基-和4-脫甲基甾醇的分布發(fā)生變化計(jì)算野生型(SR1和SJ35)和NH65品系種子組織中含量最豐富的二-，單-和脫-甲基甾醇的相對(duì)分布。4，4-二甲基甾醇包括環(huán)阿屯醇和24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇，4-單甲基甾醇包括24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇和24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇，而4-脫甲基甾醇包括Δ7-燕麥甾醇、異巖藻甾醇，谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和膽甾醇。如表4所示，NH65品系種子中4，4-二甲基甾醇的相對(duì)水平與野生型相比無明顯不同。但是，所有NH65品系中4-單甲基甾醇相對(duì)水平與對(duì)照水平相比全部降低。另外，25個(gè)NH65品系中23個(gè)的4-脫甲基甾醇相對(duì)水平升高。此外，AtC4SMO轉(zhuǎn)錄與甾醇譜之間的強(qiáng)相關(guān)表現(xiàn)在NH6516品系上，NH6516品系表現(xiàn)出最低相對(duì)水平的4-單甲基甾醇，最高相對(duì)水平的4-脫甲基甾醇和最高的AtC4SMO轉(zhuǎn)錄水平(圖3，表4)。
表4.過表達(dá)AtC4SMO的煙草中4，4-二-、4-單-和4-脫甲基甾醇的相對(duì)水平
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立SR1和SJ35計(jì)算出的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，二甲基甾醇包括環(huán)阿屯醇和24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇。c，單甲基甾醇包括24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇和24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇。d，脫甲基甾醇包括Δ7-燕麥甾醇、異巖藻甾醇、谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇和膽甾醇。e，計(jì)算為占總甾醇的％。
實(shí)施例2C4SMO、tHMGR和SMT1在轉(zhuǎn)基因煙草中的共表達(dá)在高甾醇背景中過表達(dá)AtC4SMO已經(jīng)獲得了共表達(dá)橡膠hmg1截短形式和煙草SMT1的煙草植株，描述見WO 02/42477。
用橡膠hmg1作為模板，克隆出了Hevea HMGR的不含N-末端膜結(jié)合區(qū)域的截短形式。使用根據(jù)公開的序列[Chye等(1991)PlantMol Biol 19473-84]設(shè)計(jì)的引物克隆Hevea brasiliensis(H.B.K.)Mull.Arg.thmgl。正向引物5′-CCTACCTCGGAAGCCATGGTTGCAC-3′I中引入克隆用的一個(gè)新的起始密碼子(粗體)和一個(gè)Nco I限制酶切位點(diǎn)(下劃線)。反向引物5′-CATTTTACATTGCTAGCACCAGATTC-3′含有一個(gè)下游亞克隆使用的Nhe I限制酶切位點(diǎn)(下劃線)。使用質(zhì)粒pNH8作為PCR(30個(gè)循環(huán))的模板DNA，使用Pfu聚合酶在常規(guī)條件下進(jìn)行，得到預(yù)期大小約為1.3kb的片段。得到的thmg1基因編碼全長(575個(gè)氨基酸)hmg1序列中的第153-575位氨基酸(PCT/EP/00/09374中的
圖11b)。按照廠商的說明書，將所述thmg1 PCR產(chǎn)物克隆入pGEM-T載體(Promega)，然后測序證實(shí)真實(shí)性。將H.brasiliensis tHMG1克隆入pNH4(參見PCT/EP/00/009374)多接頭中的NcoI和NheI位點(diǎn)之間，得到pMH3，這些酶切位點(diǎn)位于CaMV 35S雙啟動(dòng)子(double promoter)和nos終止子之間(參見PCT/EP/00/09374)。通過用Xma CI和Sal I消化分離這種嵌合基因，然后進(jìn)行純化并克隆入pNH9中相應(yīng)的多接頭位點(diǎn)，在除去了原先位于該位點(diǎn)的嵌合全長hmg1基因后，隨后進(jìn)行二元載體的純化。通過首先將來自pNH2的Cerv啟動(dòng)子和nos終止子框插入消化后的pSJ34的EcoRI和XmaI之間，得到二元載體pNH9，然后將煙草甾醇甲基轉(zhuǎn)移酶1型(Ntsmtl-1)的基因置于Cerv啟動(dòng)子的調(diào)控之下。所述二元載體pNH9還含有克隆自煙草的smt1基因，該基因被置于CERV病毒啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控之下。這種二元構(gòu)建體命名為pMH7。
將電感受態(tài)(Electrocompetent)根癌農(nóng)桿菌細(xì)胞(菌株LBA4404)置于冰上解凍，然后加入5ng載體質(zhì)粒。然后將加質(zhì)粒的細(xì)胞放置入預(yù)冷的電穿孔容器，用Bio Rad Gene Pulser進(jìn)行電穿孔，參數(shù)為25pF電容和600ohms。電穿孔后立即加入950μl的2X TY肉湯，輕輕地混合細(xì)胞，然后裝入滅菌小瓶中。將細(xì)胞在28℃下振搖2小時(shí)，然后將25μl的等份置于含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml的固體Lennox培養(yǎng)基，28℃下孵育3天。用單個(gè)菌落接種到10μl水(用于PCR驗(yàn)證)和500μl含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml的Lennox培養(yǎng)基。
將PCR陽性培養(yǎng)物接種10ml含利福平50μg/ml和卡那霉素50μg/ml的Lennox培養(yǎng)基肉湯。將過夜培養(yǎng)物3000g離心，然后重懸于等體積的MS培養(yǎng)基(3％蔗糖)。從生長在組織培養(yǎng)基中的植株的幼嫩煙草葉片切取葉片節(jié)段(Leaf segments)。將節(jié)段直接置入農(nóng)桿菌溶液，放置10分鐘。然后取出該節(jié)段，將上表面朝下放置在培育平板(feeder plates)上(10個(gè)/平板)，22℃弱光下放置2天。將所述葉片節(jié)段，上表面朝上，放置在含頭孢氨噻肟500μg/ml和卡那霉素50μg/ml的加激素的煙草發(fā)芽培養(yǎng)基上，置于24℃ 16小時(shí)光/8小時(shí)暗規(guī)律的生長室。3周后，將愈傷節(jié)段轉(zhuǎn)移到裝有煙草發(fā)芽培養(yǎng)基的Magenta盆中。新芽一旦形成，立即切取，置于含頭孢氨噻肟500μg/ml和卡那霉素50μg/ml的但不加激素的煙草發(fā)芽培養(yǎng)基上，生根。然后將生根的植株栽培入50％珍珠巖/50％堆肥混合物，放置入繁殖器。1周后，從繁殖器中取出植株，然后栽培入5英寸的罐中。開花一旦開始，將紙包立即放置在花上防止交叉授粉。當(dāng)開花結(jié)束莢形成的時(shí)候，取走紙包，收獲成熟的莢。從干的莢收獲成熟的葉片和種子，儲(chǔ)存用于隨后的分析。
得到的轉(zhuǎn)基因煙草品系MH753共表達(dá)截短的橡膠HMGR和煙草SMT1。因此，正是這些過量積聚的中間體作為甾醇甲基氧化酶(C4SMOs)的底物，即，24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)、24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)和24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)(表5)。
按照上述方法用NH65再-轉(zhuǎn)化MH753葉盤，表達(dá)AtC4SMO，根據(jù)對(duì)潮霉素(25mg/L)的抗性篩選轉(zhuǎn)化體。通過PCR選取20個(gè)轉(zhuǎn)基因MH7xNH65植株。用實(shí)時(shí)PCR對(duì)選取的MH7xNH65品系中的tC4SMO轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析。如圖5所示，所分析的MH7xNH65品系全都表現(xiàn)AtC4SMO表達(dá)升高。表達(dá)最高的品系是MH7xNH6510，其中表達(dá)的AtC4SMO轉(zhuǎn)錄本比野生型對(duì)照的平均水平高17倍。
表5野生型煙草葉片和共表達(dá)tHMGR、SMT1及AtC4SMO的煙草葉片中環(huán)阿屯醇(CA)、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)、24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)、24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)以及總甾醇的水平
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立SR1品系和4個(gè)獨(dú)立的MH753品系計(jì)算得到的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，占干重的％。c，檢測下限＜0.001％干重。
葉片組織的分析對(duì)高表達(dá)C4SMO的兩個(gè)品系MH7xNH6510和MH7xNH6528的成熟葉片組織中的甾醇含量進(jìn)行分析。這些品系中的24MCA絕對(duì)水平分別為0.137-0.196％干重，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于MH753背景的24MCA水平(0.427％干重)(表5)。MH7xNH6510和28的CA24MCA之比明顯高于MH753背景(圖6A)。24Mloph水平明顯低于品系MH7xNH6510但不低于MH7xNH6528(表5)。但是，當(dāng)通過計(jì)算CA24Mloph比值將全部碳通量計(jì)算在內(nèi)時(shí)，這兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系都表現(xiàn)出比MH753背景更高的比值(圖6A)。品系MH7xNH6510和MH7xNH6528中的24Eloph絕對(duì)含量都明顯低于MH753背景(表5)。此外，這些轉(zhuǎn)基因植物的CA24Eloph比值都升高至MH753對(duì)照之上(圖6A)。
種子組織的分析與親本MH7品系相比，MH7xNH6510和MH7xNH6528品系的種子組織中24MCA和24Mloph的絕對(duì)水平無明顯變化(表6)。
表6野生型煙草葉片和共表達(dá)tHMGR、SMT1及AtC4SMO的煙草葉片中環(huán)阿屯醇(CA)、24-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇(24MCA)、24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Mloph)、24-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇(24Eloph)以及總甾醇的水平
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立的SR1品系和4個(gè)獨(dú)立的MH7XSJ35品系計(jì)算得到的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。b，占干重的％。
相反，這兩個(gè)品系中的24Eloph水平明顯低于MH7背景。廣泛地，CA與C4SMO底物之間的比例在種子和葉片中顯示相同模式(圖6A和B)。主要的差別在于MH7xNH6510和MH7xNH6518中CA24Mloph的比值明顯高于親本MH7。
綜合這些結(jié)果表明AtC4SMO可以24MCA和24Eloph向下游植物甾醇的轉(zhuǎn)化。另外，AtC4SMO還能催化葉片中24Mloph的轉(zhuǎn)化，但是不能催化種子中的轉(zhuǎn)化，這一點(diǎn)可以用底物特異性的不同或者下述事實(shí)得到解釋葉片中甾醇生物合成途徑中的全部碳通量高于種子。
共表達(dá)EMGR，SMT1和C4SMO的煙草種子中4，4-二甲基-，4-單甲基-和4-脫甲基甾醇的分布發(fā)生變化計(jì)算野生型(SR1)、NH7和兩個(gè)MH7xNH65品系(10和28)品系中含量最豐富的二-，單-和脫-甲基甾醇的相對(duì)分布。4，4-二甲基甾醇包括環(huán)阿屯醇和2 4-亞甲基環(huán)木菠蘿烷醇，4-單甲基甾醇包括24-亞甲基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇和2 4-亞乙基-4-甲基-7-烯膽甾烷醇，而4-脫甲基甾醇包括Δ7-燕麥甾醇、異巖藻甾醇，谷甾醇，豆甾醇，菜油甾醇和膽甾醇。如表7所示，MH7xNH65品系種子中4，4-二甲基甾醇的相對(duì)水平近似于MH7背景。但是，兩個(gè)MH7xNH65品系(10和28)中4-單甲基甾醇相對(duì)水平與背景(MH7)相比全部降低。另外，兩個(gè)MH7xNH65品系中的4-脫甲基甾醇相對(duì)水平都升高。此外，表達(dá)與甾醇譜之間的強(qiáng)相關(guān)表現(xiàn)在AtC4SMO表達(dá)最高的MH7xNH6510品系上，MH7xNH6510品系還表現(xiàn)出最低相對(duì)水平的4-單甲基甾醇和最高相對(duì)水平的4-脫甲基甾醇。
表7.MH7xNH65煙草種子中4，4-二-，4-單-和4-脫-甲基甾醇的分布
a，根據(jù)5個(gè)獨(dú)立的SR1品系和5個(gè)獨(dú)立的MH7XSJ35品系計(jì)算得到的平均偏差和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
權(quán)利要求
1.一種用于提高植物中4-脫甲基甾醇水平的方法，該方法包括加強(qiáng)4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的酶促脫甲基化。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述植物中4-單甲基甾醇和4，4-二甲基甾醇的水平降低。
3.權(quán)利要求1或2所述的方法，其中所述植物經(jīng)過修飾，與野生型植物相比提高了4-單甲基和/或4，4-二甲基甾醇的產(chǎn)量。
4.權(quán)利要求3所述的方法，其中所述植物具有比野生型植物高的HMGR活性。
5.權(quán)利要求3或4所述的方法，其中所述植物具有比野生型植物高的SMT1活性。
6.權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的4-脫甲基甾醇選自β谷甾醇、谷甾烷醇、豆甾醇、菜子甾醇、campestanol、異巖藻甾醇、菜油甾醇、表甾醇及其混合物。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其中通過提高植物中C4SMO活性來加強(qiáng)所述的酶促脫甲基化。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中通過提高C4SMO編碼基因的表達(dá)來提高植物中的C4SMO活性。
9.權(quán)利要求8所述的方法，其中所述基因?yàn)楫愒椿颉?br> 10.權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的C4SMO編碼基因源自擬南芥屬(Arabidopsis)。
11.權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述植物為煙草、加拿大雙低油菜-卡諾拉(canola)、向日葵、油菜或大豆。
12.一種與野生型植物相比4-脫甲基甾醇水平升高了的植物，其中4-脫甲基甾醇水平的升高是由權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的方法實(shí)現(xiàn)的。
13.權(quán)利要求12所述的植物，其中與野生型植物相比所述植物中4-脫甲基甾醇相對(duì)于4-單甲基和4，4-二甲基甾醇的比例升高。
14.一種轉(zhuǎn)化植物的方法，該方法包括(a)用重組DNA構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞得到轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞，該DNA構(gòu)建體中含有編碼具有C4SMO活性的多肽的DNA節(jié)段和驅(qū)動(dòng)所述多肽在所述植物細(xì)胞中表達(dá)的啟動(dòng)子；(b)使上述轉(zhuǎn)化后的植物細(xì)胞再生成轉(zhuǎn)基因植物；以及(c)選取與同種植物野生型株系相比4-脫甲基甾醇水平升高的轉(zhuǎn)基因植物。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中4-脫甲基甾醇水平的升高發(fā)生在植物的種子中。
16.權(quán)利要求14或15所述的方法，其中所述轉(zhuǎn)化后的植物是權(quán)利要求12或13所述的植物。
17.一種用于制備含4-脫甲基甾醇的油的方法，該方法包括從權(quán)利要求12或13所述植物中提取甾醇。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的油提取自植物的種子。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述的種子是通過培育該植物一代或多代然后收獲種子獲得的。
20.可從權(quán)利要求12或13所述植物獲得的植物物質(zhì)。
21.權(quán)利要求20中所述的植物物質(zhì)為種子。
22.一種產(chǎn)品，其中含有權(quán)利要求17-19中任一項(xiàng)所述方法制備的油。
23.權(quán)利要求22所述的產(chǎn)品，該產(chǎn)品為食品、食品加工中使用的油、潤滑油、燃料油或者制備碳?xì)浠衔锸褂玫脑稀?br> 24.表達(dá)C4SMO的基因在提高植物中甾醇水平中的用途。
25.權(quán)利要求22的產(chǎn)品在權(quán)利要求1-11中任意一項(xiàng)所述方法中的應(yīng)用。
全文摘要
一種用于提高植物中4－脫甲基甾醇水平的方法，該方法包括增強(qiáng)4－單甲基和4，4－二甲基甾醇的酶促脫甲基反應(yīng)。所述酶促脫甲基反應(yīng)可以通過使用表達(dá)C4甾醇甲基氧化酶(C4SMO)的基因?qū)崿F(xiàn)。
文檔編號(hào)A01H5/00GK1668748SQ03816741
公開日2005年9月14日 申請日期2003年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月16日
發(fā)明者N·霍姆伯格, R·薩福德 申請人:荷蘭聯(lián)合利華有限公司